方法論記事

初代肝細胞とクッパー細胞 B 型肝炎ウイルス感染の「肝臓-オン-チップ」文化

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DOI:

10.3791/58333

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2019年2月19日

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1Section of Virology, Department of Medicine, Imperial College

この記事について

サマリー

このプロトコルの目標は、B 型肝炎ウイルスと 3-D「肝臓-オン-チップ」感染実験を実行するステップ バイ ステップ ガイドを提供することです。

要約

にもかかわらず、実験感染したチンパンジーの慢性、唯一の 3 つのウイルスのゲノムを使用することが、生体内で、B 型肝炎ウイルス (HBV) の例外的な感染性の in vitro モデル最も必要でセルごとのウイルスのゲノムの数千に数百一過性感染を開始する順序。また、ひと肝細胞 (PHH) 静的 2D 文化は彼らの急速な脱分化による短期的な研究のみを許可します。ここでは、モノカルチャーまたは他の実質の肝臓居住者細胞と共培養系、PHH の 3 D の肝臓オンチップ文化について述べる。これらは生理的ホスト細胞応答と長期的な HBV 感染症の勉強に重要な改善を提供しています。薬剤の有効性の研究、毒性学的分析、および病因の捜査を促進する、に加えてこれらマイクロ培養装置は、HBV 感染した閉鎖を排除することを目的とした根治的治療法の評価を有効にします。円形 (ccc) DNA。これはメソッドが提示は PHH モノカルチャー ・ PHH/クッパー細胞共培養、精製の HBV の感染宿主反応の解析の設定について説明します。このメソッドは、特に HBV 感染、治療の組み合わせと病因の長期的影響の評価に適用されます。

概要

B 型肝炎ウイルスの研究開始感染1セルあたり HBV ゲノム コピーの数千に数百を必要とする文化システムの感受性に乏しいによって複雑にされています。また、ひと肝細胞は一般に非常に壊れやすい、従来の文化2の間に急速に脱分化します。これは、平坦で、ハード プラスチックの表面は肝臓とマイクロ流体循環の不在で文化の酸素化の一般的な欠如内で見つかった自然細胞環境を模倣しないという事実が主に原因です。コラーゲン被覆板に従来の静的な肝細胞培養は急速に脱分化し、HBV 感染3感受性を失います。ここでは、セットアップと拡張機能的な代謝能力によりコラーゲン被覆板従来 2次元静的 PHH 文化非常に有利であるが、3 D の肝臓オンチップ文化で育った PHH の感染について述べる促進少なくとも 40 日間4の長期的な文化。このシステムは、PHH は細胞に酸素と栄養を供給する培地で継続的に潅流されたコラーゲン被覆の足場にシードされます。マウス線維芽細胞または回転楕円体の 3 D の成長の複雑な共培養系が検証され、セル、3 D あたり 500 ゲノム相当 (GE) HBV の感染を使用して HBV 感染に敏感であるにもかかわらず PHH の代替文化システムに基づいて肝臓オンチップ文化 0.05 を受けやすい唯一の in vitro モデル システムのまま HBV GE セル4あたり。これまたにより支えられています HBV 感染を確立し高濃度のジメチルスルホキシド (DMSO) とポリエチレング リコール (PEG) を使用しての必要性これらの文化で 3 D の肝臓オンチップ培養システムの感染症のため不可欠であるであります。4します。 b 型肝炎ウイルスの主な特徴の一つ感染症は cccDNA プールは、de novo-生成粒子5,6の転写のテンプレートとして機能します。CccDNA は、従来肝細胞文化7,8で検出することができます、にもかかわらずかどうか cccDNA の規制とその除去を目指した治療上のアプローチは、要約で部分的に不明のままか完全に脱分化型肝細胞。私たちはその cccDNA 3 D チップ上の肝臓文化で形作られる機能的生理学的刺激に応答する、cccDNA ゲノム4転写マシナリーのアクセシビリティとの干渉によってターゲットすることができますを示しています。

HBV 感染患者、治療成功と同様、感染症のためのバイオ マーカーの同定を有効にすることで 3 D の肝臓オンチップ模倣 HBV 感染への応答をホストします。肝臓にチップ文化のユニークな機能の中では PHH とクッパー細胞4、星状細胞9、正弦波の肝など肝臓内の他の実質細胞の長期のホスト応答を評価する能力内皮細胞10,11。これは、複雑な 3次元微小環境におけるセル/セル相互作用を評価するユニークな機会を提供しています。

さらに、このプラットフォームの拡張の培養期間は従来肝細胞培養システムでは不可能な連続的な薬物治療の評価および HBV の持続性に与える影響を促進します。

このプロトコルを記述する方法 3 D 肝臓-オン-チップ PHH のモノカルチャーのためまたは PHH のクッパー細胞と共培養系の文化が生成されます。さらに、ホストとウイルスの応答の後の分析と同様、低感染多様性研究、浄化された HBV の生産について述べる。

