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方法論記事

疾患特異的抗体の生成のための抗原性リポソーム

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DOI:

10.3791/58285

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2018年10月25日

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1Janssen R&D, 2Department of Microbiology and Immunology, University of North Carolina, 3UNC Food Allergy Initiative, University of North Carolina, 4Department of Pediatrics, University of North Carolina, 5Department of Chemistry, University of Alberta, 6Department of Molecular Medicine, Scripps Research Institute, 7Department of Medical Microbiology and Immunology, University of Alberta

* These authors contributed equally

この記事について

サマリー

説明は、抗原のリポソーム化ナノ粒子と刺激的な B 細胞活性化の in vitroとin vivoでの使用の準備です。一貫性と堅牢な抗体は、ピーナッツ アレルギーの新しいモデルの開発につながった。抗原性リポソームの生成のためのプロトコルは、異なる抗原と免疫モデルに拡張できます。

要約

抗体は病原体の広い配列に重要な防御免疫を提供します。ワクチン接種と同様どの病原性抗体反応をアレルギーと自己免疫疾患の開発の理解のための堅牢な抗体の生成に対する関心の高さが残っています。堅牢な抗原特異的抗体を生成する常に簡単ではありません。マウス モデルで多くの場合予防接種による抗体のレベルの変動の大きなにつながるアジュバントの複数のラウンドが必要です。一例は、マウス番号と補助の使用を最小限に抑えるより堅牢かつ再現性のあるモデルが有益であろうピーナッツ アレルギーのマウス ・ モデルであります。ここで紹介はピーナッツ アレルギーのアナフィラキシーの再現性の高いマウス モデルです。この新しいモデルは、2 つのキーファクターに依存している: (1) 抗原特異的脾細胞が素朴な受信者マウス、マウスを用いての多数にわたって抗原特異的メモリー B および T 細胞数の正規化にピーナッツ感作マウスから転送に対して(2) の受信者のマウスはその後 (Ara h 2) 主要なピーナッツ アレルゲンを表示するリポソームの粒子の形で強力な多価免疫で昇圧され.このモデルの主な利点はその再現性、最終的にアジュバントの複数の注射を受けた動物の数を最小限に抑えながら、それぞれの研究で使用される動物の数が減ります。これらの免疫原性リポソームのモジュラー アセンブリは、病原性の抗体を含む他のアレルギーや自己免疫モデルに比較的安易な適応性を提供します。

概要

食物アレルギーは、アメリカ合衆国の子供の 8% に影響を与えるし、過去の有病率の増加している 10 年1。ピーナッツ アレルギーは、子供の 1% に影響を与える、通常小さくなった2ではありません。いくつかの有望な臨床試験が進行中である経口免疫療法 (OIT)、舌下免疫療法 (スリット)、皮膚免疫療法 (EPIT) など、食物アレルギーの治療のため現在はありません FDA 承認の治療戦略ピーナッツ アレルギーの個人3,4,5,6,7,8脱感作。そのため、アレルギーの個人は厳密にアナフィラキシーを回避するためにアレルゲンを避ける必要があります。多くの質問は、感作のルート、食品アレルギー疾患発症のメカニズムを基になるまま。

マウスのモデルは、新しい免疫寛容と脱感作療法9,10、11,12の開発し同様、アレルギーのメカニズムを勉強のための貴重なツールです。これは特に、主要なピーナッツ アレルゲン (Ara h 2;Ah2) 人間にはまたいくつかの支配的なアレルゲン説明マウス モデル13,14。ピーナッツ アレルギーのマウス ・ モデル、感作性と耐性のメカニズムの研究に貴重な欠点は、ことができます変数やアジュバントの使用が必要です。強力な混合は、このようなモデルの本質的な可変性を最小限に抑える 1 つの方法でしょう。B 細胞は強く、多価抗原によって活性化、アレルゲンを表示する抗原のリポソームが良いオプションも効率的のプロパティを持つ、B 細胞の受容器 (BCR) を介して B 細胞を有効に可能性があります機能のため抗原提示によって非具体的に取り上げられているから T 細胞コンパートメントをプライミング細胞。

ここでは、安易なモジュラー方式リポソームのナノ粒子への蛋白質の抗原の結合のための詳しいプロトコルについて述べる。サロゲート抗原、抗 igm 抗体 Fab フラグメントを使用して、ことを示すこのような抗原のリポソームが刺激的な B 細胞の活性化にすることができますどのように強力な。Ah2 抗原を表示する抗原のリポソームは、授与の感度の新しいマウスモデルの開発に使用されました。このモデルでピーナッツ固有のメモリ B と T-細胞を含む検証のピーナッツ アレルギー マウスの脾細胞は素朴なコンジェニック マウスに転送されます。Ah2 に対する抗体を誘導するために受信者のマウスに共役 Ah2 とリポソームの注入によるメモリ抗体が誘導されます。水溶性 Ah2 で 1 つだけのブーストによって続かれて、Ah2 特異的抗体を生じ強いアナフィラキシー反応これらのマウスはその後 Ah2 に立ち向かっているとき。このアプローチは、望ましいピーナッツ アレルギー モデルと成果に向けられた抗原によって駆動される他のマウスモデルのユーティリティがあると示唆しているアレルギー反応を受けているマウスが均一な方法で応答、アジュバントを受け取っていません。アレルゲンになり自己抗原。

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プロトコル

蛋白質に結合脂質とリポソームに組み込むことの一般的な方法は、以前の作業15主に基づいています。以下の動物のすべての手続きは、チャペルヒル機関動物ケアおよび使用委員会 (IACUC)、ノースカロライナ大学で承認されています。ピーナッツ アレルギー モデルで使用されるすべてのマウスは、3 週齢から購入した BALB/cJ 女性です。アルバータ大学のアニマル ・ ケアおよび使用委員会 (ACUC) は、実験前のヴィヴォ分析少なくとも 6 週齢の c57bl/6 マウスからのマウス脾臓の使用を承認しました。

