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方法論記事

精巣上体のタンパク質合成と分泌の解析

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DOI:

10.3791/58308

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2018年8月25日

 ,  ,  ,  , 
1Priority Research Centre for Reproductive Science, School of Environmental and Life Sciences, University of Newcastle, 2Hunter Medical Research Institute, 3Department of Physiology, Turku Center for Disease Modeling, Institute of Biomedicine, University of Turku, 4School of Biomedical Sciences and Pharmacy, Faculty of Health and Medicine, University of Newcastle

この記事について

サマリー

パラフィン埋め込まれたマウス精巣のセクションで蛋白質の検出と精巣細胞の不死化線 (mECap18) のためのプロトコルを説明するダイナミンの蛍光抗体法により局在を報告する.また精巣上体液やエアコン携帯メディアから分泌蛋白質の隔離のためのプロトコルについて述べる。

要約

哺乳類の精巣上体は後精巣の成熟と精子のストレージをサポートするためにすべての内分泌腺の最も複雑な管腔内流体のいずれかを生成します。このような複雑さは、粘膜上皮細胞の結合分泌・吸収活動のため発生します。ここでは、ダイナミン (そこ) mechanoenzymes; のモデル蛋白質家族に焦点を当てた精巣上体のタンパク質合成と分泌の解析手法について述べる大規模な低分子量 g 蛋白質双方向膜人身売買イベントを規制する可能性があります。精巣組織の蛋白質の表現の検討, 蛍光ラベリング パラフィン埋め込まれたセクションの標的タンパク質とを介してこれらのタンパク質の分布の後続の検出のための堅牢な方法論について説明します。蛍光顕微鏡検査。分離と小胞、成熟精子細胞と細胞間のコミュニケーションに参加する精巣の内腔に分泌する epididymosomes として知られているようなエキソソームの特性の最適化手法についても述べる。補完的なアプローチとして SV40 不死化マウス頭精巣上皮 (mECap18) の細胞ラインのターゲット蛋白質の蛍光検出について述べる。さらに、精巣の分泌活性の調節を探索するために適した体外モデルとして mECap18 細胞株の有用性について論じる。この目的のため培養 mECap18 細胞株およびその分泌タンパク質プロファイルに影響を与えることができる選択的薬理学的阻害療法の使用メンテナンス要件をについて説明します。後者は、SDS-PAGE および免疫ブロット経由で彼らの後の分析、トリクロロ酢酸/アセトンの沈殿物によって分泌された蛋白質の濃度条件培の収穫を使って容易に評価。我々 は、これらの結合方法が精子成熟および/またはストレージの機能的役割の決定へのプレリュードとして代わりとなる精巣上体蛋白質ターゲットの分析に適していると主張します。

概要

すべての哺乳類の種の精子を取得前方の進歩的な運動を表示して精巣上体、可能性があります男性の精巣余分なダクト システムの専門性の高い領域での長期にわたる降下中に卵子を受精する可能性7-14 日 (種) によって移動するを取る1。父系クロマチンの極端な凝縮と精巣内精子の分化に伴う細胞質の多数の放出のための後続の機能的成熟はの相互作用によってのみ駆動します。精巣微小環境。この環境は、ライニング精巣上体相馬の分泌・吸収活動によって作成され、ターンでは、セグメント バリエーション1の例外的なレベルが表示されます。したがって、タンパク質の合成と分泌の面で最もアクティブなセグメント、精巣上体 (すなわち、頭とコーパス)2の近位部にあります。このアクティビティ ミラー機能の能力の特徴を表示する最初の細胞と精子の機能のプロファイル (すなわち、進歩的な運動とするソーナの酸可溶性糖タンパク質に結合する機能) 次の。3頭精巣上体を通過。これらの機能的な属性は精子射精のための準備で静止状態で格納される前記遠位精巣上体セグメント (バーニャカウダ) に到達、最適なレベルに達する前に開発し続けます。形成とこの精子の貯蔵貯蔵所の維持は、馬尾の強い吸収活動4,5によって支配される粘膜上皮とも密接に結びついて。このような地域ごとの分業が哺乳類の種の大半の間で共有される精巣上体の特徴的な表示されます解剖学的違いは、報告された6,7、8をされていますが、私たち自身の9,10を含む日付を検討した.確かに、それ臨床的観点からは、精巣機能障害男性因子不妊11、こうしてこの専門組織の規制を理解することの重要性を強調の病因に重要な貢献を作ることが知られています。