プロトコル

1. アセンブリと板の平衡

  1. コンプレッサー、LiverChip プラットフォームに関連付けられている真空ポンプの両方がオンになってことを確認します。クラス II キャビネットでアセンブリおよび板の平衡を実行します。
  2. 無菌マイクロ プレート アセンブル プレート ベース間の無菌膜を配置し、よく含むトップ プレート (図 1 a) を追加します。
  3. 無菌膜スムーズにかかっているベース プレートの 2 つのピン不均一な膜配置妥協以来マイクロ流体循環を確認します。
  4. 滅菌プレート蓋を追加し、33 lb 締付け手順スパイラルを使用して自動化された精度トルクを利用したプレートの基部のネジを締めます。手動トルクを利用した 35 の lb すべてのネジが締まってを確認します。このステップでは、対称的にネジが締まっていることを確認 (図 1 a)。
  5. 肝細胞播種含むウィリアムズ E 中、主な肝細胞融解とメッキのサプリメント、5% ウシ胎児血清 (FBS)、およびプライミングする前に 37 ° C に 1 μ M のデキサメタゾンを prewarm します。
  6. 洗濯ドック内に配置し、各ウェルの貯水池側に媒体を播種肝細胞の 400 μ L を追加することによって完全に組み立てられたプレートを首相します。プレートを完全に洗浄ドックにスナップを確認します。
  7. 1 μ L/s で 3.5 分の上向きの方向でフローを開始します。マイクロ流体循環の正常な機能は、プレート (図 1 a) の側の赤いインジケーターによって確認できます。
  8. 培地プレートの細胞成長側にポンプでくまれる、流路の正しいアセンブリを確保する肝細胞播種培地の追加 1.2 mL を追加します。
  9. 慎重にプレートを 37 ° C、5% CO2で加湿インキュベーター内でドッキング ステーションに転送し、16 時間 (図 1 c) 1 μ L/秒の流量で上向きの方向にフローを開始します。
  10. 洗濯のドックにプレートを転送し、上下に軽くピペッティングによる井戸の中の気泡を除去します。
  11. 滅菌は、ろ紙、続いてセル添付ファイル足場とリテイニング リング、各ウェル滅菌鉗子を使用してラウンドを追加します。保持リング、足場を固定する (図 1 b) 滅菌プランジャーの各ウェル押し下げます。
  12. すべての培地を吸引し足場に優しく prewarmed 肝細胞播種培地の 400 μ L を追加し、1 μ L/s で 3.5 分間下向きの流れを開始します。
  13. すべての媒体はプレートの貯水池側からポンプ吸引。この手順は必要な流路に含まれる媒体を交換します。
  14. 肝細胞もあたり総容積を完了するドックにプレートを戻す前に各ウェル中のシードの 1.4 mL を追加します。井戸あたりにボリュームは今 1.6 mL (1.4 mL も、流路内 0.2 mL) です。

2. 解凍・ モノカルチャーの肝細胞の播種

  1. 肝細胞融解中、PHH のバイアルを製造者の指示に従って解凍前に 37 ° c 肝細胞播種培地を prewarm します。急激な温度変化を避けるためにこのステップの間に室温で遠心分離機を使用します。解凍とクラス II キャビネットで肝細胞のシードを実行します。
  2. 肝細胞播種培地 1 mL の細胞を再懸濁します、トリパン ブルー色素を使用してセルをカウントします。細胞の生存率が 90% 以上であることを確認します。
  3. 井戸に追加されるまでは、氷の上の細胞を保ちます。
  4. 洗濯のドックに平衡と完全に組み立てられたプレートを転送し、井戸からすべての培地を吸引します。
  5. 600,000 肝細胞を肝細胞播種培地 500 μ L のボリュームの各ウェルに追加します。
  6. 1 μ L/秒の流量で下方向のフローを開始し、肝細胞中のシードの 900 μ L を追加することによって 1.6 mL に井戸の総容積をもたらします。
  7. プレートを 37 ° C、5% CO2加湿インキュベーター内でドッキング ステーションに転送します。
  8. 8 h、8 h の 1 μ L/秒の流量で上向きの方向に流れ逆転に続く 1 μ L/秒の流量で下方向の流れを開始します。
  9. 洗濯のドックにプレートを転送し、井戸からすべての培地を吸引します。
  10. 3.5 分の 1 μ L/秒の流量で下方向に各、開始フローに肝細胞維持培地 (肝細胞維持サプリメントと 100 nM デキサメタゾン ウィリアムズ E 培) の 400 μ L を追加します。
  11. 貯水池からすべての培地を吸引し、肝細胞維持培地 (図 1 d) の 1.4 mL を追加します。
  12. 肝細胞維持培地ごとの 48 h でメディアを交換してください。井戸の中のすべての媒体を交換するには、新鮮な肝細胞維持培地添加前に、洗浄のステップを実行します。
  13. 洗浄のステップ プレートを洗濯ドックに転送、井戸からすべての培地を吸引し、メンテナンス中の 400 μ L を追加します。
  14. 井戸の貯水池側に表示されるすべての媒体で 3.5 分間吸引 1 μ L/秒で下方向の流れを開始します。
  15. 37 ° C、5% CO2肝細胞維持培地と、加湿のインキュベーター内の 1.4 mL を追加、ドッキング ステーションにプレートを転送、48 時間 (図 1 階) 1 μ L/秒の流量で上向きの方向にフローを開始します。
    注:肝細胞モノカルチャーの制御条件を確保するために、共培養系のコントロールとして使用培地の 2 番目のタイプが使用されます、プライマリ クッパー細胞と共培養系での使用のために特定であります。48 h (3 日目後播種) 肝細胞維持培地での培地に播種肝細胞を交換した後通常肝細胞維持培地培養維持培地 II、PHH と比較するときのモノカルチャーで特にに置き換えられます中のコンポーネントとして、PHH とクッパー細胞の共培養系は若干異なります。

