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方法論記事

侵略を勉強し、膀胱癌の治療を評価するための 3次元細胞培養システム

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DOI:

10.3791/58345

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2018年9月13日

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1Departments of Internal Medicine, Hematology/Oncology Division, Rogel Cancer Center, University of Michigan Medical Center, 2Department of Urology, Division of GU Oncology, Rogel Cancer Center, University of Michigan Medical Center, 3Departments of Surgery and Pathology, Perlmutter Cancer Center, NYU Langone Health

この記事について

サマリー

膀胱癌の浸潤を支配するプロセスは、バイオ マーカーと治療開発のための機会を表します。腫瘍の回転楕円体、タイムラプス イメージングと共焦点顕微鏡の 3次元の文化を取り入れた膀胱がん浸潤モデルをご紹介します。侵襲的プロセスの機能を定義するため、治療薬のスクリーニングは、この手法が役に立ちます。

要約

膀胱癌は、重大な健康問題です。以上 16,000 人は膀胱癌から米国で今年を死ぬと推定されます。膀胱癌の 75% は非侵襲と転移する可能性は低い、約 25% は浸潤性増殖パターンに進行します。侵襲的な癌患者の半分までは致命的な転移再発を開発します。したがって、膀胱がんに侵襲的な進行のメカニズムを理解することは患者の転帰を予測して致死的な転移を防ぐために重要です。この記事では腫瘍細胞や膀胱腫瘍微小環境における発生する生体内の状態を模倣する間質成分の混入を可能にする三次元がん浸潤モデルを提案する.このモデルは、タイムラプス イメージングを使用してリアルタイムで侵襲的プロセスを観察し、ブロックの侵入する可能性のある共焦点蛍光イメージングと画面の化合物を使用して関与する分子経路を調査する機会を提供します。このプロトコルは、膀胱がんに焦点を当てて、侵略と他の腫瘍型で運動性を調べるための同様のメソッドが使える可能性が高いです。

概要

侵略は、癌の進行、転移に必要なより低い生存率と予後に関連付けられた重要なステップです。ひと膀胱癌、尿路、世界で年間約 165,000 死亡を引き起こす最も一般的な悪性腫瘍で癌の病期、治療、予後に直接関係侵略1の有無。膀胱癌症例の約 75% は、局所切除と非筋肉侵襲とに管理されます。対照的に、筋層浸潤性膀胱癌 (すべてのケースの約 25%) は転移率の高い強い腫瘍であり、積極的な集学的治療2,3と扱われます。したがって、侵略を誘発する分子経路を理解することはより侵襲的な進行のリスクを特徴付ける侵襲的な進行を防ぐことができる治療上の介在を開発するために不可欠です。

腫瘍浸潤進行複雑な三次元 (3 D) 環境で発生し、他の種類の免疫細胞、線維芽細胞、筋細胞を含む細胞の基底膜、実質他の腫瘍細胞と腫瘍細胞間相互作用を含むと血管血管内皮細胞。彼らはリアルタイムで浸潤過程の微視的監視を許可していないので、アッセイ系はよく癌細胞浸潤4、しかし、これらのシステムを量的に使用されて (例えばTranswell) 透過性のサポートは限られて、さらに染色し、分子解析のためのサンプルの取得は困難です。生体外でシステムの利便性と定義されたアイソレータケージ コンポーネントの定款をことができますので、侵略を勉強する 3-D 膀胱腫瘍回転楕円体システムの開発をお勧めします。

このプロトコルでは細胞運動を監視する研究者を許可するコラーゲン ベースのゲルのマトリックスと共焦点顕微鏡を組み込む 3-D 回転楕円体浸潤アッセイを用いたひと膀胱がん細胞の侵襲的なプロセスを調査するシステムについて述べるとリアルタイム (図 1A) に侵攻。このシステムは、汎用性と尋問/腫瘍間質のさまざまな設定を変更できます。それはようながんには、線維芽細胞と免疫細胞5,6,7が関連付けられているほとんどの膀胱癌セルラインまたは膀胱腫瘍とその他の間質細胞を組み込むことができます。このプロトコルは、タイプ 1 コラーゲンから成る行列を記述しますが、フィブロネクチン、ラミニン、他のコラーゲン蛋白質など他の分子を組み込むために変更できます。侵襲的なプロセスは顕微鏡と使用されるシステムの機能によって 72 時間以上続くことができます。固定と侵攻中、前後に 3-D マトリックスに埋め込まれた腫瘍の免疫蛍光染色により、したがって、通常不在または収集することは困難重要な情報を提供する侵襲的な細胞でタンパク質亢進の尋問他の 3次元培養モデルを使用します。このシステムは、侵入をブロック画面化合物、前記化合物によって影響を受けるシグナル伝達経路を線引きしたりするにも利用できます。