したがって、精巣上体の生理学の私達の理解と精子の成熟とこの組織内のストレージの連続相を調節するメカニズムが完全に解決するに残っているは残念です。貢献の要因の間で精巣上体の研究の進歩に制限は、この組織の全体的な複雑さとその内腔の微小環境を規制制御メカニズムの知識です。解剖学的, 我々 は知っている、頭、コーパスと馬尾のセグメントの区別を超えて精巣上体 (図 1 a) いくつかのゾーンに細分されることができます、各隔壁12で区切られた、遺伝子/タンパク質の離散分布によって特徴付けられる式13,14,15,16,17,18。確かに、詳細な精巣上体における分節遺伝子発現の転写プロファイリング、に基づいてできるだけ多く 6 と 9 の精巣上体ゾーンはマウスおよびラットのモデルは、それぞれ19,20で報告されています。このような複雑さはおそらく精巣上体の相馬、偽重層上皮を構成する多数の異なったセルタイプ。 の組成を反映しています。管の長さに沿って豊富、配布および分泌・吸収活動に関してはそれぞれ異なります。したがって、主細胞は、これまでで、最も豊富な精巣細胞型を構成するすべての上皮細胞の 80% 以上。したがって、主細胞、精巣上体のタンパク質生合成と分泌5の大半を担当。対照的に、精巣上体の相馬内で 2 番目の最も豊富なセル型としてランク付けする、明細胞の人口主に内腔のコンポーネントの選択的吸収と5本の微小環境の酸性化に関与しています。男性ホルモンおよび精巣の起源の他の lumicrine の要因を出す管に沿って自分の位置によってこれらの精巣細胞型の差動制御の複雑さの別の層を追加するには。

このような複雑さの制限にもかかわらず重要な侵害は精巣機能のメカニズムの基礎を解決するのに行われ続けます。これらの研究のキーは、これらの初期調査の中から選択した個々 のタンパク質の詳細な分析とタンデムで精巣上体のプロテオームの幅広く在庫を確立する高度な質量分析戦略のアプリケーションをされています。このアプローチの例が、そこマウス モデル21で mechanoenzymes 族の私たちの最近の評価。そこで我々 の初期の関心は、エキソおよびエンドサイトーシス プロセスのカップリングにそのデュアル アクションによって支えられていた。そこ (DNM1 - DNM3) の 3 つの標準的なアイソ フォームがマウス精巣上体で高発現し、タンパク質の分泌と吸収21 における調節的役割を果たすために適切に配置されていることを示すことができたこれらの観察結果を踏まえ、.また、できた明確に各細胞と細胞内局在、に基づいてそこにアイソ フォームを区別するために示唆精巣上皮21内の冗長、アクティビティではなく、相補的な所有しています。

ここでは、採用希望この情報が精巣上体、代替タンパク質の特性でより広いアプリケーションを見つけるに貢献するためにマウスの精巣上体におけるそこ発現の研究のため実験方法について述べる、男性の生殖管のこの重要な要素の機能を理解します。具体的には、堅牢な蛍光ラベリング パラフィン精巣切片の標的タンパク質と蛍光抗体法によってこれらの蛋白質の分布の後続の検出手法の開発について述べる顕微鏡検査。我々 はさらに私たち最近最適化されたプロトコルの22の単離と解析 epididymosomes; を文書化します。小さなエキソソームのような小胞精巣の分泌プロファイルの重要な要素を構成する、精子成熟23を促進する上で重要な役割を保持するために表示されます。補完的なアプローチとしても述べる不死化マウス頭精巣上皮 (mECap18) の細胞ラインのターゲット蛋白質の蛍光検出および精巣上体の規制を探索するためのモデルとしてこのリソースの使用分泌活動体外。

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プロトコル

動物組織のコレクションを含むすべての実験手順は、ニューカッスル大学の動物のケアと倫理委員会によって承認されました。

1. 蛍光染色パラフィン埋め込まれた精巣上体セクション (図 1 および 2)