1. ペグインターフェロン脂質抗原蛋白質の共役

  1. 1,500 – 30,000 ダルトン (Da) の分画範囲で架橋デキストラン ゲルビーズの 3 g を 250 mL の真空フラスコに追加します。リン酸緩衝生理食塩水 (PBS) 60 mL を追加し、継続的に磁気攪拌棒で攪拌します。フラスコを密封し、1 時間以上撹拌プレートの脱ガス処理を開始するために真空を取り付けます。
  2. 1.0 cm × 30 cm ガラス クロマトグラフィー コラム閉鎖売り上げ高ストッパー付きで、洗浄する列に PBS を追加します。回転ストッパーを開き、列をドレインします。列に重複包まれたビーズのスラリーを追加次の洗濯。列は約 24 cm のビード高さに詰まってまで継続的にスラリーを追加します。
  3. 列が '頭' 約 4-5 cm の PBS の詰められたビードの上と、準備ができて次のステップがあります。
    1. 棚列の上の上の 1-2 フィートに達するし、列の下部にあるドロップされ、列の一番上に返されますループを作成する十分な長さにチューブの部分を測定することによって重力流れサイフォンを作成します。チューブ オープンの一方の側を残して、チューブの一方の端に回転ストッパーを追加します。PBS の場所列の上の棚の上の 500 mL ボトルに開いてチューブの端を置きます。
    2. 回転ストッパー付き端を取るし、10 mL 注射器を接続します。チューブ ラインの回転ストッパー バルブを開き、チューブを介して PBS を描きます。PBS はチューブを介しての方法の 4 分の 3 に達すると、すぐに注射器を削除し、列の上部に回転ストッパーを追加-液体は列に実行する必要があります。
      注: 列の上部にある左の PBS '頭' の量は、1 ~ 3 cm する必要があります。コラムを洗浄する最小限の量は、3 列のボリュームです。
  4. その分子量 (MW) に基づく脂質にリンクする蛋白質 (モル) の量を決定します。
    注: ヤギ抗マウス igm 抗体の Fab 断片 (自体、IgG) を使用ここでは B 細胞のポリクローナルの刺激のための普遍的な代理抗原として。したがって、ヤギ IgG の Fab フラグメントは約 48 Kda の MW をあり、1.3 mg の合計数量で市販されています。したがって、リンクされるタンパク質の量は、27.1 µmol です。
  5. 興味の蛋白質の消散係数を決定します。不明な場合は、280 タンパク質吸光度を測定分光光度計と除算のほくろの数によって A280値 1.4 の手順で計算を使用して nm。
    注: 絶滅 280 ヤギ IgG の Fab の co 効率的な nm は 64,600 M-1。
  6. トレースを確認するアミン含有量バッファーを削除、手順 1.1-1.3 で作成した列上で、蛋白質を脱塩し、1.5 mL 容マイクロ チューブ (分数あたり ~ 500 μ L) に蛋白を収集します。
    1. 列の上部に接続されている回転ストッパー弁を閉じて、列の上部を取り外します。ない場合既に開いて、列の下部に回転ストッパー バルブを開き、PBS の '頭' ビーズの上部に当たるまで待ちます。
    2. ゆっくりと興味の蛋白質の先頭に追加、ガラスを使用してビーズのパスツール ピペット、ビーズの上部への障害を最小限に抑えるように注意すること。
    3. タンパク質溶液の '頭' ビーズの上部に達している、1 mL の PBS をそっと追加を介してパスツール ピペット。3 回繰り返します。4-5 cm の頭を作成して手順を洗い流す 1.3 PBS を追加します。
      注: アミンを含むバッファーが存在しない場合は、この手順をスキップできます。
  7. A280 の値を測定することによりタンパク質を含む分数を決定し、タンパク質の約 90% 回復を与える分数をプールします。
    注: これは通常、タンパク質 1.5-2 倍を薄れてしまいます。プール後のタンパク質濃度を決定します。遠心濃縮器を使用して、必要に応じて、この手順に蛋白質を集中します。
  8. Heterobifunctional 架橋剤の 2.5 モル当量をタンパク質に追加します。
    1. 最初に、約 5 mg の染色 3-(2-pyridyldithio) の重量を量るプロピオン酸 (SPDP、MW = 314 g/mol) 微量遠心チューブに。溶解、SPDP、モルの蛋白質の集中そして 250 x 2.5 モル過剰反応に与える 100 x ソリューションを生成する乗算ボリュームを決定します。
      注: たとえば、タンパク質濃度が 50 μ M の場合 12.5 mM で SPDP のソリューションです。SPDP 5 mg、これはジメチルスルホキシド (DMSO) 1.27 mL に対応します。
  9. 1: 100 希釈で興味の蛋白質に SPDP を追加します。約 1 時間室温 (RT) で振動シェーカーに反応を配置します。
  10. Ph 5.5 1.1-1.3 で 100 mM 酢酸ナトリウム (NaOAc) をステップ超過 SPDP を削除し削減以降の手順で蛋白質の内因性二硫化 bond(s) を保護し、平衡、し、コラムを洗浄をまたはこの使用のため同じ列の作成バッファー。
  11. SPDP で 1 時間培養後では 100 mM NaOAc 列上で、蛋白質を脱塩します。溶離液として使用する 100 mM NaOAc (pH 5.5) を除いて 1.6 ステップとして同じ方法でこの手順を実行します。分数を収集 A280, を決定し、プールのトップ画。PBS でカラムを洗浄します。
  12. 高さ 2.5 M の DTT のソリューションを準備 (MW = 154 g/mol) 二重蒸留水 (ddH2O)。5-10 分のための蛋白質のプールされた小数部に 25 mM DTT を追加します。
  13. タンパク質の A280を測定し、これを消散係数で割ります。また、A343を決定します。タンパク質 (280) とリンカー (343) のモル濃度に基づくリンク比を計算します。
    Nanodrop 分光光度計を使用してメモ: A340 の自動調整をオフに。A343測定ピリジン 2 チオン グループの吸光度を表します (消散係数 = 7550 M-1) それは DTT による SPDP 架橋剤から削除されます。リンカーのモル比: 蛋白質の広い範囲で SDPD の 2.5 モルの過剰な反応を実行するとき、タンパク質比 1.2-1.5 は一般に達成されます。
  14. 前述の PBS で洗浄列上プールされた分数を実行します。分数を収集 A280, を決定し、プールのトップ画。分数をプール後の A280 によるタンパク質の濃度を決定します。
  15. DSPE ペグを準備 (2000)-マレイミド (1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-[methoxy(polyethylene glycol) 2000 年)-マレイミド。これは、10:1 のモル比でタンパク質に追加されます。必要な濃度を達成するために DSPE ペグ (2000)-マレイミドの 100 倍在庫を準備します。
    1. たとえば、タンパク質濃度は 10 μ M ステップ 1.14、10 mm (2000)-マレイミド DSPE ペグの在庫を準備します。DSPE PEG を慎重に比較検討 (2000)-マレイミド (MW = 3000 g/mol)、DMSO の適切な量を追加します。穏やかなボルテックスと sonicating の複数のラウンドに完全に溶解それを得る可能性があります。
  16. ステップ 1.14 から分数の合計量を決定し、丸底フラスコ (RBF) 小 (10-25 mL) にソリューションを慎重に転送します。100 の適切な量を追加 DSPE ペグ (2000) - 蛋白質のマレイミドを 1 倍、10 倍のモル超過、最終的な濃度を達成するために x。優しく、DMSO、完全に分散されていることを確認するソリューションを旋回します。
  17. 封印された RBF の窒素下で一晩反応を実行します。ゴムキャップを使用し、発煙のフードで配置します。
    1. 3 mL 注射器、真空に接続されているチューブの端に取り付けられた 20 G 針と中隔を穿刺によって雰囲気を削除し、3-5 秒のための真空をオンにします。
    2. 雰囲気を窒素に置き換えてください。塗りつぶしバルーンは窒素で半分にカット、3 mL の注射器に接続されている、20 G 針を取り付けます。窒素で丸底フラスコの中の雰囲気に合わせて中隔を穿刺します。雰囲気ともう一度窒素置換の除去を繰り返し、一晩添付窒素風船のままにします。
  18. (手順 1.1 1.3) あたり 1.0 cm × 50 cm ガラス クロマトグラフィー コラムの 4,000-150,000 da 分画範囲で別の架橋デキストラン ビーズ ゲルカラムを準備します。
  19. 次の日は、1.17 のステップ実行 (ステップ 1.6 で使用されている方法に従う) で作製した丸底フラスコからタンパク質を削除 (ステップ 1.18) からデキストラン架橋ゲル ビーズの列。
    注: 読み込む列にする合計金額は 2 mL 以上にする必要があります。大きい反応を使用した場合 2 つに分割の別々 の列で実行や大きい径列で実行します。
    1. 分数を収集、A280プール上の分数を決定および蛋白質の集中を定めます。脂質の存在は、測定値には影響を与えません。
  20. 使用する準備ができるまで 4 ° C で脂質と結合した蛋白質の最終的なプールされた分数を格納します。