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プロトコル

1. がん回転楕円体の成長

  1. 細胞からの成長
    1. 従来の付着の下で文化ひと膀胱がん細胞は細胞の培養条件と 5% CO2に付属している 37 ° C の定温器の維持します。細胞を維持 < 90% の confluency。
      注: 使用培地はダルベッコ 4.5 g/L、D-グルコース ピルビン酸ナトリウム 110 mg/L、L-グルタミンを含む最低限不可欠なメディア (DMEM) を変更し、10% 牛胎児血清 (FBS) このプロトコル全体に付属しています。
    2. 実験の開始前に 1 日 trypsinize (0.25% を使用して、トリプシン-EDTA) 細胞、細胞濃度を定量化し、6 も超低取り付けプレートの各ウェルに 3 mL の培地で 1 x 10 の6セルを配布。
    3. ≥16 h の 37 ° C で低接着条件のセルを孵化させなさい。これは細胞に十分な時間を許可する必要がありますほとんどの膀胱癌細胞のスフェロイドに集計します。
      注: 回転楕円体の形成は、倒立明視野顕微鏡による観察できます。個々 の実験に最適なサイズおよび回転楕円体の数によって異なりますが、我々 は 150 μ m 50 μ m から径と回転楕円体が一般的に 20 X 対物レンズを用いたタイムラプス イメージングに適しているを見つけます。
    4. 追加の細胞の種類、線維芽細胞や免疫細胞に回転楕円体などを組み込むミックス任意のセルに任意の比率でがん細胞 (1:1、1:10など) 超低の添付プレートと 37 ° C の形成を許可する ≥16 時間インキュベート。混合細胞型回転楕円体。
  2. 原発腫瘍からの成長
    注: 回転楕円体は、膀胱腫瘍に由来することができますも腫瘍源から発がん物質による膀胱腫瘍モデル8開発腫瘍など。たとえば、マウスから生成された膀胱腫瘍はうんざり N-ブチル - N-(4-ヒドロキシブチルメタクリ) ニトロソアミン (BBN) を収穫し、無菌の手術器具を使用して (約 0.5 mm3) 小さな断片にみじん切りすることができます。ひと膀胱癌は、このシステムで学ぶことができますの一次サンプルを消化しました。
    1. 収集し、5 mL の冷たいリン酸緩衝生理食塩水 (PBS) で 0.5 mm3腫瘍部分を洗います。4 ° C で 5 分間 200 × gで遠心分離この洗浄工程をもう一度繰り返します。
    2. 4 ° C で 10 分間 200 × gで遠心分離して腫瘍部分を収集します。上澄みを除去し、5 mL の 10% を含む DMEM を追加 FBS。6 ウェル超低取り付けプレートに腫瘍回転楕円体/メディア混合物を転送します。コラーゲン マトリックスを埋め込む前に h ≥16 の 37 ° C で孵化させなさい (手順 2.3 を参照してください)。

2. 3次元培養室の準備

  1. 10% を含む DMEM でタイプ 1 コラーゲン (ラットの尾から派生) を希釈に製造元の指示に従って 2 mg/mL の混合物を作る FBS。
    1. 一言で言えば、穏やかなピペッティング生理学的 pH を達成するために製造元の指示に基づいて、1 N の NaOH 溶液と DMEM の適切な量のコラーゲンをミックスします。
    2. コラーゲンと DMEM を混合後すぐにチェンバー スライドの井戸を (ほとんどのアプリケーション数 1.5 カバーガラスとチャンバー スライドが最適) のコート凝固 (200 μ L/ウェル) 前にコラーゲン DMEM の混合物。15 分間室温で静止するようにコーティングされたチェンバー スライドを許可します。
      注: マトリックスのコラーゲン ベースの組成は、実験の目的に応じてフィブロネクチンやラミニンなどの他の細胞外マトリックス成分を追加することによって変更することができます。
  2. 優しくピペット 500 μ L、空の 1.5 mL 遠心チューブに 6 も超低取り付けプレートから回転楕円体 (または腫瘍部分、原発腫瘍のサンプルを使用する場合) を含むメディアの。回転楕円体の管の底に沈殿させて 2 分待ちます。
  3. チューブから上澄みを慎重に取り外します。タイプ 1 コラーゲン (2 mg/mL) の 10% を含む DMEM を混ぜて別の管を準備 FBS すばやくスフェロイドを 500 μ L のこの混合物を追加。優しくゆっくりピペッティング回転楕円体とコラーゲンをミックスします。
  4. コラーゲン塗布前のチェンバー スライドの井戸に回転楕円体/コラーゲン混合物の 250 μ L を追加します。完全に固化する回転楕円体を含むコラーゲン マトリックス (37 ° C で約 30 分) を許可します。
  5. コラーゲン マトリックスを凝固させる為、1 mL の 10% を含む DMEM を追加 FBS も (図 1B)。チェンバー スライド画像の準備ができるまで 5% CO2に付属している 37 ° C のインキュベーターで孵化させなさい。