3. 融解とクッパー細胞と肝細胞の共培養用シード

  1. 結果の正確な比較を保障するために常に PHH モノカルチャーに PHH/クッパー細胞共培養系を比較します。
  2. PHH とクッパー細胞の共培養系融解 1 バイアルのクッパー細胞高度なダルベッコ改変イーグル培地 (AdDMEM) デキサメタゾンが主な肝細胞融解と補われ、めっきサプリメント (共播種培地) によると仕入先の指示。解凍とクッパー細胞と肝細胞クラス II キャビネットでのシードを実行します。
  3. 播種培地培養 1 mL の細胞を再懸濁し、トリパン ブルー色素を使用してセルをカウントします。細胞の生存率が 90% 以上であることを確認します。
  4. 細胞が細胞接着を避けるために井戸にそれらを追加する前に氷の上を維持します。
  5. 手順 2.1 – 2.3 ひと肝細胞の融解の指示に従います。
  6. 洗濯のドックに平衡と完全に組み立てられたプレートを転送し、井戸からすべての培地を吸引します。
  7. 60,000 クッパー細胞および 600,000 肝細胞を培養培地に播種 250 μ の総量もに追加します。
  8. 1 μ L/秒の流量で下方向のフローを開始し、各ウェル中のシード培養 900 μ L を追加します。
  9. 37 ° C、5% CO2加湿インキュベーター内でドッキング ステーションにプレートを転送します。
  10. 8 h、8 h の 1 μ L/秒の流量で上向きの方向に流れ逆転に続く 1 μ L/秒の流量で下方向の流れを開始します。
  11. 洗濯のドックにプレートを転送し、井戸からすべての培地を吸引します。
  12. 共培養用培地の 400 μ L を追加私は 3.5 分の 1 μ L/秒の流量で下方向に各、開始フローに (肝細胞維持サプリメントで補ったが、デキサメタゾン AdDMEM)。
  13. 貯水池側からすべての培地を吸引し、共培養用培地の 1.4 mL を追加各ウェルに。
  14. プレートを 37 ° C、5% CO2加湿インキュベーター内でドッキング ステーションに転送、48 h の 1 μ L/秒の流量で上向きの方向にフローを開始します。
  15. 洗濯のドックにプレートを転送し、井戸からすべての培地を吸引します。共培養用培地 II (100 nM ヒドロコルチゾンと肝細胞維持サプリメントで補ったが、デキサメタゾン ウィリアムズ電子媒体) の 400 μ L を追加し、3.5 分の 1 μ L/秒で下方向の流れを開始します。
  16. 井戸の貯水池側に表示されるすべての媒体を吸い出しなさい。
  17. 共培養用培地 II の 1.4 mL を追加し、37 ° C、5% CO2加湿インキュベーター内でドッキング ステーションにプレートを転送します。
  18. 48 時間 (図 1e) 1 μ L/秒の流量で上向きの方向にフローを開始します。
  19. 媒体ごとの 48 時間を共培養用培地 II に置き換えます。井戸の中のすべての媒体を交換するには、新鮮な媒体の付加の前に、の洗浄のステップを実行します。
  20. 洗う、洗濯ドック プレートに転送、井戸からすべての培地を吸引し培養培地 II の 400 μ L を追加します。
  21. 井戸の貯水池側に表示されるすべての媒体で 3.5 分間吸引 1 μ L/秒で下方向の流れを開始します。
  22. 共培養用培地 II 1.4 mL を加えるとプレートを 37 ° C、5% CO2、加湿インキュベーター内でドッキング ステーションに転送し、48 時間 (図 1 階) 1 μ L/秒の流量で上向きの方向に流れを開始します。

4. 感染症研究感染性の肝炎ウイルスの生産

  1. 封じ込めレベル III ラボでプロトコルのこのセクションを実行します。播種、媒体変更、媒体のコレクション、およびクラス II キャビネットでウイルス濃度を行います。
  2. 完全な DMEM/F12 (10 %fbs、ペニシリン/steptomycin、非必須アミノ酸、500 μ g/mL、G418、1 μ g/mL テトラサイクリン) 120 mL でコラーゲン被覆 T1000 5 層フラスコで b 型肝炎ウイルス産生細胞 (例えば、HepDE19、HepAD38) を文化 90% の confluency に到達するまで。
  3. 誘導培地 (テトラサイクリンなし完全な DMEM) に媒体を変更すると、b 型肝炎ウイルスの生産を誘発します。
  4. テトラサイクリンの 12 日後撤退すべて 48 時間完全な中量を収集し、4 ° C で保存
  5. 0.45 μ m ボトル上部フィルターを通して収集された媒体をフィルターします。
  6. 4%/w の最終濃度を収集中にリン酸緩衝生理食塩水 (PBS) での滅菌をペグ 8000 を追加、8 x-10 x の反転によってミックス, PEG 沈殿ウイルスを収集し再懸濁します 4 ° C で 1 時間 10,000 x gで 16 h. 遠心分離機のための 4 ° C で10% を含む PBS でペレット FBS。
  7. 20% ショ糖クッションの上に層し、すべて収穫時点から PEG 沈殿ウイルスを組み合わせます。SW28 ローターを使用しての 4 ° C で 16 時間 140,000 × gで遠心分離機します。
  8. 上清を吸引し、10 %fbs、因数と補われる PBS でペレットを再懸濁します-80 ° C で保存
  9. HBV DNA qPCR (手順 6) による HBV DNA コピー数の培養上清中に存在を決定します。