2. リポソーム作製

  1. 脂質重量を量り: DSPE-PEG(2000) (1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-[methoxy(polyethylene glycol)-2000、MW = 2805.5 g/mol;コレステロール (3b-ヒドロキシ-5-cholestene、5-Cholesten-3b-オール), MW = 386.7 g/mol;DSPC (1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphocholine)、MW = 790.1 g/分子 dspc 濃度、コレステロールの 4 mg/mL の溶液とクロロホルムで DSPE-PEG(2000) の 2 mg/mL の溶液の 5 mg/mL の溶液を作成します。
  2. リポソームの脂質のモル比であることを確認: 57 DSPC %、38%、コレステロールおよび 5 %dspe-peg(2000),表 1に表される。
    注: それは一般に 0.01 – 0.1 の範囲リポソームにおける抗原の量を制御する重要な %。テーブル 1ヤギ抗マウス igm 抗体 Fab フラグメント ペグインターフェロン脂質にリンクの 0.1% を使用しています。考慮する 10 倍モルの DSPE ペグの過剰 (2000)-マレイミド 1.15 ペグインターフェロン脂質の総量が 5% を超えないことを確保するための手順でタンパク質に追加された重要です。
  3. 押出成形用脂質を作成するときは、最終的な脂質量 (µmol) を検討してください。モル脂質濃度 1.25 μ M 総脂質濃度リポソームの作成のための計算例については表 1を参照してください。
  4. 一緒に追加される各脂質の適切な量を計算すると、12 mL ホウケイ酸ガラス試験管にすべてを結合します。
  5. 慎重に、クロロホルムを吹き飛ばします。
    1. 慎重に窒素でチューブにクロロホルムを吹き飛ばす 1.17.1 の手順で用意して、針管、3 mL シリンジを使用します。片方の手でチューブを回転させながらソリューションの窒素の流れを優しく吹きます。しぶきまたは液体にこれを次の手順でソリューションに入るより難しいかも知れません、チューブ側を方法を最小限に抑えるように注意します。
  6. 各管に DMSO の 100 μ L を追加し、このソリューションを一夜凍乾します。非静的実験室で拭きます、ゴムのバンドで固定管の上部をカバーし、-80 ° C の凍結

