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方法論記事

疾患特異的抗体の生成のための抗原性リポソーム

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DOI:

10.3791/58285

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2018年10月25日

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* These authors contributed equally

この記事について

サマリー

説明は、抗原のリポソーム化ナノ粒子と刺激的な B 細胞活性化の in vitroとin vivoでの使用の準備です。一貫性と堅牢な抗体は、ピーナッツ アレルギーの新しいモデルの開発につながった。抗原性リポソームの生成のためのプロトコルは、異なる抗原と免疫モデルに拡張できます。

要約

抗体は病原体の広い配列に重要な防御免疫を提供します。ワクチン接種と同様どの病原性抗体反応をアレルギーと自己免疫疾患の開発の理解のための堅牢な抗体の生成に対する関心の高さが残っています。堅牢な抗原特異的抗体を生成する常に簡単ではありません。マウス モデルで多くの場合予防接種による抗体のレベルの変動の大きなにつながるアジュバントの複数のラウンドが必要です。一例は、マウス番号と補助の使用を最小限に抑えるより堅牢かつ再現性のあるモデルが有益であろうピーナッツ アレルギーのマウス ・ モデルであります。ここで紹介はピーナッツ アレルギーのアナフィラキシーの再現性の高いマウス モデルです。この新しいモデルは、2 つのキーファクターに依存している: (1) 抗原特異的脾細胞が素朴な受信者マウス、マウスを用いての多数にわたって抗原特異的メモリー B および T 細胞数の正規化にピーナッツ感作マウスから転送に対して(2) の受信者のマウスはその後 (Ara h 2) 主要なピーナッツ アレルゲンを表示するリポソームの粒子の形で強力な多価免疫で昇圧され.このモデルの主な利点はその再現性、最終的にアジュバントの複数の注射を受けた動物の数を最小限に抑えながら、それぞれの研究で使用される動物の数が減ります。これらの免疫原性リポソームのモジュラー アセンブリは、病原性の抗体を含む他のアレルギーや自己免疫モデルに比較的安易な適応性を提供します。

概要

食物アレルギーは、アメリカ合衆国の子供の 8% に影響を与えるし、過去の有病率の増加している 10 年1。ピーナッツ アレルギーは、子供の 1% に影響を与える、通常小さくなった2ではありません。いくつかの有望な臨床試験が進行中である経口免疫療法 (OIT)、舌下免疫療法 (スリット)、皮膚免疫療法 (EPIT) など、食物アレルギーの治療のため現在はありません FDA 承認の治療戦略ピーナッツ アレルギーの個人3,4,5,6,7,8脱感作。そのため、アレルギーの個人は厳密にアナフィラキシーを回避するためにアレルゲンを避ける必要があります。多くの質問は、感作のルート、食品アレルギー疾患発症のメカニズムを基になるまま。

マウスのモデルは、新しい免疫寛容と脱感作療法9,10

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プロトコル

蛋白質に結合脂質とリポソームに組み込むことの一般的な方法は、以前の作業15主に基づいています。以下の動物のすべての手続きは、チャペルヒル機関動物ケアおよび使用委員会 (IACUC)、ノースカロライナ大学で承認されています。ピーナッツ アレルギー モデルで使用されるすべてのマウスは、3 週齢から購入した BALB/cJ 女性です。アルバータ大学のアニマル ・ ケアおよび使用委員会 (ACUC) は、実験前のヴィヴォ分析少なくとも 6 週齢の c57bl/6 マウスからのマウス脾臓の使用を承認しました。

1. ペグインターフェロン脂質抗原蛋白質の共役

  1. 1,500 – 30,000 ダルトン (Da) の分画範囲で架橋デキストラン ゲルビーズの 3 g を 250 mL の真空フラスコに追加します。リン酸緩衝生理食塩水 (PBS) 60 mL を追加し、継続的に磁気攪拌棒で攪拌します。フラスコを密封し、1 時間以上撹拌プレートの脱ガス処理を開始するために真空を取り付けます。
  2. 1.0 cm × 30 cm ガラス クロマトグラフィー コラム閉鎖売り上げ高ストッパー付きで、洗浄する列に PBS を追加します。回転ストッパーを開き、列をドレインします。列に重複包まれたビーズのスラリーを追加次の洗濯。列は約 24 cm のビード高さに詰まってまで継続的にスラリーを追加します。
  3. ....

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結果

DSPE-PEG(2000) の興味の蛋白質の共役は、削減の増加を示す非蛋白質と比較して分子量を実行して示すことができます。図 1 aは、ペグ-DSPE、変性タンパク質の 2-3 kDa bandshift を示していますを抗マウス IgM F(ab) フラグメント活用の代表的なゲルを示しています。蛋白質の約 50% は、予想される 1:1 の化学量論は、重鎖および軽鎖の heterodimer です Fab 断片に達成されたことを考えるを変更する表示されることに注意してください。図 1 bは、ペグ DSPE に Ah2 活用の代表的なゲルを示しています。B 細胞のカルシウムの変化を評価するために刺激抗原リポソームによる 2 つのことが重要な: (1) 機器の設定は、Ca2 +インド 1 蛍光比の違い (バイオレット) をバインドし、非連結フォーム (青) と (2) 適切な参照してくださいにチューニングされています。戦略をゲートは.......