  1. CO2吸入 (スイス マウス、8 週間以上古い) 経由で成体の安楽死、直後に慎重に解剖 (外科はさみとピンセットを使用して) 精巣上体覆う結合組織や脂肪の無料、Bouin の定着剤に浸すソリューション (> 10 倍ボリューム/組織重量) 一晩固定用。
  2. 2 日間 2 × 変更 70% エタノールをティッシュを毎日洗うし、浸潤およびパラフィン ブロックを埋め込むのための準備として傾斜エタノール (70%、95%、100%) を脱水します。
  3. 4-6 μ m との免疫蛍光染色の準備のスライド マウントの厚さでパラフィン ブロックをセクションします。
  4. ヒューム フードの組織切片 (3 × 5 分たびに) を完全に没頭するスライドの瓶にキシレンの十分な量を追加することで精巣上体のパラフィン切片を dewax します。
  5. ティッシュ セクションを精製 H2O で希釈した傾斜のエタノール溶液に浸漬して水分補給 (100% エタノール 100% エタノール 90% エタノール エタノール 80%、70% のエタノールの 1 分 1 分 5 分 5 分 1 分、50% エタノール 1 分)。
  6. 十分なリン酸緩衝生理食塩水 (PBS) 全体の組織切片を完全に没頭すると 5 分のために一度スライド jar ファイル内のセクションを洗う (すべての後続洗浄手順に従う)。
  7. 適切な抗原検索ソリューションをデカント (すなわち。, 10 モル/L のクエン酸ナトリウム、50 ミリ モル/L トリス pH 10.5 または検出する抗原によって、代替抗原検索の解決法) スライド ラック、沸騰するまで電子レンジに。このソリューションにスライドの組織切片を対象 (表 1参照) 個々 の抗体のために最適化された熱による抗原検索条件。
    注意: は、スライド、抗原検索プロセス中に抗原検索ソリューションに完全に浸すことを確認します。
  8. 部屋の温度、電子レンジ、クールからスライド コンテナーを削除します。
  9. PBS でスライドをすすぎ、ティッシュ セクションまわりトレースする液体撥スライド マーカー ペンを使用します。
  10. (コンテナーの基地で湿らせたティッシュによって作成された)、加湿コンテナーにスライドを配置し、ブロック ソリューションを適用 (3 %bsa/PBS、以前フィルター 0.45 μ m のフィルターを通して) 37 ° C で 1 時間
  11. PBS で一度スライドをすすいでください。
  12. セクションをフィルター処理された 1% で実験的に最適化された濃度に希釈して適切な一次抗体とインキュベート BSA/PBS 一晩の 4 ° C で (アンチ DNM1、DNM2 と DNM3 の 1: 60 抗体; 抗 ATP6V1B1 抗体の 1: 100材料の表を参照してください抗体の詳細について)。
    注: を区別する特定非特異抗体の結合からそれ含める必要は厳しい負 (すなわち。、二次抗体のみ、一次抗体ペプチドを免疫に対して preabsorbed) とポジティブ コントロール24。
  13. 30 分間室温で配置することによって、スライドを rewarm します。
  14. 10 分間振動プラットホーム (60 rpm) の PBS でスライド 3 × を洗ってください。
  15. セクションを 1% で希釈した適切な二次抗体とインキュベート BSA/PBS (0.45 μ m フィルターで濾過) 1 h 37 ° C で (1: 400 すべての二次抗体の希釈は、抗体については、材料の表を参照)。
    注意: この手順以降から暗闇の中スライド コンテナーを保持します。デュアル ラベルは、二次抗体の互換性のある組み合わせを選択 (すなわち。、二次抗体が異なる種で提起されている必要があります)。
  16. 10 分間振動プラットホーム (60 rpm) の PBS でスライド 3 × を洗ってください。
  17. Propidium ヨウ化 (PI、7.48 μmol/L) または 4΄、6-diamidino-2-phenylindole (DAPI、4.37 μmol/L) 細胞核をラベルするために室温で 2 分間でセクションを counterstain します。
  18. 5 分間振動プラットホーム (60 rpm) のスライドを PBS で 2 回洗います。
  19. 10% Mowiol 4-88 は 0.2 mol/L トリス (pH 8.5) の 30% のグリセロールの解決の準備セクションをマウントおよび 2.5 %1, 4 - diazabicyclo-(2.2.2)-オクタン。
  20. 爪ニス coverslip をシールし、将来の観測のための 4 ° C でスライドを保存します。
    注意: 画像スライドのできるだけ早く実用的な蛍光の過剰な損失を避けるために準備の後を実行することをお勧めします。