3. リポソーム押出

  1. 脂質を含む 12 の mL の管に脂質結合蛋白質を含む PBS の 1 mL を追加します。約 30 のためのソリューションを超音波超音波処理水のお風呂で 1 分に s。各ラウンドの間 5 分以上に残り、3-4 回繰り返します。
  2. 製造元の指示に従って、押出機を準備します。
    1. パラフィン フィルム上を数滴 (各 10 μ L) PBS の場所、内部膜サポートするフィルターのサポートを追加します。ピンセットを使用して、フィルターのサポートの端を掴み、10 μ L のドロップでそれを浸しなさい。
    2. O リング内のフィルターを配置します。この双方に対して行います。ピンセットを使用して、端に 0.8 μ m フィルターをつかむと 10 μ L ドロップ ディップし、PBS の o リングの外側をコートします。0.8 μ m フィルターを o リングにそっと配置するフィルターがハング上内部膜サポートします。
  3. 押出機を予熱ホット プレート押出機暖房のブロックを配置します。低ホット プレートを切り替え、目的の温度に達するまでブロックを加熱押出機を許可します。蛋白質の集合の潜在的な問題を避けるためには、ブロック過去 37 ° C に加熱しないでください。
  4. 押出機に押し出して注射器の 1 つに熱量のサンプルをロードします。押出機注射器を押出機のもう一方の端に配置します。空の注射器のプランジャーがゼロに設定されていることを確認します。ポリカーボネート 0.8 μ m 膜脂質が押し出されて空の注射器を埋め尽くしています。泡膜を前後を渡すようにしてください。
  5. 暖房のブロックに完全に組み立てられた押出機を配置します。空の注射器に脂質で満たされた注射器のプランジャーを軽く押します。脂質濃度によってこれはを介してプッシュすることは困難になります。20 倍を繰り返します。
  6. 暖房のブロックから完全に組み立てられた押出機を削除します。ゆっくりと押出機から、注射器を削除、削除するときに漏れる可能性のある脂質を収集してください。きれいな瓶にリポソームを配置します。3.4-3.6 を使用して手順を繰り返しますポリカーボネート 0.2 μ m と 0.1 μ m の膜。
  7. メガ ダルトン (MDa) PBS で分離範囲 0.7 - 10 0.7 x 50 cm2架橋アガロース ビーズの列を作成します。リポソームを追加し、ステップ 1.6 のように実行します。リポソームを含む画分が 250-400 nm の範囲の光の透過率を減少しています。
  8. 4 ° C でリポソームを格納し、凍結しないでください。

4. カルシウム変化抗原リポソームによる B 細胞の活性をモニターするには

  1. 機関標準業務手順書に従って二酸化炭素 (CO2) またはイソフルレンの過剰摂取によるマウスを安楽死させます。頚部転位によってマウスの安楽死を確認します。
  2. 手術器具、70% エタノールを使用してマウスの死体を滅菌します。使用 10 cm、長さ 0.8 mm の先端は、胸郭から胸腔内を覆っている皮膚を分離するアイリス鉗子。10 cm 長い、まっすぐ解剖はさみを使用して、両側切開で遠位の切開を行います。
  3. 湾曲したアイリス鉗子と解剖はさみを使用して、腹腔内から脾臓を抽出します。脾臓を周囲の脂肪組織を削除し、RPMI1640 培地含む 1% 牛胎児血清 (FCS) とペニシリン-ストレプトマイシンでいっぱい 15 mL スチロール円錐管に配置します。
  4. 転送脾臓と 40 μ m の細胞ストレーナー メディア 50 mL の円錐管に装着できます。脾臓をつぶす 3 mL シリンジのプランジャーのゴムの端を使用して、優しく。メディアと 40 μ m の細胞ストレーナーを洗浄します。40 μ m の細胞こし器の脂肪だけが残っているまで、このプロセスを繰り返します。3-5 ml の細胞回復を増加するメディアのふるいをすすいでください。
  5. 300 x g室温に 5 分で細胞ホモジネートを遠心分離します。遠心分離の後上澄みを廃棄し、ペレットに 10 mL の 1 x 赤血球溶解バッファーを追加します。ピペットの上下に、常温では、2-3 分を残して、室温 5 分 300 × gで遠心分離
  6. 上澄みを廃棄し、10 mL の培地で赤血球細胞枯渇脾細胞を再懸濁します。診断または他の携帯デバイスのカウントを使用して総細胞数を決定します。前述のように遠心分離によって細胞をペレットします。
    注: 脾細胞の indo-1 ローディングに必要な理想的なの最終濃度は 10-20 x 106セル/mL、しかし細胞の低濃度が使用できます。
  7. 15 × 106セル/ml バッファー (RPMI1640 培 1% の FCS、10 mM 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic 酸 (HEPES) 1 mM 塩化マグネシウム (MgCl2) 1 mM エチレング リコール-ビス (カルシウム フラックスの脾細胞を再懸濁しますΒ-アミノエチル エーテル)-N, N, N', N'-四酸 (グリコールエーテルジアミン四酢酸) と 5% ペニシリン-ストレプトマイシン)。追加 1.5 μ m から 1 mM DMSO 原液、インド 1 反転チューブ数回をミックスします。光から保護し、37 ° C で 30 分間湯せんでセルを孵化させなさい。
  8. 次の 30 分インキュベーション ローディングバッファー カルシウム変化量 × 5 で追加します。300 × gで遠心する室温 7 分
  9. B 細胞のゲーティングの 1: 200 抗マウス CD5 PE と抗マウス 1: 200 B220-PE/Cy7 20 分、光から保護のための 4 ° C でバッファーの読み込みの 0.5 mL の細胞を染色します。
  10. 読み込みバッファーと 300 x gで 10-20 x 106セル/mL でカルシウム変化 (ハンクの平衡塩溶液 (HBSS) 1% の FCS、MgCl2 1 mM と 1 mM を含むバッファーを実行してルートを再懸濁しますセルで 7 分間遠心カルシウム変化で脾細胞を洗うカルシウム塩化 (CaCl2))。流れの cytometer で実行する準備ができるまで、光から保護されて氷の上保存します。
  11. 補償の無染色と単一染色コントロールとフローサイトメトリーをセットアップします。
    1. (図 2 a参照) ゲートを適切にセットアップするステンド グラスのセルを実行します。インド-1 (バイオレット)対インド 1 (青) プロットをセットアップ、信号を最大限に 45-60 ° の斜面で染色細胞を配置するインド 1 チャンネルの電圧調整: インド 1 バイオレットの雑音比: B 細胞刺激の比率で青い変更。
      注: 電圧が高すぎると、いないことを確認するよう細胞のかなりの割合 (> 5%) に対してプロットのトップ。
    2. プロットの左上部分 (バイオレット+ブルー-) をカプセル化する斜めのゲートを作成するよう刺激せず < 10% の細胞を増やす必要があります理想的には、ゲートには > 75% 刺激します。
  12. キャップ 5 mL の丸底ポリスチレン管 (蛍光活性化のセル (FACS) チューブを並べ替えです) に細胞の 0.5 mL を追加し、水浴中で 3-5 分の 37 ° C に細胞を温めます。再循環水バスに接続されている 37 ° C の water-jacketed 室に FACS 管を配置します。
    1. チューブを実行、流れの cytometer で water-jacket し、およそ 5,000-10,000 イベント/s では、データを格納することがなく買収を開始。少なくとも 10 のデータ集録および収集データを開始セルは、(15-30 s) を安定している、背景を確立する s。
    2. 10 s マークには、すぐに流れの cytometer からチューブを削除、追加刺激 (5-50 mM 2-20 mL の抗原性リポソーム), パルス渦とリターン流れの cytometer に FACS チューブ。データ集録と今回を介してストレージを維持し、3-5 分のデータを収集します。
  13. 動態機能で適切な分析ソフトウェアでデータを分析します。