3. 生細胞タイムラプス イメージング

  1. 製造元の指示に従って共焦点顕微鏡および気候室が 37 ° C に達する 5% CO2が付属していることを確認します。
    注: 顕微鏡、商工会議所にはシステムの平衡に到達する 1 h 通常必要があります。
  2. 慎重にチェンバー スライドを顕微鏡に接続されているスライド アダプターに転送します。
  3. (例えば5 X) 目的で低消費電力を使用して興味の回転楕円体を選択してより高い電力を目的とイメージングを起動 (現在のプロトコルの 20 × 対物内容が、その優れた画像品質のための生きているセルイメージ投射のほとんどの使用です)。
    注: 膀胱腫瘍サンプルの 5 X、10 X の目標は必要かもしれない大きな撮像面積をカバーするために。当社のタイムラプス イメージング、イメージングの間隔は 30 分として設定され、Z スタックは、全体の回転楕円体のイメージに使用されます。通常 Z スライス間の距離は設定 4 μ m に客観的、かつ Z 軸の総距離 X 20 は約 200 μ m の範囲の画像は、DIC を使って取得でき、蛍光細胞/組織蛍光蛋白質のマーカーを抱く場合。
  4. 24-72 時間タイムラプス イメージングを実行します。
    注: 期間は、電池の種類や実験のニーズによって決定されます。

4. 凍結組織切片の癌を回転楕円体を含むサンプル ブロックの準備

  1. 小鉗子を使用して、コラーゲン ・ ゲルとチャンバー スライドから回転楕円体のブロックを持ち上げながら。組織学のプラスチック金型にコラーゲン ゲルのブロックを配置します。
  2. 1x PBS でコラーゲン ・ ゲルを簡単に、リンスに固定し、4% パラホルムアルデヒド (PFA)、PBS で室温で 30 分間。
    注意: PFA は、潜在的な発がん性物質注意して処理する必要があります。
  3. PBS 15 分置換シェーカー 1 × PBS の 1.5 mL でコラーゲン ・ ゲルを洗浄し、前の洗濯手順 3 倍を繰り返します。
  4. 最適な切削温度 (10 月) 新組織学プラスチック金型の底をカバーする化合物の薄層 (約 3 mm) を適用します。固定配置し、全体のゲルを OCT OCT で空気の泡の形成を回避しながらコンパウンド金型充填によって慎重に埋め込む OCT 上にコラーゲン ・ ゲルの化合物を洗浄します。
  5. 1 h の 4 ° C で型を残しなさい。
  6. サンプルと 10 月液体窒素に浮かぶ 100 mm シャーレに化合物を含む金型を配置します。完全にフラッシュ凍結サンプルを許可します。
  7. 将来の使用に備えて-80 ° C で凍結サンプル ブロックを格納します。

5. 凍結切片の癌回転楕円体のため蛍光イメージング

  1. -80 ° C のフリーザーからクライオスタットの-20 ° C チャンバーに冷凍サンプル ブロックを転送します。
  2. 従来凍結するセクションの間隔を 7 μ m 以下に設定すると、区分を実行します。断面サンプルしわなしのガラス スライドに添付または空気を閉じ込められています。
    1. さらに染色を行う前に、-80 ° C でスライドを保存します。
      注: 実験ニーズに合わせて異なる間隔を使用可能性があります。
  3. 空気は、室温で 1 時間スライドを乾燥させます。
  4. 0.5% を含む PBS でサンプルを permeabilize トリトン X-100 15 分。
  5. 洗浄は、PBS で洗浄あたり 10 分の 3 x をサンプリングします。
  6. 疎水性障壁のペンを使用して疎水性の障壁とスライドのサンプルを取り囲みます。
  7. 室温で 1 時間ブロッキング液 (1 x 5% ウシ血清アルブミン (BSA) を含む)、PBS のサンプルを扱います。
  8. スライドの各サンプルに 40 μ L の一次抗体含有溶液 (1 x PBS の一次抗体の 1: 100 希釈で 5 %bsa を含む) を適用します。
  9. スライド 37 ° C 1 時間以上 (インキュベーション時間と条件は一次抗体によって異なります)、室温を一晩で一次抗体の孵化させなさい。
  10. 洗浄 (洗浄) あたり 15 分の PBS で 3 倍をサンプルします。
  11. スライドの各サンプルに二次抗体含有溶液 (1: 300 二次抗体希釈 BSA の 5% を含む 1 x PBS) の 40 μ L を適用します。
  12. 洗浄 (洗浄) あたり 15 分の PBS で 3 倍をサンプルします。
  13. ヘキスト 33342 液 (1 μ g/mL、PBS で希釈した) とサンプルを 10 分間室温で染色します。PBS で 5 分間のサンプルを洗います。
  14. サンプルはメディアをマウントをマウントし、適切なサイズのカバー スリップでそれらをカバーします。常温 24 時間暗闇の中でスライドを残すし、共焦点の顕微鏡検査を行います。

