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方法論記事

マウスにおける線込みおよび脊髄窓移植

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DOI:

10.3791/58330

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2019年10月23日

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1Department of Anatomy and Cell Biology, University of Illinois at Chicago College of Medicine, 2Medical Scientist Training Program, University of Illinois at Chicago College of Medicine

この記事について

サマリー

このプロトコルは、マウスの脊髄にガラス窓を移植し、生体内顕微鏡による視覚化を容易にすることを説明する。

要約

このプロトコルは、マウス脊髄の生体内イメージングのための脊髄ラミネクトミーおよびガラス窓移植のための方法を説明する。統合されたデジタル気化器はイソロルランの低流量で麻酔の安定した平面を達成するために利用される。単一の脊椎が取り除かれ、市販のカバーガラスが薄いアガロースのベッドの上に重ね合わされる。3Dプリントされたプラスチックバックプレートは、組織接着剤と歯科セメントを使用して隣接する椎体脊椎に貼り付けられます。安定化プラットフォームは、呼吸と心拍からモーションアーティファクトを減らすために使用されます。この急速でクランプフリーの方法は急性多光子蛍光顕微鏡検査に適している。代表的なデータは、eGFPを発現するトランスジェニックマウスにおける脊髄血管系の2光子顕微鏡検査に対して、この技術を適用するために含まれる:Claudin-5 - タイトな接合タンパク質である。

概要

蛍光タンパク質を発現するトランスジェニック動物モデルは、生体内顕微鏡と組み合わせることで、生物学および病態生理学に対処するための強力なプラットフォームを提供する。これらの技術を脊髄に適用するには、脊髄をイメージング用に準備するために特別なプロトコルが必要です。そのような戦略の1つは、ラミンクトミーと脊髄窓の移植を行う。顕微鏡検査のための理想的なラミネクトミープロトコルの主な特徴は、ネイティブ組織の構造と機能の保存、イメージング分野の安定性、迅速な処理時間、および結果の再現性を含みます。特に課題は、呼吸と心拍によって引き起こされる運動に対してイメージングフィールドを安定させることです。複数のex vivoとインビボ戦略は、これらの目標1、2、3、4、5を達成するために報告されています。生体内の方法のほとんどは、脊柱2、4の側面を締め付け、しばしば手術中の安定性のために堅い金属装置3、4を埋め込むことが続く。ダウンストリームイメージングアプリケーション。脊柱を締め付けると、血流を損なう可能性があり、血液脳関門(BBB)タンパク質リモデリングを誘発する可能性があります。

この方法の目的は、プロトコルの侵襲性を最小限に抑え、結果を改善しながら、生きているマウスの光学イメージングのために無傷の脊髄を利用できるようにすることです。我々は、まだ堅牢な機械的安定性を達成する最小限に侵襲的な楕円形のプラスチック3Dプリントバックプレートと組み合わせた単一のラミネクトミーとカバーガラスの注入手順を説明します。バックプレートは歯科セメントが付いている前部および後脊柱に直接付着する。バックプレートは金属の腕によって顕微鏡の段階に堅く付着するねじ穴が付いている横延長腕が装備されている。これは、無傷の前椎骨と後椎骨を顕微鏡段階に効果的に固定し、呼吸と心拍によって導入される運動アーティファクトに機械的抵抗を提供します。この方法は、胸部レベル12で単一椎骨のラミネクトミーのために最適化されており、生体内イメージング中の安定性のための代替戦略で利用されるクランプを省略する。この手順は、マウスあたり約30分を取って、迅速です。

このプロトコルは、BBBの疾患メカニズムを研究するために使用することができる。BBBは、内皮細胞、血管平滑筋、ペリサイト、および星状の足のプロセスからなる動的な微小血管系であり、中枢神経系(CNS)に高度に選択的な環境を提供します。代表的なデータは、増強された緑色蛍光タンパク質(eGFP):Claudin-5、BBBタイトジャンクションタンパク質を発現するように設計されたトランスジェニックマウスにおけるこのプロトコルの適用を示す。提供されるバックプレート印刷ファイルは、代替用途用にカスタマイズすることもできます。