5. ピーナッツ エキスの作成

  1. 1 M 塩化ナトリウム (NaCl) とリン酸緩衝生理食塩水 (PBS) の 1:5 (wt:vol) 比でピーナッツの粉を混合することによってピーナッツのタンパク質を抽出します。Ph 8.5 を維持しながら常温 2 時間電磁攪拌プレートに溶液を混合します。
  2. 4 ° C で 45 分間 3,000 × gで遠心分離ソリューションデカントし、フィルター-滅菌清順に 0.2 μ m フィルター続いて 0.4 μ m フィルターを通過。ビシンコニン酸 (BCA) 試金の標準としてウシ血清アルブミン (BSA) を使用して蛋白質の集中を決定します。
  3. 削減し、リチウム dodecyl 硫酸塩を還元剤と 10 分 70 ° C で熱の最大活動可能 8.4, の ph を含むバッファーに 50 mM ジチオトレイトール (DTT) とピーナッツの蛋白質のサンプルを変化させなさい。
  4. 最適な分離分子量勾配ゲルはあらかじめ標準的なステンド グラスを与えるように設計する Bis トリス 4-12% フルプレ ポリアクリルアミドゲルの変性ピーナツ蛋白質の 10 μ g を実行します。
  5. Disulfonated トリフェニル メタン系ゲルを染色し、ddH2ピーナッツの主要抗原 Ara h 1、2 および 3 のエキス製剤を知られている o ・識別ですすぐ。Ara h 1 63 kDa に、Ara h 2 が 17 と 19 kDa の 2 つのアイソ フォームとして表示されます、Ara h 3 37 kDa (酸性サブユニット) で表示されます。

6. ピーナッツ マウスの鋭敏化

  1. 超純水水 1 mL 中 1 mg コレラ毒素を再懸濁します。200 μ L 希釈ピーナッツ エキス含む 2 mg ピーナツ蛋白質と PBS で 10 μ g のコレラ毒素を準備します。
  2. 各 4-5 週齢 BalB/cJ 雌マウスに経口によるコレラ毒素 (2 mg ピーナツ蛋白質および 10 μ g コレラ毒素) を含むピーナッツ エキス 200 μ L を管理します。週に 1 回 3 週間 (すなわち日 0、7、14 の順) を繰り返します。
  3. 第 4 週の (すなわち、日 21) 各マウスを 300 μ L 希釈 (5 mg ピーナツ蛋白質と 10 μ g コレラ毒素含む) ピーナッツ エキスを介して経口を管理します。

7. 挑戦マウス ピーナッツ エキス

  1. 28 日に最終濃度 1 mg/mL の PBS でピーナッツ エキスを準備します。直腸温度計 (約 37.5-38.5 ° C) を用いた基準体温を測定します。腹腔注入を介してピーナッツ エキス 200 μ L (200 μ g) を管理します。
  2. 注射後 1 時間 15 分毎直腸温度計で体温を測定します。体温のディップでは、ピーナッツ アレルギーを示します。
    注: 低体温症は、マウスにおけるアナフィラキシーの特徴です。この挑戦はマウスがピーナッツにアレルギーがあることを示します。通常、鋭敏化プロトコルを受ける Balb/cJ マウスの 90% は少なくとも 2-3 ° C の温度低下によって特徴付けられるチャレンジ中にアレルギー反応を開発します。