2 分離、マウス精巣上体頭 (図 3) から Epididymosomes の

  1. CO2吸入 (スイス マウス生後 8 週間以上) 経由で成体の安楽死、直後に加温した PBS (37 ° c) 精巣組織の血液汚染を最小限に抑えることで、血管を灌流します。
    注意: 血漿には epididymosomes25に同じようなサイズであるエクソソームの多様な集団が含まれています。精巣組織から血中滞留性をアクセスことができます、最初のセグメントの検査を介して高度に血管精巣上体セグメント位置頭セグメントに近位 (すなわち、ゾーン図 1Aの 1)。
  2. 慎重に表面の任意の可能性を減らすために変更された結びつけること、ウィッテン、ウィッティンガムの媒体 (BWW; pH 7.4 では、300 ミリ モル/kg 水26,27の浸透圧) を覆う脂肪・結合組織、リンスの無料の精巣上体を解剖します。血液汚染。
  3. しみの余分なメディアを削除、精巣上体頭を解剖する精巣の組織 (すなわち。、ゾーン 2-5、図 1 a) と BWW 媒体を含んでいる新鮮なペトリ皿 (35 × 10 mm) に移転。培地の量が最終的な回復のために十分であることを確認します。
    注: 6 頭 epididymides のお勧めは、均等に分割し (手順 2.9 参照) 2 の事前に用意されたグラデーションの上に適用される ~ 900 μ L の回復を可能に 1.1 mL の培地を使用します。
  4. かみそりの刃で頭組織に小切開の数を作る。組織をミンチし、過度のゾル性細胞質の内容とサンプルの汚染を避けるためにしません。内容をリリースする 30 分の 37 ° C で軽度の動揺と組織を含むプレートを孵化させなさい。
  5. 細胞の残骸を削除する 70 μ m の膜を通して得られた懸濁液をフィルター処理します。
  6. 濾液を収集し、これを対象細胞残屑を除去するために速度を増加すると 4 ° C で連続遠心分離手順 (すなわち。、500 × g、2,000 × g、4,000 × g、8,000 × g、5 分ごと。17,000 × g 20 分と最後に 17,000 × gさらに 10 分間、または遠心分離後ペレットが形成されない)。
    警告: 最小限の血液汚染があることを確認する最初の 500 × g遠心分離のステップ後ペレットの色を評価するために重要です。このペレットにピンクの着色が表示されます任意のサンプルを破棄します。
  7. 0.25 mol/L ショ糖と 10 ミリ モル/L トリス (pH 7.5) の溶液で希釈 (60% (w/v) 水溶液 iodixanol から成る) 密度勾配媒体によって不連続 iodixanol の勾配 (層を構成する 40%、20%、10%、5%) を準備します。
  8. 450 μ L (図 3) の各分画の超遠心機チューブ (11 × 35 mm)、グラデーションを準備します。精巣上体液サンプルをロードする前にそれぞれの層の間のインターフェイスが正常に形成されることを確保するため、各分画のアプリケーション後、グラデーションを目視で確認します。ただし、利用日に各グラデーションの新鮮なを準備、精巣上体管腔液サンプルを読み込み前に 2 h まで 4 ° C で保存できます。
  9. 精巣上体管腔流体サスペンション (3 epididymides の頭からの材料を収集に対応する) の上に単一勾配の 450 μ L を慎重に追加します。
  10. 超遠心機 4 ° C、18 h で 160,000 × gでグラデーション。
    注意: この遠心分離が行われるので非常に高速で、すべての超遠心機チューブ ペア、正確にバランスの取れた。チューブの整合性を損なう可能性がある目に見える傷がないことを確認するを確認します。
  11. 12 の等しい分数 (それぞれ 185 μ L から成る) を慎重に取り外します最上部層から始まって、グラデーションの下の方へ進んでいます。該当する場合、各グラデーションから回復した同等の端数 (最大 2 つのグラデーション) をプールします。
    Epididymosomes 最も高い分数 9 1122で濃縮されマウスの注意:図 4との議論を参照してください。
  12. 回復および 9-11 の分数のプール後 100,000 × gで 3 h の 4 ° C (13 × 56 mm チューブ) ペレット、epididymosomes へのサンプルを 2 mL の PBS の超遠心機に希釈します。
    注意: epididymosome ペレットを参照してくださいすることは困難にすることができます、のでとローターに配置されます epididymosome ペレットの妊娠中の位置を示す管をマーク指摘チューブの向きを確認します。各管に十分な量が含まれていることを確認 (すなわち。、その総容量の 50% を超える) 管の崩壊のリスクを排除します。
  13. 慎重に吸引、epididymosome ペレットを乱すことがなく上澄みを廃棄します。
  14. Epididymosome 純度 (図 4) を評価します。
  15. 下流のアプリケーションに応じて必要な媒体に epididymosome ペレットを再懸濁します。例えば、BWW 媒体は通常精子あるいは SDS ページ経由で精巣上体のプロテオームの解像度のための準備の適切な換散バッファーと共同の孵化にかかわる実験使用されます。

3. 蛍光 mECap18 細胞の染色

  1. (セル文化フードで行われる) に滅菌 coverslips の準備
    1. 10 分の 70% エタノールに coverslips (12 × 12 mm) を浸漬し、エタノールのランプの上の高温乾燥で消毒します。
    2. 10 の coverslip のクールな s 12 ウェル プレートに転送する前に。
    3. 滅菌したポリ-L-リジン溶液、coverslip をカバーし、室温で 10 分間のために解決を適用します。
    4. ポリ-L-リジン液を捨て、洗浄滅菌 H2O coverslip または適切な媒体。
  2. 準備 mECap18 セル
    1. 2 × 105 mECap18 細胞、coverslips を含む 12 ウェル プレートの各ウェルの因数を通路します。
    2. MECap18 セル中程度 (1 %l-グルタミン、ピルビン酸ナトリウム 1%、1% ペニシリン/ストレプトマイシンと 50 μmol/L 5α-androstan-17β-ol-3-oneC-IIIN DMEM) 含む 10% ウシ胎仔血清 (FBS 雰囲気 5% の下で 37 ° C の定温器で) の細胞を培養します。CO2一晩。
    3. セルは、coverslip に従う、培地を除去、PBS で 2 回細胞をすすいでください。
    4. 全体 coverslip を浸し、15 分間室温でセルを修正する PBS で希釈した 4% パラホルムアルデヒド (PFA) の十分な量を追加します。
    5. PFA 液を捨て、PBS で 2 回、coverslips をすすいでください。
  3. 免疫蛍光染色
    1. 0.1% 浸漬によって mECap18 セルを permeabilize トリトン X-100 10 分 PBS で。
    2. PBS で coverslips をすすいでください。
    3. 3 %bsa を用いた mECap18 細胞をブロックし、精巣組織のセクションで説明したのと同じプロトコルを利用した細胞の反応を続行します。