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プロトコル

すべての実験は、イリノイ大学、シカゴ機関動物ケアおよび使用委員会のプロトコルに従います。これは端末の手順です。

1. 試薬の調製

  1. 人工脳脊髄液(aCSF)を125mM NaCl、5mM KCl、10mMグルコース、10mM HEPES、2mM MgCl 2·6H2 O、2mM CaCl2·2H2O in ddH2O.滅菌フィルターおよび凍結を含む。使用前に水浴中のaCSFを39°Cに温めます。
  2. 暖かい低融点アガロース (2%)65°Cに設定された水浴に完全に溶解するまでaCSFで。ラミネクトミーの間に、水浴で溶かしたアガロゼアリコートを39°Cに冷却し、ステップ5.2の生理学的温度に近い温度で準備できるようにします。
    注:アガロース溶液は、単一使用のアリコートで-20°Cで保存することができます。
  3. 静菌水中に無菌50mg/mLカルプロフェンを調剤する。4 °Cで保存します。
  4. 70%のエタノール、ddH2Oの3つの洗浄を備えたきれいなカバーグラス、ほこりのない容器に乾燥保存します。

2. バックプレート3Dプリンティング

  1. 3D CAD ソフトウェアを使用して、図 1に示す寸法に対してモデルを作成します。内部は、プリンタに対して底面で最も広い楕円であり、反対側の内面に内面を形成する小さな楕円にロフトカットでカットされています。ねじを受け入れる穴を持つ2つの突出アームは、バックプレート保持フォークに取り付けるために、横に伸びています。この 3D 構造から、三角パッチされた 3D メッシュ ファイル (。STL ファイル)。
    注:図 1B\u2012Dおよび補足ファイル 1 および 2を参照してください。
  2. 三角パッチされた 3D メッシュ ファイルを 3D プリンターにアップロードします。
  3. 0.4 mm のホットエンド ノズルと 0.2 mm の層の高さを使用してバックプレートを印刷します。ノズル温度205°C、ベッド温度45°C、印刷速度45mm/sを選択します。
  4. 構造の完全性のために結果の3Dプリントバックプレートを視覚的に評価します(図1E)。重大な構造故障(ルーメンが存在せず、壁が崩壊した)は、印刷欠陥を示す(図1F)。

3. 外科的準備

  1. 加熱パッドを予熱します。
  2. 化学ヒュームフードで作業中に、送達シリンジに負荷が発生します。配達用注射器をイソファランユニットに取り付けます。
  3. 8\u201212 週齢のマウスを選択します。動物の体重を量る。誘導室で2%イソファルランを用いて麻酔を誘導する。皮下に5mg/kgでカルプロフェンを注入する。
  4. 鼻コーンを位置付けし、麻酔の外科面の維持のために150 mL/minの流量で2%でイソファランを提供する(図2A\u2012E)。クリーンアップを容易にするために使い捨て吸収パッドで加熱パッドをラップします。
  5. 外科ステーションの暖房パッドの上に動物を置き、鼻コーンを取付けます。石油ゼリーで温度計を潤滑し、直腸に5mm挿入します。安定のために温度計のプローブを尾部にテープで留めます。マウスの目に眼科のチントを適用します。
  6. 水分補給を維持するために、実験終了まで30分ごとに皮下注射により200μLの乳酸リンガー溶液を塗布する。
  7. 70%のエタノールでドーサムをスプレーし、バリカンで毛皮を取り除き、ポビドネヨウ素でサイトをきれいにします。