5. b 型肝炎ウイルスと 3 D の文化の感染

  1. クラス II キャビネット封じ込めのレベル III のラボ内で感染症を実行します。
  2. モノカルチャーまたは共培養系、播種後 3 日は室温で b 型肝炎ウイルスを含む因数の必要な数を解凍し、それぞれ肝細胞維持培地や培養維持培地 II 好評につき、1.8 mL に必要なウイルス量を希釈します。
  3. この 1.8 mL 希釈ウイルスは洗浄のステップ (400 μ L) とよく (1.4 mL) 中の交換のために十分です。ただし、感染の必要な多様性は、1.6 mL の最終的な文化ボリュームのアカウントを調整する必要があります。
  4. 洗濯のドックにプレートを転送し、井戸からすべての培地を吸引します。HBV 含有培地の 400 μ L を追加し、井戸の貯水池側にすべて中表示される 3.5 分吸引 1 μ L/秒で下方向の流れを開始します。
  5. メンテナンス中/共メンテナンスの HBV を含むあたり II も、プレートを 37 ° C、5% CO2加湿インキュベーター内でドッキング ステーションに転送の 1.4 mL を追加します。8 h、1 μ L/秒の流量で上方向に反転に続く 1 μ L/秒の流量で下方向の流れを開始します。
  6. さらに b 型肝炎で 24 h は、洗濯のドックにプレートを転送し、井戸からすべての培地を吸引します。
  7. それぞれを洗うプレートでよく対応する媒体、文化の類型 3 x に従って手順 2.12-2.14、井戸から残ったウイルスを除去するために。手順 2.12-2.14 と対照をなして接種持ち越し (図 1 g) を除外するのにはサンプリングする余分なボリュームのアカウントにすべてのよく媒体の 1.6 mL を追加します。
  8. 次の洗濯手順には、細胞外の HBV DNA の定量化による b 型肝炎ウイルス菌の完全な除去を確認する各ウェルから 200 μ L 中を収集します。
  9. プレートを 37 ° C、5% CO2、加湿インキュベーター内でドッキング ステーションに転送、48 h の 1 μ L/秒の流量で上向きの方向にフローを開始します。
  10. 48 h はその後、ダウン ストリーム分析、肝細胞維持培地で 3 つの洗浄手順 2.12-2.14 に従って完全なよくボリュームを収集します。媒体を交換し、実験終了まですべて 48 h x 各よく 3 を洗ってください。

6. 細胞外の HBV DNA の定量化

  1. それらを別の領域に移動する前にサンプルでウイルス不活性化を確保するためキャリア封じ込めのレベル III のラボで RNA の 1 μ g 添加の製造元の指示に従って培養上清から全 DNA を分離します。
  2. 定量的 PCR マスター ミックス、600 nM 前方プライマー、600 nM 逆プライマーを含むマスター ミックスを調製し、300 nM プローブの。
  3. 384 ウェル プレートの各ウェルにマスター ミックスの 7 μ L を追加します。
  4. DNA サンプルの 5 μ L を加えて、重複、いいえテンプレート コントロールと希釈した HBV ゲノムを含んでいるプラスミッド ベース標準 (例えば、pCMV HBV) の重複の各ウェルに反応あたり 102コピーに反応あたり 10 の9のコピーに至る、qPCR プレート。
  5. 板の上粘着性のカバーを置き、それぞれよくは密封される正しくことを確認します。
  6. 300 × gで 1 分のプレートを遠心します。
  7. QPCR の製造元の指示に従ってを実行を開始します。リアルタイム PCR のサイクル条件は、95 ° C 10 分、95 ° C の 40 のサイクルが続く 15 秒/1 分の 60 ° C。
  8. 標準曲線に従って未知サンプル内で HBV DNA コピー数を定量化します。

7. 細胞内 HBV Pregenomic (pg) RNA の定量化

  1. 製造元の指示に従って足場からの総 RNA を分離します。完全セル換散を確保するために各渦足場 3 x 30 秒後 1 分 300 × gで遠心分離各ボルテックスの間。封じ込めのレベル III ラボそれらを別の領域に移動する前にサンプルでウイルス不活性化を確保するためのセル換散を実行します。
  2. 製造元の指示に従って分離 RNA からの cDNA を書き写します。
  3. Retrotranscription のサイクル条件は 10 分、120 分の 37 ° C の 25 ° C そして 85 ° C、5 分。
  4. 4 ° C で cDNA サンプルを維持短期的または長期的な貯蔵のための-20 ° C で。
  5. PgRNA と RPS11 含む定量的 PCR マスター ミックスと最終濃度 0.2 μ M の pgRNA と RPS11 (ハウスキーピング遺伝子として使用) の前方および逆プライマーのマスター ミックスを準備します。
  6. 384 ウェル プレートのマスター ミックスの 7.5 μ L と 2.5 μ L/ウェル cDNA を追加します。RPS11 と重複の各サンプルの pgRNA を測定し、両方の遺伝子のためによくないテンプレート コントロールが含まれます。
  7. 板の上粘着性のカバーを置き、それぞれよくは完全に密封を確保します。
  8. 300 × gで 1 分のプレートを遠心します。
  9. QPCR サーマルサイクラーにプレートを挿入し、qPCR の製造元の指示に従って標準の定量的 PCR のプロトコルを使用して実行を開始します。リアルタイム PCR のサイクル条件は、95 ° C の 40 のサイクルが続く 2 分、2 分、95 ° C 50 ° C 15 秒/1 分の 60 ° C。
  10. RPS11 に対する pgRNA の式を計算します。