4. エアコン細胞培養液からのタンパク質の単離

  1. 調節された細胞培養培地のコレクション
    1. 6 の 4 × 105 mECap18 細胞の通路因数も 10% を添加した mECap18 細胞用培地板 24 h の FBS。
    2. 残留 FBS および関連を削除する (FBS を使わず) mECap18 細胞用培地と mECap18 細胞を 3 回洗浄蛋白質の汚染物。
    3. 各ウェルに mECap18 細胞用培地 (FBS を使わず) 1.5 mL を追加し、37 ° C の定温器 5% 未満で 12 h の mECap18 細胞と孵化 CO2。
      注: このステップで mECap18 細胞は、実験デザインによると別のターゲット抗原を評価できます。
    4. 12 時間培養後細胞培地とすべての細胞の破片を削除する 10 分間 2,000 × gで遠心分離を収集します。
      注: 孵化の持続期間は実験デザイン/エンドポイント評価に従ってと応用治療細胞の耐性を考慮して変更することができます。最適な結果を達成していることを確認する特定の実験的レジメンに基づいて孵化のタイミングを調整することをお勧めします。
    5. 標準トリパン ブルー色素排除試験28のアプリケーションを介して mECap18 セル実行可能性を評価します。細胞生存率が減った死亡または瀕死の細胞から放出されたタンパク質によって導入されたバイアスを除去するために 90% 以下すべての材料を破棄します。
    6. 細胞用培地からの蛋白質を次のように分離または-80 ° C で媒体を維持
  2. (発煙のフードで行われる) に蛋白質の隔離
    1. 80% ボリューム調節細胞用培地培養 mECap18 細胞から放出されたタンパク質を沈殿させるに冷蔵 100% トリクロロ酢酸量の 20% を追加します。一晩で定数混合 4 ° C で孵化させなさい。
    2. 培養後、遠心分離によって沈殿したタンパク質をペレット (17, 000 × g, 10 min. の 4 ° C)。
      注意: 蛋白質中に分泌され、期待の限定数量により、ペレットがないは遠心分離後も容易に視覚化することが可能は。したがって、遠心分離前にチューブをオリエンテーションし、上澄みの削除中に妊娠中のペレットの場所を邪魔しないように世話を正しくすることが不可欠です。
    3. 上澄みを廃棄し、再遠心分離前に冷やしたアセトンで 2 回餌を洗浄 (17, 000 × g, 10 min. の 4 ° C)。
    4. 慎重に取り外し、ヒューム フード内の任意の残留アセトンを乾燥する前に上澄みを廃棄します。
    5. 完全な分泌タンパク質プロファイルおよび/または個々 のターゲット蛋白質を検出するエンドポイント分析に備えて適切な抽出バッファーで蛋白ペレットを再懸濁します (e.g。、SDS-PAGE、イムノブロット)。

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結果

図 1と図 2は、マウスの精巣上体頭にそこの局在を蛍光抗体法の代表的な結果を示します。3 そこアイソ フォームの各表示異なるローカライズ プロファイルを検討した.したがって、DNM1 は、(図 2 a) 初期セグメントと頭の精巣上体全体で精巣の細胞の比較的控えめなびまん性ラベルが特徴です。対照的に、DNM2 のアイソ フォームが最初に見つかった最初のセグメント内のセルの反対の基底部および根尖部の国境付近隣接する下流頭セグメント内のセルの核上性ドメインに再配置されている前に (すなわち、。ゾーン 2-5) (図 1B、C)。特に、しかし、徐々 にラベル DNM2 の強度は本質的にこれらの精巣上体セグメント21

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ディスカッション

これらの研究には、パラフィン包埋、セクショニングの標準プロトコルにさらされていたブアン固定精巣組織の使用が組み込まれています。ブアン固定液には、具体的かつ相補的な機能を持つ各コンポーネントにホルムアルデヒド、ピクリン酸と酢酸の混合物が装備されています。したがって、タンパク質の架橋結合を形成する第一級アミンと反応してホルムアルデヒドが、ピクリン酸はゆっくりと塩を形成する組織を浸透し、それ故の基本的な蛋白質と逆に、酢酸凝固は急速に組織を浸透しの凝固を引き起こす核酸。これらの複合プロパティは、形態学的詳細の保存に最適な固定液として Bouin を奇形し、その使用が副睾丸の文献で広く報告されます。ただし、Bouin のソリューションはターゲット抗原を隠す可能性があります傾向定着性誘起蛍光性とホルムアルデヒドによる架橋を含む、制限なしではありません。

背景の蛍光性の可能性を要する厳しいマイナス コントロールを使用、一次抗体、二次抗体の省略の省略を含む私たちの研究と、試薬があります、一次抗体の使用そこから生成された免疫になるペプチドに対する preabsorbed。このようなコントロールのアプ...