8. アレルギー マウスと養子の転送からの脾細胞の分離

  1. 世間知らずでピーナッツ アレルギー マウスの脾細胞を分離します。
    1. 30 日 CO2ガス室での 3 L/分を投与することでナイーブと確認されたピーナッツ アレルギー マウスを安楽死させます。両側開胸下でマウスの安楽死を確認します。手術器具、70% エタノールを使用してマウスの死体を滅菌します。鉗子を使用して、胸郭から胸腔内を覆っている皮膚を区切ります。ストレートの解剖はさみを使用して、左と右の肋骨を壊す両側切開を行います。
    2. 鉗子と解剖はさみを使用して、腹腔内から脾臓を抽出します。ポリスチレンの 15 mL の円錐管、10 mL RPMI 1640 媒体でいっぱいに配置する前に脾臓を周囲の脂肪組織を削除します。
    3. 滅菌の層流フードの 35 mm ポリスチレン シャーレに脾臓とメディアを注ぐ。細胞分離の間に独立したペトリ皿とメディアにナイーブとアレルギー性脾細胞をしてください。脾臓を 3枚にカットしてシャーレに戻る滅菌鉗子と解剖はさみを使用します。
    4. 2 ガラス顕微鏡スライドの霜、大まかなエッジを使用して、優しく均質化 (RPMI) で脾臓の部分まで白い組織がスライドの間に残る。グループ間のスライドを変更します。
    5. シャーレから 50 mL の円錐管に装着 70 μ m 携帯こし器を通って細胞ホモジネートを転送します。1 mL 注射器からピストンとストレーナーを部分的に残っている脾臓を通過します。5 ml の細胞回復を最大限に RPMI のふるいをすすいでください。濾液をポリスチレン 15 mL の円錐管、遠心分離機 (450 × g、10 分、RT) に転送します。
    6. 上清を吸引し、2 mL 赤い血セル換散バッファー (10 mM Tris バッファー pH 7.2 で 0.83% 塩化アンモニウム) 細胞ペレットを再懸濁しますを追加します。ミックスし、RT で 2-3 分追加 10 mL PBS-2 %fbs と 300 × gで遠心するルートで 7 分間のインキュベート
    7. セルを洗浄して再び 12 mL で完全に任意の残留アンモニア塩化を削除して、ルートを再度中断セルで 7 分間 300 × gで遠心分離機 PBS-2 %fbs のペレットを RPMI 1640 培地 2 mL に。検定または自動血球計数装置を使用してセルをカウントします。
  2. 15 x 106アレルギーまたは素朴な脾細胞 (200 μ L) で上記のように抽出 27 G、5/8 インチ 1 mL インスリン注射器の針を使用して注入静脈経由で素朴な (unsensitized) マウスに尾静脈。

9. Ara h 2 抗原性リポソームとマウスの注入

  1. 2.5 mM 脂質 0.1% Ah2 Ah2 リポソームを準備します。蛋白質の集中の計算、Ah2 の消散係数は 15,000 M-1です。滅菌 PBS で 300 μ M にリポソームを希釈します。
  2. アレルギーの養子転送 (31 日) の翌日または素朴な脾細胞は静脈内注入 200 μ L の PBS または Ah2 抗原リポソーム (300 μ M) Ah2を介して手順で脾細胞を受け取った BALB/cJ マウスの尾静脈の 1.38 μ g の合計を含んでいます。8.2。

10. ブーストと Ara h 2 マウスの挑戦

  1. Ah2 リポソーム投与後 2 週間 45 日、マウスの顎下のジャンクションから 50-200 μ L の血液を収集するために 4 mm 動物ランセットを使用します。血清セパレーターがヘパリンなし管内血液を収集します。別で 6,000 x gで 15 分間遠心分離して血清抗原特異的抗体の測定後に収集された血清を使用します。
  2. 日に 46、2 週間リポソーム (ステップ 9.2) をマウスに注射後、200 μ L の PBS または可溶性 Ah2 (16を前述のように精製した) 200 μ g の i. p. 注入によるマウスを高めます。
  3. 60 日、マウスの顎下のジャンクションから 50-200 μ L の血液を収集し、前述のように血液を処理します。
  4. 200 μ l 300 μ g 投与した群で、マウスの各グループに挑戦 61 日水溶性 Ah2。直腸プローブとセクション 7 のように 15 分毎の体温を測定します。

11. Ara h 2 固有の定量化 IgE と IgG1 elisa 法による

  1. 96 ウェル酵素免疫測定法 (ELISA) をコート-100 μ L で互換性のあるプレート HSA-大日本印刷 (2, 4-ジニトロフェニルアミン ハプテン共役人間の血清アルブミン、20 μ G/ml) 標準曲線または Ah2 (5 μ g/mL) の手順で血清採取 10.1 と 10.3 の希釈で4 ° C 一晩または 37 ° C でコーティング バッファー (50 mM 炭酸炭酸バッファー、pH 9.6) > 1 h。
  2. 200 μ L で 3 回洗い PBS T (0.05% と PBS トゥイーン 20) 200 μ L の PBS T 含むと井戸をブロックし、37 ° C で 2 %bsa > 2 h。
  3. Ah2 特異 ige 抗体 ELISA 追加 50 μ L IgE 抗 DNP 基準 (2-0.002 μ g/mL、1:2 のシリアル希薄から調製した) またはマウス血清 (1:20 希釈) と 4 ° C で一晩インキュベートAh2 特異 IgG1 ELISA 追加 100 μ L 精製 IgG1 抗 DNP 基準 (2-0.002 μ g/mL、1:2 のシリアル希薄から調製した) マウスの血清サンプル (1: 500 希釈) や 4 ° C または 37 ° C で 1 h で一晩インキュベート
  4. 200 μ L で 3 回洗い PBS.Ah2 特異 ige 抗体 ELISA、100 μ L を追加羊抗マウス IgE (0.5 μ g/mL) と 37 ° C 1 時間インキュベートします。Ah2 特異 IgG1 ELISA、100 μ L を追加 HRP ヤギ抗マウス IgG1 (希釈 PBS-T-2 %bsa の 1:40,000)。37 ° C 1 時間インキュベートします。
  5. 200 μ L で 3 回洗い PBS.Ah2 特異的 IgE ELISA、追加 100 μ L ロバ ビオチン化抗羊 IgG (0.5 μ g/mL) と 45 分の 37 ° C で孵化させなさい。Ah2 特異 IgG1 ELISA 11.7 のステップに進みます。
  6. 200 μ L で 3 回洗い PBS.Ah2 特異 ige 抗体 ELISA、100 μ L 中立的充電アビジン西洋ワサビペルオキシダーゼ (例えばNeutrAvidin-HRP、0.3 μ G/ml) を追加し、37 ° C、30 分インキュベートします。
  7. 100 μ L 3, 3', 5, 5'-テトラメチルベンジジン (TMB) 基板を追加、10-15 分を孵化させなさいまたはまでサンプルに濃い青は、100 μ L TMB ワンストップソリューションを追加します。プレートが 450 nm。

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結果

DSPE-PEG(2000) の興味の蛋白質の共役は、削減の増加を示す非蛋白質と比較して分子量を実行して示すことができます。図 1 aは、ペグ-DSPE、変性タンパク質の 2-3 kDa bandshift を示していますを抗マウス IgM F(ab) フラグメント活用の代表的なゲルを示しています。蛋白質の約 50% は、予想される 1:1 の化学量論は、重鎖および軽鎖の heterodimer です Fab 断片に達成されたことを考えるを変更する表示されることに注意してください。図 1 bは、ペグ DSPE に Ah2 活用の代表的なゲルを示しています。B 細胞のカルシウムの変化を評価するために刺激抗原リポソームによる 2 つのことが重要な: (1) 機器の設定は、Ca2 +インド 1 蛍光比の違い (バイオレット) をバインドし、非連結フォーム (青) と (2) 適切な参照してくださいにチューニングされています。戦略をゲートは...