4. ラミネクトミー

  1. 耳の棒の間に動物を配置します。これらは、鼻コーンに対してマウスの頭部位置を維持します。
  2. 動物がデジタル間のピンチ反射と安定した呼吸パターンの欠如によって評価されたと同じように深く麻酔されていることを確認する。
  3. #11ブレードを使用して、下部胸部/上部腰部の中間線に1.5cmのrostral-caudal切開を行います(図2)。鈍い歯の鉗子および/または手袋の指でそれをつかむかによって皮を分ける。鉗子を使用して、皮膚の下に残っている透明な結合組織を分離し、剥離します。表面的な筋肉が露出する必要があります。泡の外科槍でこれを置き換える。
  4. 発泡手術槍(またはキュレット)を使用して、標的椎骨の残りの、より深い筋肉を取り除きます(胸部12)。バックプレート用の座席を作成するには、胸部11の後部態様、および胸部13の前側から筋肉を離れてもクリアする。外科槍で穏やかな圧力を加えることによって出血を制御するか、灼砲で最低の脈拍を使用する。鉗子を使用して腱から離れて残りの筋肉を削除し続ける
  5. 筋肉を取り除いたら、鉗子で切って腱を慎重に取り外します。この手順が完了したら、コードを視覚化して操作するための十分なスペースが必要です。椎間空間の硬膜問題、半透明の層骨、骨の下の中央表面的な血管、および前々の放射動脈がはっきりと見えるようになりました。
  6. 暖かいaCSFで地域を濡らします。マイクロドリルを使用して、脊髄の長軸に平行なストレートストロークを使用して層骨を繰り返し薄くします(図2、図3)。必要に応じて、グライディングステージを利用して、人間工学的の快適性を高めるために外科プラットフォームを回転させます(例えば、右利きのオペレータは、掘削ステップのために外科プラットフォームを反時計回りに回転させることができます)。
    注:使用される滑空段階は固定された基盤版に対して±15 mmを滑る上のアルミニウム版から組み立てられる。
  7. 鉗子で表面的な脊椎プロセスをそっとつかみ、椎骨を持ち上げます。骨は容易に持ち上がるべきです。抵抗がある場合は、ドリルで骨の薄化を繰り返し、必要に応じて虹彩はさみを使用し、組織を損傷しないようにハサミ先端を上方に向けるように注意してください。
    注:硬膜をそのまま維持するためには、骨を引っ張らないことが不可欠です。
  8. #4鉗子を使用して、骨の破片を取り除きます。あらゆる出血を制御するために穏やかな安定した圧力を加えるために外科槍を使用しなさい。温かいaCSFで組織をすすいで下す。ティッシュが乾燥しないようにしてください。

5. カバーガラス注入

  1. 露出したコードに3mmのホウケイ酸塩カバーガラスを優しく塗布します。
  2. アガロースが39°Cに冷却されていることを確認します。小さなへらを使用して、カバーガラスの端に暖かい2%アガロース/aCSFを適用し、毛細血管アクションが表面の下にそれを描画できるようにします。
    注:39°C以下の温度では、アガロースがゲル化し始める場合があります。この場合は、水風呂または電子レンジを使用して再温めます。一部のオペレータは、最初にアガロースの1滴を適用し、上にカバーガラスを置くことを好みます。
  3. 胸部レベル11椎骨脊椎および胸部レベル13椎脊椎で無傷の隣接椎骨の露出した骨関節プロセスに組織接着剤を適用する。隣接する腱および横断プロセスの上に、ラミネクトミー部位の周りのリングに追加の組織接着剤を適用します。
    注:組織接着剤は、その後のステップで歯科セメントの適切な付着のために必要とされます。関節プロセスは、バックプレートが安定して休息できる自然な座席を形成します(図3)。関節プロセスへの接着は、愛着の最も強いポイントを形成します。
  4. 歯科用セメントと磁器混合トレイに加速器を混ぜます。小さなへらを利用して、歯科用セメントを組織接着層に移します。歯科用セメントを使用して、窓の上に中央にバックプレートを外科分野に付着させます。歯科用セメントが硬化するまで10分かかります。
    注:前後関節プロセスへのバックプレートのしっかりした接着は、インプラントの基本的な構造的安定性を提供します。
  5. バックプレートの内部ベースとバックプレートの下側を埋めるために追加の歯科セメントを使用してください: ティッシュインターフェイス。
    注:歯科用セメントの余分な適用は付着性を改善し、顕微鏡客観的浸漬液(生理食べ物)がバックプレートの底部から漏出するリスクを減らす。
  6. フォークされたバックプレートホルダーをウィンドウ上の適切な位置に進めます。バックプレートをネジでバックプレートホルダーに固定します。
    注: このプロトコルは、カスタムマシンのバックプレートホルダー(図2G\u2012H)を使用しました。
  7. バックプレートに生理生理を塗布し、漏れをテストします。流体が漏れた場合は、その面積を乾燥させ、より多くの歯科用セメントを塗布してください。

