方法論記事

空間と時間の温度変化に対応したショウジョウバエのパフォーマンスを決定する自動化された方法

6.1K 閲覧数

⸱

DOI：

10.3791/58350

⸱

2018年10月12日

 ,  ,  ,  , 
1Groningen Institute for Evolutionary Life Sciences, University of Groningen, 2Department of Cell Biology, University of Groningen, University Medical Center Groningen, 3Ruijsink Dynamic Engineering, 4Department of Psychology, University of Groningen

* These authors contributed equally

この記事について

サマリー

ここで時間と空間で高速かつ正確な温度変化を生成するプログラム可能な温度制御のアリーナを使用して温度変化でショウジョウバエの歩行のパフォーマンスを自動的に決定するためのプロトコルを提案する.

要約

温度は、種の配布および動作方法に影響を与えるユビキタス環境要因です。ショウジョウバエの種の生理的な耐性と適応性によると温度変化に対する具体的な応答があります。ショウジョウバエハエには、温度感知温度 ectotherms の処理の神経基盤を理解する基礎となっているシステムも所有しています。温度変化に個々 のはえの応答を探索する時間と空間の制御と高速高精度の温度変化を可能にする温度制御のアリーナをご紹介します。個々 のはえはアリーナに配置、設定を決定するのに同時に温度を反応規範を決定するまたは空間的分散温度で均一徐々 に増加など、事前にプログラムされた温度の課題にさらされています。個人は速度または位置の好みの定量化をできるように、自動的に追跡されます。このメソッドは、急速にショウジョウバエの温度性能曲線を決定する温度の大きい範囲または同じようなサイズの他の昆虫に応答を定量化する使用ことができます。さらに、温度の設定と変異体や野生型ハエの反応を数値化する遺伝学的研究のためこのそれを使用できます。このメソッドは、熱の種分化、適応と温度処理の背後にある神経のメカニズムの基礎を明らかに助けることができます。

概要

温度が一定の環境要因の生物機能し、1を動作に影響を与えるです。緯度や高度の違いは、生物が、温度2,3への応答に対する進化的選択の結果にさらされている気候の種類の違いに します。4自分の特定の環境下でのパフォーマンスを最大化する形態学的、生理学的なおよび行動の適応によって異なる温度に応答する生物。例えば、ミバエショウジョウバエのさまざまな地域からの人口がある異なる温度の設定、本体サイズ、発達度、長寿、多産、歩行性能別温2 ,5,6,7。異なる起源のハエとの間観察された多様性は遺伝的変異とプラスチック遺伝子式8,9によって部分的に説明されます。同様に、さまざまな分野からショウジョウバエ種温度勾配の間で異なる配布し、極端な暑さと寒さテスト10、11,12に抵抗性の差異を表示します。

ショウジョウバエも最近温度知覚13,14,15,16,17の遺伝学的および神経の基礎を理解するための好みのモデルとなっています。成虫が温度を感知するアンテナの冷・温の周辺温度センサーと温度センサー脳13,14,,1516を通して広く、,17,18,19,20. 高温下に末梢受容器表現Gr28b.d16または発熱21周囲中冷たい受容器はBrivido14によって特徴付けられます。脳の温度はTrpA115を表現するニューロンによって処理されます。これらの経路の突然変異体の行動研究は温度の処理方法の私達の理解を改善しているし、さまざまな地域からショウジョウバエの個体数によって異なるメカニズムに洞察力を与えます。

ここで高速かつ正確な温度変化を生成する温度制御のアリーナをについて説明します。捜査済み人手を介さず標準化され、再現性のある温度を操作することができますこれらの変更プログラムできます。ハエは記録および実験の異なるフェーズでその位置と速度を決定するための特殊なソフトウェアを使用して追跡。このプロトコルで主な測定は各温度下での歩行速度である個々 の熱的適応性5を識別できる生理学的な性能の生態学的関連性の高いインデックス。温度受容体変異体と共にこの手法は細胞および生化学的レベルでの温度適応のメカニズムを明らかにすることができます。

アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。

プロトコル

1. はえの食糧媒体の作製

  1. 2 L ガラス ビーカーに水道水 1 リットルを注ぎ、電磁攪拌棒を追加します。沸騰の温度に到達するまで、300 ° C で磁気ホット プレートにビーカーを置きます。
  2. 500 発/分に攪拌し、以下を追加します: 寒天 10 g、ブドウ糖 30 g、15 g のショ糖、コーンミールの 15 g、小麦胚芽の 10 g、きなこ 10 g、糖蜜の 30 g と 35 g アクティブな乾燥酵母。
  3. ミックスは精力的に発泡するとき、は、攪拌を続けながら 120 ° C にホット プレートの温度を下げてください。
  4. 10 分後にホット プレートの温度をさらに 30 ° C までを切り、ミックスは 48 ° C に冷却するまで攪拌を続行ビーカーの壁に触れることがなく直接食品に温度計を挿入することによって温度を測定します。
  5. 96% エタノール 10 mL に p ヒドロキシ安息香酸メチルエステルの 2 g を溶解し、ミックスは、一緒に 1 M プロピオン酸 5 mL を加えます。3 分間攪拌を続けます。
  6. ホット プレートの電源を切り、飼育ボトルと 6.5 mL コレクション バイアルに食品に食品の 45 mL を注ぐ。

2. ハエの準備

  1. 場所 20 男性および 20 雌飛ぶ飼育びんはえの食糧媒体の 45 mL を含みます。ダウンそれらをタップして新鮮なボトルにそれらをタップし新しいボトルに 3 〜 4 日後のハエを転送します。3 つの変更後のハエを破棄します。
    1. 25 ° C の一定温度で 12 h 光/12-h 明暗周期下インキュベーター中ボトルを配置します。
      注: ハエの新世代は、10 日後 eclose になります。
  2. 最大 4 分の二酸化炭素パッドこのハエを新しく麻酔し、絵筆を使ってはえの食糧媒体の 6.5 ml 2.5 × 9.5 cm 飛ぶ飼育瓶でそれらを収集します。
    1. 唯一の童貞でハエを収集、飼育バイアルあたり 20 ハエのグループにセックスでそれらを区切ります。
    2. 5-7 日、ハエに新しいバイアルごとに 2-3 日間の実験の前に、の日に変更するためのインキュベーター内バイアルを配置します。

3. ライトのフレーム

  1. 厚さ 0.5 センチ、高さ 4 センチ、幅 4 cm 長さ 10 cm の木枠を作る。
  2. 短い辺のそれぞれで、4 cm の長さ、高さ 4 センチ、幅 1.5 cm 幅の内部の方の枠を作成する木製フレームの領域。国境開放内部の顔をまま。
  3. 直径 0.5 cm 短い端の境界線のそれぞれ、1 つの木製のフレームの長い端の交差点の 2 つの穴をドリルします。
  4. 各微小エッジの枠線の内側の暖かい白色 LED ストリップの場所 10 cm。すぐに場所に接着する LED ストリップの背中の皮をむきます。
    注: 暖かい白色 LED ストリップを赤外線 LED に置き換えることが排除される照明ニーズの実験用ストリップします。
  5. スイッチング電源、LED ストリップの反対側の境界線上にもう一方の端にボーダーの 1 つの LED ストリップの 1 つの端を接続します。
  6. 両方の LED ストリップがオンになったことを確認するスイッチング電源をオンにします。
  7. 紙の白い部分とそれぞれの国境の開放側をカバーします。
  8. 長い辺の内部フェーズのそれぞれに紙の別の部分に接着します。