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ディスカッション

ここで説明する方法は、タンパク質脂質リポソーム型ナノ粒子上で、蛋白質の表示を可能にするための一般的なプロトコルです。非常に大きい複合体タンパク質の場合は、このプロトコルにユーティリティを制限されています。理想的な方法は、使用する直交化学リンク戦略を可能にするサイト固有タグの導入でしょう。Recombinantly 蛋白質を表現する、市販されているペグインターフェロン脂質の終わりに利用可能なサイト固有の戦略17、および機能グループの広い配列を使用してこれ可能することができます。したがって、このプロトコルは自然な源から分離されたタンパク質のリンクを目指している、化学・生化学的変換に必ずしも慣れていない科学者の広い範囲にアクセスできます。

強調する必要がありますカルシウム フラックス実験を実行しての重要な側面は、セルが、フローサイトメトリーでそれらを実行する前にアクティブ化する必要がありますないです。生殖不能の技術の使用が徹底しない場合これは活性化細胞 (インド 1 蛍光バイオレット チャネルでその排出に向かって傾斜) から高いバック グラ...

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開示事項

著者が明らかに何もありません。

謝辞

この研究は、国防総省 (W81XWH-16-1-0302 と W81XWH-16-1-0303) からの助成金によって支えられました。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
モデル 2110 フラクションコレクターBioRad7318122
CholestrolSigmaC8667Sigma グレード 99%
SPDPサーモフィッシャーサイエンティフィック21857
DSPCAvanti850365
DSPE-PEG 18:0Avanti880120
DSPE-PEG MaleimideAvanti 880126
エクストルーダーAvanti6100001 mL シリンジ ホルダー/ヒーティングブロック付き
フィルター 0.1 µmAvanti610005
フィルター 0.8 & マイクロ;mAvanti610009
10 mm フィルター サポートAvanti6100014
ガラス丸底フラスコシグマZ100633
ターンオーバー ストッパーサーモフィッシャーサイエンティフィックP-301398
チューブサーモフィッシャーサイエンティフィックP-198194
ルールロックサーモフィッシャーサイエンティフィックk4201634503
Sephadex G50 BeadsGE Life Sciences17004201
Sephadex G100 BeadsGE Life Sciences17006001
Heat Inactivated Fetal Calf SerumThermo Fisher Scientific10082147
HEPES (1 M)Thermo Fisher Scientific15630080
EGTASigmaE3889
ペニシリン-ストレプトマイシン (10,000 U/mL)Thermo Fisher Scientific15140122
1x RBC Lysis BufferThermo Fisher Scientific00-4333-57
Indo-1InvitrogenI1203
CD5-PEBioLegend100608
B220-PE-Cy7BioLegend103222
HBSSThermo Fisher Scientificカルシウムとマグネシウムを含まない
MgCl2SigmaM8266
CaCl2SigmaC4901
Fab抗マウスIgMJackson ImmunoResearch115-007-020
F(ab')2 JacksonImmunoResearch115-006-020
ピーナッツ粉ゴールデンピーナッツ株式会社521271 12% 脂肪 ライトロースト、50% タンパク質
動物給餌針ケイデンス サイエンス792022g x 1.5 インチ、1.25 mm - ストレート
マイクロプローブ温度計PhysitempBAT-12
マウス用直腸プローブPhysitempRet-3
コレラ毒素、ビブリオ コレラList Biological Laboratories, Inc.100Bアジド
フリーBCAタンパク質アッセイキットPierce23225
炭酸水素塩緩衝液シグマC3041TMB
ストップソリューションKPL50-85-06
SureBlue TMBマイクロウェルペルオキシダーゼ基質KPL5120-0077
96ウェルImmulon 4HBXプレートThermo Scientific3855
精製された可溶性 Ara h 2N/AN/A精製された Sen, et al., 2002, Journal of Immunology
HSA-DNPSigmaA-6661
Mouse IgE IgE AccurateChemicalBYA60251
Sheep anti-Mouse IgE結合部位PC284
ビオチン化ロバ 抗ヒツジ IgGAccurate ChemicalJNS065003
NeutrAvidin Protein, HRPThermoFisher Scientific31001
Mouse IgG1 anti-DNPAccurate ChemicalMADNP105
HRP Goat anti-mouse IgG1Southern Biotech1070-05
1 mL インスリンシリンジBD329412U-100 インスリン, 0.40 mm (27 G) x 16.0 mm (5/8")
Superfrost 顕微鏡スライドフィッシャーScientific12-550-1425 mm x 75 mm x 1.0 mm
ACK Lysing Buffergibco by Life TechnologiesA10492-01100 mL
RPMI 1640 MediumThermo Fisher Scientific11875093500 mL
Cell StrainerCorning35235070 μm ナイロン、ホワイト、滅菌済み、個別包装
NuPAGE 4-12% Bis-Tris Protein GelsInvitrogenNP0322BOX10 gels
NuPAGE LDS buffer, 4xInvitrogenNP0008250 mL
SeeBlue Plus2 染色済み標準InvitrogenLC5925500 µL
NuPAGE MES/SDSランニングバッファー、20xInvitrogenNP0002500 mL
GelCode Blue StainThermo Scientific24590500 mL
14170112