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ディスカッション

ここで説明する方法は、タンパク質脂質リポソーム型ナノ粒子上で、蛋白質の表示を可能にするための一般的なプロトコルです。非常に大きい複合体タンパク質の場合は、このプロトコルにユーティリティを制限されています。理想的な方法は、使用する直交化学リンク戦略を可能にするサイト固有タグの導入でしょう。Recombinantly 蛋白質を表現する、市販されているペグインターフェロン脂質の終わりに利用可能なサイト固有の戦略17、および機能グループの広い配列を使用してこれ可能することができます。したがって、このプロトコルは自然な源から分離されたタンパク質のリンクを目指している、化学・生化学的変換に必ずしも慣れていない科学者の広い範囲にアクセスできます。

強調する必要がありますカルシウム フラックス実験を実行しての重要な側面は、セルが、フローサイトメトリーでそれらを実行する前にアクティブ化する必要がありますないです。生殖不能の技術の使用が徹底しない場合これは活性化細胞 (インド 1 蛍光バイオレット チャネルでその排出に向かって傾斜) から高いバック グラ.......

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開示事項

著者が明らかに何もありません。

謝辞

この研究は、国防総省 (W81XWH-16-1-0302 と W81XWH-16-1-0303) からの助成金によって支えられました。

....

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
モデル 2110 フラクションコレクターBioRad7318122
CholestrolSigmaC8667Sigma グレード 99%
SPDPサーモフィッシャーサイエンティフィック21857
DSPCAvanti850365
DSPE-PEG 18:0Avanti880120
DSPE-PEG MaleimideAvanti 880126
エクストルーダーAvanti6100001 mL シリンジ ホルダー/ヒーティングブロック付き
フィルター 0.1 µmAvanti610005
フィルター 0.8 & マイクロ;mAvanti610009
10 mm フィルター サポートAvanti6100014
ガラス丸底フラスコシグマZ100633
ターンオーバー ストッパーサーモフィッシャーサイエンティフィックP-301398
チューブサーモフィッシャーサイエンティフィックP-198194
ルールロックサーモフィッシャーサイエンティフィックk4201634503
Sephadex G50 BeadsGE Life Sciences17004201
Sephadex G100 BeadsGE Life Sciences17006001
Heat Inactivated Fetal Calf SerumThermo Fisher Scientific10082147
HEPES (1 M)Thermo Fisher Scientific15630080
EGTASigmaE3889
ペニシリン-ストレプトマイシン (10,000 U/mL)Thermo Fisher Scientific15140122
1x RBC Lysis BufferThermo Fisher Scientific00-4333-57
Indo-1InvitrogenI1203
CD5-PEBioLegend100608
B220-PE-Cy7BioLegend103222
HBSSThermo Fisher Scientificカルシウムとマグネシウムを含まない
MgCl2SigmaM8266
CaCl2SigmaC4901
Fab抗マウスIgMJackson ImmunoResearch115-007-020
F(ab')2 JacksonImmunoResearch115-006-020
ピーナッツ粉ゴールデンピーナッツ株式会社521271 12% 脂肪 ライトロースト、50% タンパク質
動物給餌針ケイデンス サイエンス792022g x 1.5 インチ、1.25 mm - ストレート
マイクロプローブ温度計PhysitempBAT-12
マウス用直腸プローブPhysitempRet-3
コレラ毒素、ビブリオ コレラList Biological Laboratories, Inc.100Bアジド
フリーBCAタンパク質アッセイキットPierce23225
炭酸水素塩緩衝液シグマC3041TMB
ストップソリューションKPL50-85-06
SureBlue TMBマイクロウェルペルオキシダーゼ基質KPL5120-0077
96ウェルImmulon 4HBXプレートThermo Scientific3855
精製された可溶性 Ara h 2N/AN/A精製された Sen, et al., 2002, Journal of Immunology
HSA-DNPSigmaA-6661
Mouse IgE IgE AccurateChemicalBYA60251
Sheep anti-Mouse IgE結合部位PC284
ビオチン化ロバ 抗ヒツジ IgGAccurate ChemicalJNS065003
NeutrAvidin Protein, HRPThermoFisher Scientific31001
Mouse IgG1 anti-DNPAccurate ChemicalMADNP105
HRP Goat anti-mouse IgG1Southern Biotech1070-05
1 mL インスリンシリンジBD329412U-100 インスリン, 0.40 mm (27 G) x 16.0 mm (5/8")
Superfrost 顕微鏡スライドフィッシャーScientific12-550-1425 mm x 75 mm x 1.0 mm
ACK Lysing Buffergibco by Life TechnologiesA10492-01100 mL
RPMI 1640 MediumThermo Fisher Scientific11875093500 mL
Cell StrainerCorning35235070 μm ナイロン、ホワイト、滅菌済み、個別包装
NuPAGE 4-12% Bis-Tris Protein GelsInvitrogenNP0322BOX10 gels
NuPAGE LDS buffer, 4xInvitrogenNP0008250 mL
SeeBlue Plus2 染色済み標準InvitrogenLC5925500 µL
NuPAGE MES/SDSランニングバッファー、20xInvitrogenNP0002500 mL
GelCode Blue StainThermo Scientific24590500 mL
14170112

参考文献

  1. Gupta, R. S., et al. The prevalence, severity, and distribution of childhood food allergy in the United States. Pediatrics. 128 (1), e9-e17 (2011).
  2. Sicherer, S. H., Munoz-Furlong, A., Godbold, J. H., Sampson, H. A.

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