8. 蛍光抗体法によりウイルス抗原の染色

  1. クラス II キャビネット封じ込めレベル III ラボでの鉗子で足場を外し井戸から止め輪を取り外します。
  2. 1 mL の PBS 封じ込めのレベル III の研究室に室温で 30 分間で 4% パラホルムアルデヒドでセルを含む足場を固定します。別の領域には、次の手順を実行することができます。
  3. 足場 3 を洗って 1 ml の PBS の x。
  4. 0.1% を使用してセルを permeabilize 室温で 1 時間 1 mL の PBS のトリトン X 100。
  5. 足場 3 を洗って 1 ml の PBS の x。
  6. 4 ° C で 16 時間 1 mL の PBS で 1 %bsa を用いた足場による培養での非特異的結合をブロック
  7. 足場 3 を洗って 1 ml の PBS の x。
  8. 4 ° C で 16 時間 1 mL の PBS で 1 %bsa の 1: 200 の希釈でウサギ B 型肝炎ウイルスコア抗原を使用して一次抗体の汚損を実行します。
  9. 洗う足場 1 x は 0.1 %1 mL の PBS (PBS トゥイーン) と 1 ml の PBS の 3 x 内のトゥイーン。
  10. 二次抗体の汚損を使用してを実行ヤギ抗うさぎ IgG (H + L) クロス吸着 Alexa Fluor 594 共役二次抗体 4 ° C で 16 時間 1 mL の PBS で 1 %bsa で 1:2,000 の希釈で
  11. 洗う足場 1 0.1 %1 ml x PBS トゥイーンと 1 ml の PBS の 3 倍。
  12. 室温で 10 分間 2 μ G/ml の濃度で 1 mL の PBS の DAPI を使用して足場を counterstain します。
  13. 洗う足場 1 0.1 %1 ml x PBS トゥイーンと 1 ml の PBS の 3 倍。
  14. 顕微鏡のスライドに足場を転送し、イメージング用マウントします。
  15. 蛍光顕微鏡を用いた足場をイメージします。

9. アルブミン ELISA

  1. 伝染性材料を使用して場合、封じ込めのレベル III のラボに割り当てられたクラス II キャビネットでプロトコルのこのセクションを実行します。
  2. 生存率および PHH の代謝機能を評価するには、elisa 法によるアルブミン生産を評価します。
  3. ヤギ抗ひと抗体のウェルあたり 50 μ L でコート 96年ウェル プレートは希釈コーティング バッファー (100 mM 重炭酸塩/炭酸塩、pH 9.6) の 1:800 です。プレートをカバーし、37 ° C で 2 時間または 4 ° C で一晩インキュベート
  4. プレートからコーティング抗体を吸引し、それを洗って 0.05% の 200 μ L で 4 x PBS トゥイーン。
  5. ブロック バッファー (PBS で 1 %bsa) を 200 μ l 添加、カバー プレートと 37 ° C で 1 時間インキュベートするそれらまたは 3 カ月の 4 ° C で保存します。長期的なストレージのブロック バッファーに 0.05% アジ化ナトリウムを追加します。
  6. ブロック バッファーを吸引させ、0.05% の 200 μ L で 1 x PBS トゥイーン。
  7. (1: 100) ウェルあたり以前希釈サンプルの 50 μ L を追加します。サンプル希釈液 0.05% 1 %bsa を含む PBS トゥイーン。37 ° C で 1 時間または 4 ° C で一晩インキュベートします。
    注: サンプルと同時に基準を孵化させなさい。濃度範囲 500-0.488 の ng/mL (1:2 シリアル希薄) をお勧めします。サンプル希釈液のアルブミンのすべてのシリアル希薄を実行します。
  8. プレートからサンプルを吸引し、それを洗って 0.05% の 200 μ L で 4 x PBS トゥイーン。
  9. HRP 標識ヤギ抗アルブミン抗体を 50 μ l 添加以前希釈 1: 10,000 のサンプル希釈液を追加します。37 ° C で 2 時間または 4 ° C で一晩インキュベートします。
  10. プレートから抗体を吸引し、それを洗って 0.05% の 200 μ L で 6 x PBS トゥイーン。
  11. TMB 試薬を 100 μ l 添加し、最高の基準は完全に開発されて、すぐに追加し、100 μ L 1 M H24比色反応を停止します。
  12. 450 で吸光度を読み取り解析用の 96 ウェル プレート リーダーの nm。