参考文献

  1. Gupta, R. S., et al. The prevalence, severity, and distribution of childhood food allergy in the United States. Pediatrics. 128 (1), e9-e17 (2011).
  2. Sicherer, S. H., Munoz-Furlong, A., Godbold, J. H., Sampson, H. A. US prevalence of self-reported peanut, tree nut, and sesame allergy: 11-year follow-up. Journal of Allergy and Clinical Immunology. 125 (6), 1322-1326 (2010).
  3. Kim, E. H., et al. Sublingual immunotherapy for peanut allergy: clinical and immunologic evidence of desensitization. Journal of Allergy Clinical Immunology. 127 (3), 640-646 (2011).
  4. Vickery, B. P., et al. Sustained unresponsiveness to peanut in subjects who have completed peanut oral immunotherapy. Journal of Allergy and Clinical Immunology. 133 (2), 468(2014).
  5. Jones, S. M., et al. Epicutaneous immunotherapy for the treatment of peanut allergy in children and young adults. Journal of Allergy and Clinical Immunology. 139 (4), 1242(2017).
  6. Varshney, P., et al. A randomized controlled study of peanut oral immunotherapy: clinical desensitization and modulation of the allergic response. Journal of Allergy Clinical Immunology. 127 (3), 654-660 (2011).
  7. Anagnostou, K., et al. Assessing the efficacy of oral immunotherapy for the desensitisation of peanut allergy in children (STOP II): a phase 2 randomised controlled trial. Lancet. 383 (9925), 1297-1304 (2014).
  8. Sampson, H. A., et al. Effect of Varying Doses of Epicutaneous Immunotherapy vs Placebo on Reaction to Peanut Protein Exposure Among Patients With Peanut Sensitivity: A Randomized Clinical Trial. The Journal of the American Medical Association. 318 (18), 1798-1809 (2017).
  9. Bednar, K. J., et al. Human CD22 Inhibits Murine B Cell Receptor Activation in a Human CD22 Transgenic Mouse Model. Journal Immunology. 199 (9), 3116-3128 (2017).
  10. Macauley, M. S., et al. Antigenic liposomes displaying CD22 ligands induce antigen-specific B cell apoptosis. Journal Clinical Investigation. 123 (7), 3074-3083 (2013).
  11. Orgel, K. A., et al. Exploiting CD22 on antigen-specific B cells to prevent allergy to the major peanut allergen Ara h 2. Journal Allergy Clinical Immunology. 139 (1), 366-369 (2017).
  12. Smarr, C. B., Hsu, C. L., Byrne, A. J., Miller, S. D., Bryce, P. J. Antigen-fixed leukocytes tolerize Th2 responses in mouse models of allergy. Journal of Immunology. 187 (10), 5090-5098 (2011).
  13. Kulis, M., et al. The 2S albumin allergens of Arachis hypogaea, Ara h 2 and Ara h 6, are the major elicitors of anaphylaxis and can effectively desensitize peanut-allergic mice. Clinical and Experimental Allergy. 42 (2), 326-336 (2012).
  14. Dang, T. D., et al. Increasing the accuracy of peanut allergy diagnosis by using Ara h 2. Journal of Allergy Clinical Immunology. 129 (4), 1056-1063 (2012).
  15. Loughrey, H. C., Choi, L. S., Cullis, P. R., Bally, M. B. Optimized procedures for the coupling of proteins to liposomes. Journal Immunological Methods. 132 (1), 25-35 (1990).
  16. Sen, M., et al. Protein structure plays a critical role in peanut allergen stability and may determine immunodominant IgE-binding epitopes. Journal of Immunology. 169 (2), 882-887 (2002).
  17. Krall, N., da Cruz, F. P., Boutureira, O., Bernardes, G. J. Site-selective protein-modification chemistry for basic biology and drug development. Nature Chemistry. 8 (2), 103-113 (2016).
  18. Jimenez-Saiz, R., et al. Lifelong memory responses perpetuate humoral TH2 immunity and anaphylaxis in food allergy. Journal Allergy and Clinical Immunology. 140 (6), 1604-1615 (2017).
  19. Moutsoglou, D. M., Dreskin, S. C. Prolonged Treatment of Peanut-Allergic Mice with Bortezomib Significantly Reduces Serum Anti-Peanut IgE but Does Not Affect Allergic Symptoms. International Archives of Allergy and Immunology. 170 (4), 257-261 (2016).
  20. LaMothe, R. A., et al. Tolerogenic Nanoparticles Induce Antigen-Specific Regulatory T Cells and Provide Therapeutic Efficacy and Transferrable Tolerance against Experimental Autoimmune Encephalomyelitis. Frontiers in Immunology. 9, 281(2018).
  21. Srivastava, K. D., et al. Investigation of peanut oral immunotherapy with CpG/peanut nanoparticles in a murine model of peanut allergy. J Allergy Clin Immunol. 138 (2), 536-543 (2016).
  22. Bellinghausen, I., Saloga, J. Analysis of allergic immune responses in humanized mice. Cellular Immunology. 308, 7-12 (2016).
  23. Pillai, S., Mattoo, H., Cariappa, A. B cells and autoimmunity. Curr Opin Immunol. 23 (6), 721-731 (2011).
  24. Mantegazza, R., Cordiglieri, C., Consonni, A., Baggi, F. Animal models of myasthenia gravis: utility and limitations. International Journal of General Medicine. 9, 53-64 (2016).
  25. Berman, P. W., Patrick, J. Experimental myasthenia gravis. A murine system. J Exp Med. 151 (1), 204-223 (1980).
  26. Berman, P. W., Patrick, J. Linkage between the frequency of muscular weakness and loci that regulate immune responsiveness in murine experimental myasthenia gravis. J Exp Med. 152 (3), 507-520 (1980).
  27. Derksen, V., Huizinga, T. W. J., van der Woude, D. The role of autoantibodies in the pathophysiology of rheumatoid arthritis. Seminars in Immunopathology. 39 (4), 437-446 (2017).

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