6. イメージング製剤

  1. 外科プラットホームの動物を光学テーブルに移す。
    注:私たちの外科プラットフォーム、バックプレートホルダー、およびイソファランノーズコーンホルダーは、連続的なイソファルラン麻酔(図2D、H)を適用しながら、1つのユニットとして外科用および2フォトンイメージングステーション間で輸送することができます。同様のユニットは、フォーク、ビーム、および商業ソースから入手可能な支持柱の支柱を保持から組み立てることができます(トールラボ)。生体内顕微鏡検査では、顕微鏡の目的と光学テーブルの間に少なくとも11インチのクリアランスが必要です。
  2. ステンレス鋼の土台のポストおよび反退屈した締め金で止めるフォークを使用して光学テーブルに外科プラットホームを接着する。
  3. バックプレートの井戸に新鮮な生理生理生理を適用します。水浸レンズを井戸に下ろします。
  4. 透過光またはエピ蛍光光灯を使用して、対象領域と焦点領域を識別します。レーザー走査モードに切り替え、組織6に存在する蛍光体に対する適切な2光子レーザー励起波長、ダイクロイックおよびバンドパスフィルタに従って生体内イメージングを実行する。

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結果

埋め込まれたガラス窓および重要な2光子顕微鏡はCNSタンパク質の動的変化を査定するための有用な用具を提供する。BBBの機能的完全性は、タイトジャンクションタンパク質7の発現、細胞内局在化、および回転率の影響を受ける。以前の研究では、タイトな接点タンパク質が定常状態8で迅速かつ動的なリモデリングを受けることが実証されています。現在記載されているラミネクトミーとガラス窓の調製は、蛍光タイトジャンクションタンパク質を有するTransgenic eGFP:Claudin-5マウス9で使用され、実験的自己免疫におけるBBBタイトジャンクションリモデリングを評価する。多発性硬化症の脳脊髄炎(EAE)モデル10.代表的なデータでは、eGFP:Claudin-5のイメージングは、920nm励起、40×赤外線目的(0.8 NA)、および緑色蛍光発光フィルタ(図...

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ディスカッション

ここで説明する方法は、ガラス窓を介してマウスにおける脊髄の安定的なイメージングを可能にする。この方法は、蛍光BBBタイトジャンクションタンパク質を発現するトランスジェニックeGFP:Claudin5+/-マウスにおけるBBBリモデリングを評価するために適用されているが、脊髄内の蛍光タンパク質または細胞の研究にも同様に適用できる。

ラミネクトミーと脊髄安定化のための複数の方法が開発されている。すべてのプロトコルは、目的の構造への視覚的なアクセスのためのイメージングとウィンドウの実装中に脊髄を安定させることに対処します。除去された椎骨の数および利用可能なプロトコルの侵襲性の程度はさまざまである(例えば、表面的な骨の表面に接着された成分は、本プロトコルのように、より深く埋め込まれるのと比較して)。ダバロスとアカソグロウ2は、脊髄を安定させるために、脊柱の両側に取り外し可能なクランプとマウスの尾部の基部に1つのクランプを使用して、ラミネクトミー法を開発した。動物を中断するこの革新的な戦略は、外科テーブルに対...