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結果

浸潤性膀胱癌腫瘍回転楕円体の作成に成功した細胞または原発腫瘍から適切に大きさで分類された腫瘍スフェロイドの形成が必要です。図 2Aは、4 つのひと膀胱癌細胞株 (UM UC9、UM UC13、UM UC14、253J、および UM UC18) から開発された適切に大きさで分類された回転楕円体を示しています。図 2Bは、コラーゲン マトリックスに埋め込まれた BBN で生成されたマウス膀胱腫瘍から腫瘍の回転楕円体を示しています。前述のようにこれらの球体が埋め込まれた、代表的な画像は、ライブセル イメージングのための顕微鏡を使用してキャプチャされました。イメージング UM UC18 スフェロイド UM-UC14、UM UC13 UM UC9 マウス膀胱腫瘍回転楕円体は、5 倍と 10 倍の対物レンズを使用して検討したに対し、20 X 対物レンズが使われました。

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ディスカッション

ここで癌の進行および転移のために重大である膀胱癌の浸潤のリアルタイム観察を可能にする 3次元腫瘍回転楕円体モデルをについて説明します。このシステムは膀胱癌の浸潤が起こる組織微小環境良い要約する捜査官を許可するさまざまな間質および細胞コンポーネント定款に従う。膀胱がん回転楕円体細胞 (遺伝子組み換え細胞シグナル伝達経路の侵略プロセスに影響を与えるを検討を含む) などのさまざまなソースから生成することができます、プライマリ マウス腫瘍 (ここを参照)。それは可能性も人間の腫瘍の解析に適しています。使用してイメージング システム、に応じてリアルタイムまたは固定して様々 な時点で染色蛍光、蛍光を監視できます。システムは、侵入の潜在的な阻害剤をテストする使用できます。これはシステムを膀胱癌・細胞増殖を評価するために汎用性と強力なツールになります。

温度管理、水分制御、および CO2供給を提供する気候室と共焦点顕微鏡システムはこのプロトコルで記述されているモデルを構築するための機器の重要な部分です。

細胞生物学、癌研...

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開示事項

著者は競合する金銭的な利益を宣言しません。

謝辞

著者は、テクニカル サポートおよび提供する材料と本研究装置およびテクニカル サポートのためのアラン ・ ケレハー博士ハワード ・ クロフォード (ミシガン大学) の研究室に感謝したいと思います。

この作品は、ミシガン州 Rogel がんセンター コア付与 CA046592 26S3、NIH K08 CA201335 01A1 (PLP)、編 YIA (PLP)、NIH R01 CA17483601A1 (DMS) の大学からの補助金によって賄われていた。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
ヒト膀胱がん細胞株 UM-UC9, UM-UC13, UM-UC14, UM-UC18, 253J
DMEM 細胞培養液サーモフィッシャーサイエンティフィック11995065
ウシ胎児血清 サーモフィッシャーサイエンティフィ26140079
抗生物質-抗真菌薬 (100x)サーモフィッシャーサイエンティフィック15240062
トリプシン-EDTA (0.25%)、フェノールレッドサーモフィッシャーサイエンティフィック25200056
ウシ血清アルブミン (BSA)Sigma-AldrichA3803
リン酸緩衝生理食塩水 (PBS)、pH 7.4 サーモフィッシャーサイエンティフィック10010023
Costar Ultral-low attachment 6-well cluster Corning3471
従来型倒立顕微鏡 Carl Zeiss491206-0001-000細胞培養およびスフェロイドのチェックに一般的に使用される
ラットテール由来のコラーゲン1型、高濃度 Corning354249
Nunc Lab-Tek II チャンバーカバーガラスThermo Fisher Scientific155382
共焦点顕微鏡 Carl ZeissLSM800クライメートチャンバー、マルチロケーションイメージング、Zスタックスキャン機能を備えた共焦点ミスコスコープ 
クライオスタットマイクロムトームライカバイオシステムズCM3050 S
Zen 2 画像処理ソフトウェア カールツァイス
パラホルムアルデヒド溶液電子顕微鏡科学15710
ImmEdge疎水性バリアPAPペンベクトル研究所 H4000
O.C.Tコンパウンド サーモフィッシャーサイエンティフィック23730571
Hoechst 33342ソリューション サーモフィッシャーサイエンティフィック62249
抗 ATDC (Trim29) 抗体Sigma-AldrichHPA020053
抗サイトケラチン 14 抗体Abcamab7800
抗ビメンチン抗体Abcam ab24525
ProLong Diamond 封入剤
ック

参考文献

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