10. インターロイキン (IL) 6 および腫瘍壊死因子 (TNF) α 生産 3 D の共培養に

  1. 伝染性材料を使用して場合、封じ込めのレベル III のラボに割り当てられたクラス II キャビネットでプロトコルのこのセクションを実行します。
  2. 機能とプライマリのクッパー細胞の生存率を評価する IL6 と tnf α の生産を定量化します。クッパー細胞のこれらのサイトカインの産生を誘導、1 μ G/ml リポポリサッカライド (LPS) 後のシード 48 時間培養維持培地 II の 9 d と共培養系を扱います。
  3. 日 11 後播種、各ウェルから媒体を収穫し、-80 ° C で保存
  4. 適切な試金し、製造元の指示に従って培養培地で社会問題と IL6 濃度を測定します。

結果

プライマリ人間クッパー細胞や肝細胞と b 型肝炎ウイルスの感染の長期培養のためのシンプルで汎用性の高いプラットフォームについて述べる。ひと初代細胞が連続的に (図 1 a) 培地で細胞を perfuses マイクロ プレート アセンブリ内でコラーゲン被覆ポリスチレン足場でシードされます。

通常のみ安定した時間の限られた量のためにある従来の培養系、PHH は長時間の機能的保持ことができます。機能性肝細胞から分泌されると肝臓代謝の評価の最高のマーカーである、アルブミン安定化によって表されます 3 D 文化日 40 後播種 (図 2) まで。共培養系、(例えば、IL6 と tnf α) 特定のサイトカインの分泌物による Kupffer 細胞機能および生存率を評価できます。サイトカイン産生を測定するには、LPS 刺激による共培養系のキャプチャ ベース検出手段の使用は (図 3) をお勧めします。

細胞は、通常の機能胆細管と完全な細胞の極性形成 (図 2) を示す PHH の播種 3 日以内肝への放射能を形成します。彼らの生理学的な細胞の代謝を保持に加えてこれらの文化は HBV 感染に非常に敏感になります。HBV DNA および他の文化のシステムと対照をなして、他のウイルス マーカーとなって感染後 2 日目 (図 4) から容易に検出できます。肝細胞を含む足場の文化から取得、ウイルス抗原の免疫蛍光検出に使用ウイルス感染の分泌マーカーだけでなく (例えば、 HBsAg、HBcAg) (図 4)。従来の肝細胞培養を必要とするセルと 2 %dmso 添加あたりの少なくとも 500 の HBV GE 接種、4 %0.05 HBV GE ほどペグが DMSO やペグ (図 4) の必要がなく 3次元文化に感染を開始することができます。

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図 1: 3-D 肝臓オンチップ文化のセットアップ。(、) これは培養プレートのアセンブリのスケマティック レイアウト マイクロ流体循環の確立を図る。(b) このパネルに表示されますを含む文化井戸のクローズ アップ ビュー フィルター ペーパー、足場、止め輪。(c) このパネルが文化を播種する前に板の平衡化のプロセスを示しています。次の 2 つのパネルは、播種肝モノカルチャーの (d) と (e) 肝細胞/Kupffer 細胞共培養系のプロセスを示します。(f) このパネル手順を示します、洗濯中の変更に関連します。(g) このパネルは菌の除去を含む HBV 感染セットアップを示しています。スウェン播種培地、MM の = = メンテナンス中。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。

figure-results-2
図 2: 肝微少形成と肝細胞生存します。次の微少形成を示す 3 D 肝モノカルチャーの縦方向の明視野画像を示しています (、) のこのパネル播種します。(b) このパネルを示します核 (ブルー) 文化の蛍光イメージングとアルブミン (緑)。(c) このパネル縦合計アルブミンを示していますと同様セルあたり肝モノカルチャーの 40 日の間に、アルブミンの生産を調整する elisa 法によって決定されます。表示されるデータは、平均 ± SD.この図は、オルテガ プリエトら4から適応されます。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。

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図 3: 3次元共培養系におけるクッパー細胞機能します。これらのパネルの表示 (、) IL6 の分泌、および (b) tnf α で肝細胞のモノカルチャーと肝細胞/Kupffer 細胞 cocultures 人間磁気を使用して決定される 9 日ポスト播種、外因追加 LP への応答における播種後 11 日Luminex 試金。この図は、オルテガ プリエトら4から適応されます。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。

figure-results-4
図 4: 肝臓オンチップ培養における HBV 感染。(、) このパネルに表示されます HBcAg (赤), HBsAg (緑) と核 (青) の蛍光顕微鏡による検出 HBV に文化の伝染の後の 10 日。(b) このパネルは、文化の培養上清中の HBV DNA の定量化により感染の異なる多重度を用いた b 型肝炎ウイルス感染に対する感受性を示しています。(c) このパネルには、ハウスキーピング遺伝子 RPS11 を基準にして b 型肝炎 pgRNA の縦の蓄積の数量が表示されます。表示されるデータは、平均 ± SD.この図は、オルテガ プリエトら4から適応されます。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。

ディスカッション

PHH の長期的な文化を維持する上での課題は機能の向上と長寿、差分の長所と短所を示す各いくつかの培養モデルの開発を追い出しました。それは今広く認められる PHH の静的 2D 文化が時間の非常に限られた量の肝細胞生物学の特定の側面が模倣されます。したがって、マイクロパターニングゲル cocultures12,13, 回転楕円体文化14,153 D チップ上の肝臓文化16,17は急速にこれらのもっと基本的なシステムを交換します。生理学的な環境を提供するための要件が養殖人間熱帯の頻繁に挑戦的な性質により支えられていますがキノコアリにおける特定の微小を活用する彼らのホストである感染症を勉強して場合は特にC 型肝炎ウイルス、b 型肝炎、マラリアなどの感染症。