4. 低温アリーナ

  1. 温度制御アリーナ (図 1 a 1 C) をオンにします。ファンが実行を開始、アルミのリングは、ウォーミング アップを開始を確認します。
  2. 温度シーケンスTemperaturePhasesスクリプトを実行する制御コンピューターに温度管理されたアリーナを接続するのに USB ケーブルを使用します。
  3. 制御コンピューターのTemperaturePhasesスクリプトを開き、(ビデオ 1) 温度シーケンスが正しく設定されていることを確認します。
    1. 各実験段階の期間 60 に設定されていることを確認"par を確認することによって s.StimulusDur「である 60 s。
    2. 1) 数に等しい必要数段階、2) 反復オン/オフ発光ダイオード (Led)、段階ごとの 3) 2 ° C 温度上昇を示す赤ランプのセットアップの開始温度として 4) 16 ° C が"開始実験の下ですべて正しいことを確認します。ブロック"セクション。
      注: は、最初の実験段階 (図 2) で速度の人工増加を避けるためには 16 ° C で 7 分間飛ぶアリーナに順応するハエを許可します。
    3. TemperaturePhasesスクリプトを実行します。ソフトウェア初期化を 5 秒間どおりに「アリーナ。"待機して停止します。
    4. ハエが飛ぶアリーナ (ステップ 5.3) に吹き飛ばされている一度実験フェーズの実行を開始するキーボードのスペースバーを押します。
      注: TemperaturePhasesは、ボックスを制御する現在のスクリプトしかし、さまざまな実験の条件に調整するこのデバイスを使用するその他のカスタム スクリプトを作成することが可能です。
  4. カメラの USB ケーブルを使用して記録コンピューターに競技場の上にカメラを接続します。
  5. ビデオ録画プログラムを開く (材料の表を参照) を選択して記録コンピューターで「ファイル |新しい動画撮影」。カメラからイメージを表示する画面が開きます。
    1. カメラの画像キャプチャ アリーナと示す赤色 Led のすべての端することを確認します。
    2. ライトのフレームを設定する (ステップ 5.4) アリーナの周りにカメラ画像を表示画面の下端の中央にある赤いボタンを押すと録音を開始します。
      注: 照明の小さな変化追跡の精度に影響することができます。装置の位置を固定することによって低温アリーナの照明を一定に維持することをお勧めします。

5. 温度行動実験

  1. 飛ぶアリーナ (図 1) を準備します。
    1. すべてのエッジが覆われていることを確認、銅のタイルの上に白の導電性テープの鎖を場所します。
    2. 銅のタイルの周り温水アルミのリングを配置します。リングのエッジは銅のタイルの周りを完璧にフィットし、ので、それは常に同じ場所に配置されます。
    3. クリーンな組織とガラスのカバーをきれいにし、ハエで吹き飛ばされることがギャップを残して、アルミのリングの上に置きます。
      注: 実験前に滑りやすいサーフェスを作成する反応剤とガラスのカバーをコートします。24 h の反応剤を適用し、使用前に水ですすいでください。
  2. TemperaturePhasesスクリプト (ステップ 4.3.3) を実行し、ビデオ録画プログラム (ステップ 4.5) を開きます。
  3. 飼育バイアル (ステップ 2.2.2) から飛ぶアリーナに場を爆破 (e.g。、男性 1 が図 3に飛ぶ)。
    1. 2 回行き、底に口の吸引器と 1 つのフライ トラップし近く、バイアル、インキュベーターに戻し、強制的にそれをタップ、インキュベーターからハエの入った瓶を取る。
    2. ガラス カバーとアルミのリング (ステップ 5.1.3) との間に残されている隙間からアリーナでフライを置きます。
    3. ハエが飛ぶアリーナに導入されてすぐにアルミのリングの端に達するまで、ガラス カバーを押すことによってガラス カバーとアルミのリング間のギャップを閉じます。
  4. 対称照明を確保するためアリーナの周りのライトのフレームを配置します。
    1. マークの場所 (e.g。、永久的なマーカーを使用して) 飛ぶアリーナ (図 1) フレームは常に同じ場所に配置ことを確認するの周りのフレームの。
  5. ビデオ録画プログラム (ステップ 4.5.2) と録音を開始し、実験段階 (ステップ 4.3.4) の実行を開始する制御コンピューターのキーボードの space キーを押します。
  6. 結局のところ実験段階 .mp4 または .avi 形式でビデオを保存を行い、口吸引と飛ぶアリーナから場を削除します。
    注: 両方の示す赤色 Led がオフになっていることはTemperaturePhasesスクリプトの停止によって、実験段階の終わりを決定できます。
    1. 録画プログラム画面の下端の途中で停止ボタンを押すと録画を停止します。プレス"ファイル |名前を付けてビデオを保存します。