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開示事項

著者が明らかに何もありません。

謝辞

著者は、この作業をサポートするため国立保健医療研究評議会のオーストラリア プロジェクト助成金 APP1103176 を認識したいと思います。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
ダイナミン 1 抗体アブカムab108458<ストロング>宿主種: ウサギ、<ストロング>アイソタイプ: IgG、<ストロング>クラス: ポリクローナル
ダイナミン 2 抗体サンタクルスsc-6400<ストロング>宿主種: ヤギ、<ストロング>アイソタイプ: IgG、<ストロング>クラス: ポリクローナル
ダイナミン 3 抗体プロテインテック14737-1-AP宿主種: ウサギ、Isotype: IgG、Class: ポリクローナル
ATP6V1B1抗体Santa Cruzsc-21206宿主種: ヤギ、Isotype: IgG、Class: ポリクローナル
CD9抗体BDファーミンゲン553758<強い>宿主種:ラット、<強い>同型:IgG、<強い>クラス:モノクローナル
フロチリン-1抗体シグマF1180<強い>宿主種:ウサギ、<強い>同型:IgG、<強い>クラス: ポリクローナル
ALOX15抗体アブカムab80221宿主種:ウサギ、Isotype:IgG、Class:ポリクローナル
TUBB抗体Santa Cruzsc-5274宿主種:マウス、Isotype:IgG、Class: モノクローナル
PSMD7抗体Abcamab11436宿主種:ウサギ、Isotype:IgG、Class:ポリクローナル
抗ウサギ Alexa Fluor 488ThermoA11008宿主種:ヤギ、Isotype:IgG、Class: ポリクローナル
抗ヤギアレクサフロー488サーモA11055<強い>宿主種:ロバ、<強い>同型:IgG、<強い>クラス:ポリクローナル
抗ヤギアレクサフロー594モA11058<強い>宿主種:ロバ、<強い>同型: IgG、Class:ポリクローナル
抗ラットAlexa Fluor 594ThermoA11007宿主種:ヤギ、Isotype:IgG、Class:ポリクローナル
抗ウサギHRPミリポアDC03L宿主種:ヤギ、Isotype: IgG、Class:ポリクローナル
抗ラットHRPMilliporeDC01L宿主種:ヤギ、Isotype:IgG、Class:ポリクローナル
抗マウスHRPSanta Cruzsc-2005宿主種:ヤギ、Isotype: IgG、<ストロング>クラス:ポリクローナル
4'、6-ジアミジノ-2-フェニルインドール(DAPI)シグマD9564
ウ化プロピジウム(PI)シグマP4170
ビオール4-88バイオケム475904
ウシ血清アルブミン(BSA)シグマA7906
シ胎児血清(FBS)ボボゲンSFBS-F
DMEMサーモ11960-044
L-グルタミンサーモ25030-081
ニシリン/ストレプトマイシンサーモ15140-122
5&α;-アンドロスタン-17&ベータ;-オール-3-oneC-IIINシグマA8380
ビン酸ナトリウムサーモ11360-070
トリプシン-エチレンジアミン四酢酸酸性(EDTA)シグマT4049
パラホルムアルデヒド(PFA)EMS15710
キシレンVWRケミカルズ1330-20-7
タノールVWRケミカルズ64-17-5
リン酸塩緩衝生理食塩水(PBS)シグマP4417
エン酸ナトリウムシグマS1804
トリスアストラル0497-5KG
グリセロールシグマG5516
1、4-ジアザビシクロ-(2.2.2)-オクタンシグマD2522
-L-ギジンシグマP4832
トンX-100シグマ78787
パンブルーシグマT6146
クロロ酢酸シグマT9159
アセトンAjax FinechemA6-2.5 L GL
スクロースシグマS0389
ポリ (ビニルアルコール)シグマP8136
D-グルコースAjax ファインケム783-500G
OptiPrep 密度勾配 ミディアシグマD1556
蛍光顕微鏡ZeissZeiss Axio Imager A1
超遠心分離機ベックマン・コールターオプティマ Max-XP
微量遠心分離機エッペンドルフ5424R
インキュベーターヘラセル150
大型オービタルシェーカーRatekOM7
マイクロ波LGMS3840SR /00
ラボ用 pHメーターMeterLabPHM220
撥液スライドマーカー大同産業ミニ
カバースリップサーモ586
6ウェルプレートCELLSTAR657160
12ウェルプレートCELLSTAR665180
スライドマイクガラスSF41296PLMK
0.45 & マイクロ;m フィルターMillox-HVSLHV033RS
Kimwipes ダストフリーペーパーKIMTECH34155
超遠心チューブ (2.2 ml, 11 × 35 mm)BECKMAN COULTER347356
超遠心チューブ (3.2 ml, 13 × 56 mm)BECKMAN COULTER362305
Cell strainer 70 & micro;メートルFALCON352350
ペトリ皿35 × カム付き10ミリメートルSARSTED82.1135.500
スライドジャーTRAJAN#23 319 00
サーヨモカルウペピルエクポリトリトリトリム ナイロン