3 D の肝臓オンチップ文化を実行する最も重要なステップは、最初に供給された一次電池型の品質です。これらの細胞の遵守能力を試される、成功組織形成と文化の世代を確保するために plateable PHH たくさんのみを使用する必要があります。新鮮単離 PHH を使用ことができます、にもかかわらず、凍結保存は通常複雑であり特別なレート制御の冷凍機が必要です。

従来の静的 2D 文化と対照をなしてホストの遺伝的背景は HBV 感染の感受性に関して無視しすべてここまでテストされた肝細胞ドナーが b 型肝炎ウイルス感染4を確立すること。

にもかかわらず、患者由来 b 型肝炎ウイルスは、3 D 文化の感染を確立、PEG 沈殿を活用することが不可欠だし、ショ糖クッション精製 HBV ウイルス接種の世代線誘導性 HBV プロデューサー セルを使用するたびに。3 D チップ上の肝臓文化のいずれかを介して抑制的な要因または存在の成長因子、肝細胞との互換性がないのための存在に直接適用される細胞培養上清は、感染症で容易に起因しません。また、患者由来のウイルス接種を選択すると、血清のみを使用するのでプラズマは必然的に凝固して文化のプラットフォームのマイクロ流体循環の下駄します。

使用ウイルス菌に関係なく初期の b 型肝炎接種菌の完全な除去を保障し同様、細胞と分化、確保成功した長期的な感染症研究鍵です。これを行う最も便利な方法は、培養期間中のひと血清アルブミン レベルの測定し同様、接種ウイルスの除去に続いて文化をサンプリングです。ノートでは、すべての他の記載されているプラットフォーム、HBV 感染と同様の確立されると、容易に広がっていない、感染していない細胞。この基になるメカニズムは、HBV 感染生体内で容易に感染、肝臓内の肝細胞の大半以来とらえどころのないまま。

PHH とクッパー細胞の共培養系、に関して、すべて市販クッパー細胞の提供者と同じ応答を持っているので、LPS 刺激による、IL6 と tnf α の分泌を評価するクッパー細胞の多くのテストを実行することをお勧めします。

重要なは、すべて薬物治療または HBV に文化の初期感染は、井戸 (1.4 mL) もマイクロ流路 (0.2 mL)、現在の合計量する必要があります考慮する薬物または接種濃度の計算のため。正確な投与を保証するためにマイクロ流路を総理するために b 型肝炎ウイルスや薬物を含む培地で 1 つの洗浄のステップが実行されます。

使用しているプラットフォームにより、足場内多層肝細胞もあたり 600,000 PHH を利用しています。にもかかわらず、セル数を変えることができます、選択したセルの濃度は最適な結果を保証します。版のフォーマットは、36 の足場にアップグレードすることができます 12 足場の合計を保持します。ただし、マイクロ流体の要件によりよく数字が大きいほどにスケール アップは不可能までです。

これらのアプローチを使用して、文化はこれまで異なる肝細胞間の複雑な相互作用の研究し同様、新しい薬剤の候補者を評価する前例のない機会を提供する、少なくとも 40 日間最適な電池の性能を維持できHBV 感染集団。

開示事項

著者が明らかに何もありません。

謝辞

この作品は、CN バイオ技術革新、欧州研究会議 (637304)、Wellcome の信頼賞 (104771/Z/14/Z) からスターターの補助金によって賄われていた。