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開示事項

著者は何も開示していない。

謝辞

S.E.Lutzは、グラントKL2TR002002とイリノイ大学シカゴ医科大学のスタートアップファンドの下で、翻訳科学を進める国立センター、国立衛生研究所によってサポートされています。サイモン・アルフォードはRO1 MH084874によってサポートされています。コンテンツは著者の責任のみであり、必ずしもNIHの公式見解を表すものではありません。著者らは、コロンビア大学医療センターの神経学科のドリタン・アガリューに感謝しています:Claudin-5マウス、科学的な議論、および外科的プロトコルとイメージングアプリケーションの開発に関する洞察。著者らは、カリフォルニア大学アーバイン校の神経生物学と行動学科のSunil P. Gandhiに感謝し、立体装置と動物温度コントローラの最初のプロトタイプを設計し、外科的プロトコルの議論を行い、2光子顕微鏡検査の訓練。著者らはまた、外科立体顕微鏡のカスタマイズを支援するスティーブ・ピッケンズ(W.Nuhsbaum, Inc.)と、立体部品を加工するためのロン・リピンスキー(ホエール・マニュファクチャリング)に感謝しています。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
3DプリンターRaise3DPro2バックプレートの印刷用
PLA 3DプリンティングフィラメントインランドPLA+-175-Bブラックプラスチック 3Dプリンティング材料
3D CADソフトウェアDassault SystemesSolidworksソフトウェア3D形状の設計に使用する
ソフトウェア 3DプリンターソフトウェアRaise3DIdeamakerソフトウェアソフトウェア 3Dプリンターとのインターフェースに使用する
3Dプリントされた楕円形のバックプレートカスタム安定化イメージングフィールド
手術解剖顕微鏡ライカM205 Cカフュージョンオプティクス、プラナポ0.63x Mシリーズ対物レンズ、グライディングステージ搭載
顕微鏡カメラライカMC170手術野を視覚化するためのHDカラーカメラ
ライディングステージライカ10446301滑走ステージは2枚の金属板で構成されています。ベースプレートは固定されています。上部プレートはグリースを塗ったインターフェース上をスライドし、回転および直線運動を可能にします。
手術ステーションと安定化フォーククジラ製造カスタム椎弓切除術
SomnoSuite 低流量イソフルラン送達ユニットケント・サイエンティフィックSS-01デジタル気化器を内蔵した外科麻酔薬
ステンレス製 1.5インチ取り付けポストThorLabsP50/M2光子イメージング
用の光学テーブルへの手術ステーションの取り付け用1.5インチ取り付け用座ぐりクランプフォーク ポストThorLabsPF175手術ステーションを安定させるため、2光子イメージング用の光学テーブルに取り付けられ
ます 理想的な骨マイクロドリルハーバード装置72-6065椎弓切除術のための骨の薄化
ウォーターバスフィッシャーサイエンティフィック15-462-10温まる生理食塩水
焼灼銃FST18010-00マイナーな焼灼ブリード
加熱パッドベンチマークBF112221.9 "x 4.5"シリコンヒーター、20 "付きテフロンリード、10W、5V
Kタイプ熱結合直腸プローブPhysitempRET3マウス体温測定
ワセリンシグマ8009-03-8潤滑直腸プローブ
フィードバック調整サーマルコントローラーカスタムNA市販の代替品には、Physitemp TCATシリーズ
PVAサージカルアイスピアーズビーバービジターが含まれます国際40400-8血液を吸収する
電気トリマーWahl41590-0438マウスの毛皮
ブレード、#11FST14002-14手術器具
鉗子、#5FST11254-20手術器具
鉗子、#4FST14002-14手術器具
チタトニウム歯付き鉗子WPI555047FT手術器具
チタンアイリスはさみWPI555562S手術用具
Vetbond組織接着剤3M084-1469SB歯科用アクリルの組織表面の準備
セラミックミキシングトレイジャックリッチソン420716剤と歯科用アクリル剤の混合
ソジェット歯科用アクリルLang Dental1520BLK、1503BLKへのバックプレートの永久接着
小さな丸いカバーガラス、#1の厚さ、3ミリメートルドの装置64-0720光学窓
NaClッシャーサイエンティフィック7647-14-5aCSF
KClフィッシャーサイエンティフィック7447-40-7aCSF
グルコースッシャーサイエンティフィック50-99-7aCSF
HEPESシグマ7365-45-9aCSF
MgCl2&ミッドドット;6H2Oフィッシャーサイエンティフィック7791-18-6aCSF
CaCl2·2H2Oフィッシャーサイエンティフィック10035-04-8aCSF
カルプロフェンリマジルQM01AE91鎮痛剤
静菌水ヘンリー・シャイン2587428カルプロフェン用希釈剤
イソフルランヘンリー・シャイン11695-6776-2麻酔
乳酸リンガー溶液バクスター0338-0117-04ハイドレーションマウス
用アガロース高EEOシグマA9793ポイント34-37°C
科用潤滑軟膏アクワ涙液68788-0697膜乾燥を防ぐ
MOM Two-Photonサッター
ライトリミング外科促進オル組織ハーバーフィのフィゲル眼角顕微鏡

参考文献

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