参考文献

  1. Zhou, W., De Iuliis, G. N., Dun, M. D., Nixon, B. Characteristics of the Epididymal Luminal Environment Responsible for Sperm Maturation and Storage. Frontiers in Endocrinology. 9, 59(2018).
  2. Dacheux, J. L., Gatti, J. L., Dacheux, F. Contribution of epididymal secretory proteins for spermatozoa maturation. Microscopy research and technique. 61 (1), 7-17 (2003).
  3. Aitken, R. J., et al. Proteomic changes in mammalian spermatozoa during epididymal maturation. Asian journal of andrology. 9 (4), 554-564 (2007).
  4. Hermo, L., Dworkin, J., Oko, R. Role of epithelial clear cells of the rat epididymis in the disposal of the contents of cytoplasmic droplets detached from spermatozoa. The American journal of anatomy. 183 (2), 107-124 (1988).
  5. Robaire, B., Hinton, B., Orgebin-Crist, M. The epididymis. 3, Knobil and Neill's Physiology of Reproduction. (2006).
  6. Nixon, B., et al. Formation and dissociation of sperm bundles in monotremes. Biology of Reproduction. 95 (4), (2016).
  7. Cleland, K. The structure and fuction of the Epididymis. 1. The histology of the Rat Epididymis. Australian Journal of Zoology. 5 (3), 223-246 (1957).
  8. Belleannée, C., et al. Identification of luminal and secreted proteins in bull epididymis. Journal of proteomics. 74 (1), 59-78 (2011).
  9. Turner, T. T. De Graaf's thread: the human epididymis. Journal of andrology. 29 (3), 237-250 (2008).
  10. Holland, M. K., Nixon, B. The specificity of epididymal secretory proteins. Journal of reproduction and fertility. 53, 197-210 (1998).
  11. Cooper, T. G., Hing-Heiyeung, C., Nashan, D., Nieschlag, E. Epididymal markers in human infertility. Journal of andrology. 9 (2), 91-101 (1988).
  12. Turner, T. T., Johnston, D. S., Jelinsky, S. A., Tomsig, J. L., Finger, J. N. Segment boundaries of the adult rat epididymis limit interstitial signaling by potential paracrine factors and segments lose differential gene expression after efferent duct ligation. Asian journal of andrology. 9 (4), 565-573 (2007).
  13. Garrett, S. H., Garrett, J. E., Douglass, J. In situ histochemical analysis of region-specific gene expression in the adult rat epididymis. Molecular reproduction and development. 30 (1), 1-17 (1991).
  14. Lareyre, J. J., et al. A 5-kilobase pair promoter fragment of the murine epididymal retinoic acid-binding protein gene drives the tissue-specific, cell-specific, and androgen-regulated expression of a foreign gene in the epididymis of transgenic mice. Journal of Biological Chemistry. 274 (12), 8282-8290 (1999).
  15. Cornwall, G. A., Orgebin-Crist, M. C., Hann, S. R. The CRES gene: a unique testis-regulated gene related to the cystatin family is highly restricted in its expression to the proximal region of the mouse epididymis. Molecular Endocrinology. 6 (10), 1653-1664 (1992).
  16. Nixon, B., Jones, R. C., Hansen, L. A., Holland, M. K. Rabbit epididymal secretory proteins. I. Characterization and hormonal regulation. Biology of Reproduction. 67 (1), 133-139 (2002).
  17. Nixon, B., Jones, R. C., Clarke, H. G., Holland, M. K. Rabbit epididymal secretory proteins. II. Immunolocalization and sperm association of REP38. Biology of Reproduction. 67 (1), 140-146 (2002).
  18. Nixon, B., Hardy, C. M., Jones, R. C., Andrews, J. B., Holland, M. K. Rabbit epididymal secretory proteins. III. Molecular cloning and characterization of the complementary DNA for REP38. Biology of Reproduction. 67 (1), 147-153 (2002).
  19. Jelinsky, S. A., et al. The rat epididymal transcriptome: comparison of segmental gene expression in the rat and mouse epididymides. Biology of Reproduction. 76 (4), 561-570 (2007).
  20. Johnston, D. S., et al. The Mouse Epididymal Transcriptome: Transcriptional Profiling of Segmental Gene Expression in the Epididymis 1. Biology of Reproduction. 73 (3), 404-413 (2005).
  21. Zhou, W., et al. Developmental expression of the dynamin family of mechanoenzymes in the mouse epididymis. Biology of Reproduction. 96 (1), 159-173 (2017).
  22. Reilly, J. N., et al. Characterisation of mouse epididymosomes reveals a complex profile of microRNAs and a potential mechanism for modification of the sperm epigenome. Scientific reports. 6, (2016).