材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
Reagents
ウィリアムズEミディアム、フェノールレッドなしGIBCOA12176-01
肝細胞解凍培地GIBCOCM7500
一次肝細胞解凍およびプレーティングサプリメントGIBCOCM3000
一次肝細胞維持サプリメントGIBCOCM4000
DMEM/F-12GIBCO11320-033
Advanced DMEMGIBCO12491023
DPBS、カルシウム、マグネシウムなしGIBCO14190-144
MEM 非必須アミノ酸 (NEAA) 100xGIBCO11140050
ペニシリン-ストレプトマイシン (10,000 U/mL)GIBCO15140-122
ウシ胎児血清、米国産、熱不活化、滅菌ろ過、細胞培養に適していますSIGMA12106C
ヒドロコルチゾンSIGMAH0888
トリパンブルーメルクT8154
子牛の皮膚からのコラーゲンメルクC9791
G418シグマG418-RO
テトラサイクリンシグマT3258
ポリエチレングリコール8000SIGMAP2139
ショ糖SIGMASO389
ナトリウム無水SIGMA451614-25G
重炭酸ナトリウムSIGMAS5761
アジ化ナトリウムSIGMAS2002-5G
硫酸、99.999%SIGMA339741
4% パラホルムアルデヒドSIGMA252549
Triton-X 100SIGMAX100
Tween 20SIGMAP1379
DAPISIGMAD9564
アルブミン (ヒト)SIGMAA9731
Fisher BioReagent ウシ血清アルブミン、フラクションV、ヒートショック処理フィッシャーサイエンティフィックBP9701-100
ProLong Gold 退色防止マウンタントInvitrogenP36930
TaqMan Universal Master Mix II, no UNGApplied Biosystems4440040
SYBR Select Master MixApplied Biosystems4472903
Lipopolysaccharide from Escherichia coli K12InvivoGentlrl-eklps
名前会社カタログ番号コメント
キット/消耗品
滅菌膜CN Bio innovationsLC-SC
LiverChip灌流細胞培養プレートCN Bio innovationsLC12
LiverChip培養プレートの蓋CN Bio innovationsLC-SC
滅菌丸型濾紙CN Bio innovationsLC-SC
細胞付着足場CN Bio innovationsLC-SC
リテーニングリングCN Bio innovationsLC-SC
滅菌プランジャーCN Bio innovationsLC-ST
Dneasy血液&組織キットQiagen69506
RneasyミニキットQiagen74106
Human Magnetic LuminexアッセイR&D Systems
1-Step Ultra TMB-ELISA Substrate SolutionThermoFisher Scientific34028
High Capacity cDNA Reverse Transcription KitThermoFisher Scientific4368814
QIAamp Viral RNA Mini Accessory SetQiagen1048147Containing RNA carrier
Millicell HY 5-layer cell culture flask, T-1000, sterileMillipore (Merck)
MicroAmp光学式384ウェル反応プレートテクノロジー4309849
MicroAmp光学接着フィルムライフテクノロジー4311971
クリアフラットボトムイムノ非滅菌96ウェルプレートサーモフィッシャーサイエンティフィック96
シーリングテープサーモフィッシャーサイエンティフィック15036
Nalgene Rapid-Flow 滅菌ディスポーザブルボトルトップフィルター PES メンブレン付きThermoFisher Scientific295-3345
Fisherbrand Microscopic Slides with Ground Edges, Twin FrostFisher ScientificFB58628
Tube, 薄壁, ウルトラクリア, 38.5 mL, 25 x 89 mmベックマン・コールター344058
Name会社<名/strong>カタログ番号コメント
初代細胞 / 細胞株
Human Plateable Hepatocytes, Transporter QualifiedThermo Fisher ScientificHMCPTS
凍結保存されたヒトKupfferThermo Fisher ScientificHUKCCS
HepDE19細胞株Haitao Guo (Indiana University, IN, USA)
NameCompanyカタログ番号コメント
プライマー/プローブ/スタンダード
HBV DNAフォワードプライマーInvitrogen5'-GTGTGCGGCGTTTTATCA-3'HBV
DNAリバースプライマーInvitrogen5'-GACAAACGGGCAACATACCTT-3'HBV
DNAプローブInvitrogen5'FAM-CCTCTKCATCCTGCTGCTATGCCTATGCCTCATC-3'TAMRA
pgRNA フォワードプライマーInvitrogen5'-GAGTGTGGATTCGCACTCC-3'pgRNA
reverse primerInvitrogen5'-GAGGCGAGGGAGTTCTTCT-3'RPS11
forward primerInvitrogen5'-GCCGAGACTATCTGCACTAC-3'RPS11
reverse primerInvitrogen5'-ATGTCCAGCCTCAGAACTTC-3'pCMV-HBV
Professor Christoph Seeger (Fox Chase Cancer Centre, PA, USA)
Name会社名カタログ番号コメント
Antibodies
抗B型肝炎ウイルスコア抗原IgG分画(ポリクローナル)DAKO販売終了Lot 10102505
ヒトアルブミン抗体 A80-129ABethyl Laboratories. incA80-129A
Human Albumin cross-adsorbed Antibody, A80-229PBethyl Laboratories. incA80-229P
Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Cross-adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 594サーモフィッシャーサイエンティフィック# A-11072ロット1431810
名前会社カタログ番号コメント
Equipment
LiverChip真空ポンプCNバイオイノベーションLC-PN
リバチップ空気圧フックアップCNバイオイノベーションLC-PN
LiverChipプラットフォームCNバイオイノベーションLC-PN
リバチッププレート洗浄ドックCNバイオイノベーション
オートクレーブ可能な金属鉗子VWR232-0106
ボルテックスジーニー2科学産業SKU:SI-0236
オプティマXPN-80超遠心分離機ベックマンコールターA95765
ヘレウス マルチフュージ X3R 遠心分離機Thermo Scientific75004500
SAM-12 医療用吸引 高真空 高流量MGE ワールドワイド SAM12/01010101
NUAIRE 5800シリーズインキュベーターNUAIRENU-5841
自動精密トルクCN バイオイノベーション
手動トルクCNバイオイノベーション
LiverChipコンプレッサーCNバイオイノベーション
Luminex LX-200 xPONENT 3.1Luminex
付き機器Milliporeハンドヘルド磁気セパレーターブロックThermoFisher ScientificMillipore™ 40-285
FluoStar OptimaプレートリーダーBMGLabtech
KOLVER 精密電動ドライバーVTECH ltdFAB10RE/FR
KOLVER 電源VTECH ltdEDU1FR
BAMBI VTS75DAir Equipment販売終了
Integra VacuboyINTEGRA
ViiA 7 リアルタイム PCR システム、384 ウェルブロックThermoFisher Scientific4453536
炭酸バーコード付きPFHYS1008 ライフウェルプレート用442404細胞

参考文献

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