  23. Sullivan, R. Epididymosomes: a heterogeneous population of microvesicles with multiple functions in sperm maturation and storage. Asian journal of andrology. 17 (5), 726-729 (2015).
  24. Reid, A. T., et al. Glycogen synthase kinase 3 regulates acrosomal exocytosis in mouse spermatozoa via dynamin phosphorylation. The FASEB Journal. 29 (7), 2872-2882 (2015).
  25. Danesh, A., et al. Exosomes from red blood cell units bind to monocytes and induce proinflammatory cytokines, boosting T-cell responses in vitro. Blood. 123 (5), 687-696 (2014).
  26. Anderson, A. L., et al. Assessment of microRNA expression in mouse epididymal epithelial cells and spermatozoa by next generation sequencing. Genomics data. 6, 208-211 (2015).
  27. Biggers, J., Whitten, W., Whittingham, D. The culture of mouse embryos in vitro. Methods in mammalian embryology. Daniels, J. , San Francisco: Freeman. 86-116 (1971).
  28. Strober, W. Trypan blue exclusion test of cell viability. Current protocols in immunology. , A3. B. 1-A3. B. 3 (2001).
  29. Elkjær, M. -L., et al. Immunolocalization of AQP9 in liver, epididymis, testis, spleen, and brain. Biochemical and biophysical research communications. 276 (3), 1118-1128 (2000).
  30. Gregory, M., Dufresne, J., Hermo, L., Cyr, D. G. Claudin-1 is not restricted to tight junctions in the rat epididymis. Endocrinology. 142 (2), 854-863 (2001).
  31. Isnard-Bagnis, C., et al. Detection of ClC-3 and ClC-5 in epididymal epithelium: immunofluorescence and RT-PCR after LCM. American Journal of Physiology-Cell Physiology. 284 (1), C220-C232 (2003).
  32. Rojek, A. M., et al. Defective glycerol metabolism in aquaporin 9 (AQP9) knockout mice. Proceedings of the National Academy of Sciences. 104 (9), 3609-3614 (2007).
  33. Shum, W. W., Da Silva, N., Brown, D., Breton, S. Regulation of luminal acidification in the male reproductive tract via cell-cell crosstalk. Journal of Experimental Biology. 212 (11), 1753-1761 (2009).
  34. Shum, W. W., Ruan, Y. C., Silva, N., Breton, S. Establishment of cell-cell cross talk in the epididymis: Control of luminal acidification. Journal of andrology. 32 (6), 576-586 (2011).
  35. Sipilä, P., Shariatmadari, R., Huhtaniemi, I. T., Poutanen, M. Immortalization of epididymal epithelium in transgenic mice expressing simian virus 40 T antigen: characterization of cell lines and regulation of the polyoma enhancer activator 3. Endocrinology. 145 (1), 437-446 (2004).
  36. Feugang, J. M., et al. Profiling of relaxin and its receptor proteins in boar reproductive tissues and spermatozoa. Reproductive Biology and Endocrinology. 13 (1), 46(2015).
  37. Gullberg, M., et al. Cytokine detection by antibody-based proximity ligation. Proceedings of the National Academy of Sciences. 101 (22), 8420-8424 (2004).
  38. Frenette, G., Girouard, J., Sullivan, R. Comparison between epididymosomes collected in the intraluminal compartment of the bovine caput and cauda epididymidis. Biology of Reproduction. 75 (6), 885-890 (2006).
  39. Fornes, M., Barbieri, A., Sosa, M., Bertini, F. First observations on enzymatic activity and protein content of vesicles separated from rat epididymal fluid. Andrologia. 23 (5), 347-351 (1991).
  40. Eickhoff, R., et al. Influence of macrophage migration inhibitory factor (MIF) on the zinc content and redox state of protein-bound sulphydryl groups in rat sperm: indications for a new role of MIF in sperm maturation. Molecular human reproduction. 10 (8), 605-611 (2004).
  41. Lötvall, J., et al. Minimal experimental requirements for definition of extracellular vesicles and their functions: a position statement from the International Society for Extracellular Vesicles. Journal of Extracellular Vesicles. 3, 26913(2014).
  42. Hutcheon, K., et al. Analysis of the small non-protein-coding RNA profile of mouse spermatozoa reveals specific enrichment of piRNAs within mature spermatozoa. RNA biology. 14 (12), 1776-1790 (2017).
  43. Bennett, P. Genetic basis of the spread of antibiotic resistance genes. Annali dell'Istituto superiore di sanita. 23 (4), (1987).
  44. Nixon, B., et al. Next generation sequencing analysis reveals segmental patterns of microRNA expression in mouse epididymal epithelial cells. PloS one. 10 (8), e0135605(2015).

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