6. ビデオ追跡とデータ解析

  1. ビデオを追跡するのにトラッキング ソフトウェア (動画 2) FlyStepsを使用します。
    1. "FlyTracker"フォルダー内の"configuration_file.ini"を開きます。
    2. "Video_folder"のビデオの場所と"video_files"のビデオの名前を設定します。
    3. "Arena_settings"に基づくで飛ぶアリーナの罫線を指定 (x, y) アリーナの端に複数のポイントのピクセル座標です。
    4. "Led_settings"に基づくに示す赤色 Led の場所を指定 (x, y) Led の中心の位置のピクセル座標です。
    5. "Arena_settings"、「保存」をクリックし、ターミナルでスクリプトを実行するのに「デバッグ」を設定することによって"true"に飛ぶアリーナの境界線の位置を確認します。ビデオの画面キャプチャは、"arena_settings"の入力座標によって形成される青い四角形が表示されます。
      注: この広場を囲む領域を追跡します。
    6. "False""arena_settings"、「デバッグ」に変更、「保存」をクリックして、端末の画面を実行してもう一度。
      注: 追跡プロセスが起動します。
      注: ハエは温水のアルミのリングを追跡領域外歩くことができます。これはその後ハエが温水のリングに触れることを停止し、追跡領域内部に残って、実験の最初の数秒間の間に起こる。
      注: ビデオは実験者の好みに合わせて他のトラッキング ソフトウェアを追跡できます。
  2. 使用 (x, y) 温性能の関心の単位を計算するトラッキング ソフトウェアによって提供される各場の場所。カスタム スクリプト (e.g。、 FlyStepsAnalysis 補助で) 使用することができます。
  3. 繰り返し測定 (RM) 分散分析 (ANOVA) と非定型の統計ソフトウェアを使用して複数の比較を使用してさまざまな飛行グループの温度性能曲線を比較 (材料の表を参照してください)。

アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。

結果

温度制御アリーナ (図 1 a) は温度はプログラマブル回路を個別に制御することができます銅の 3 つのタイルから成っています。各銅のタイルでは、プログラマブル回路にフィードバックを与える温度センサーを所有しています。回路は、各タイルの温度が上昇するため電源をアクティブにします。受動的な熱電変換素子は、一定の冷却ファンにより冷却ヒートシンクを提供しながら、所望の温度を維持するために一定に加熱要素として機能します。温度変化の大きさは、非線形の方法でプロセスの速度を決定します。2 の ° C の増加が必要なだけ 0.1 s、および 18 の ° C の増加が必要です 4 s。プログラマブル回路 (図 1) に接続されている画面各タイルの温度センサーで測定した温度のユーザーに通知します。銅のタイルは、常に周囲の半導体 (図 1 bと1 C) 50 ° C に加熱、アル...

アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。

ディスカッション

ここで私たちは、自動温度制御アリーナ (図 1) 時間と空間で正確な温度変化を生成するを発表しました。このメソッドを使用する (図 2および図 3) 温度の漸進的な増加を事前にプログラムだけでなく飛ぶアリーナの各タイルが加熱した動的温度課題にも個々 のショウジョウバエの露出異なる温度を独立して (図 4および図 5)。

温度制御されたアリーナは、加熱プロセスに革新的なアプローチを使用します。伝統的な方法で使用される熱電ペルチェ加熱要素を介してタイルの温度変化を作成する代わりに銅タイルと銅の質量を暖める温度制御アリーナを現在使用して、ハエは、上部に配置されます。銅の質量は、ファンに接続されているヒートシンク ブロックによって常に冷却されま...

アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。

開示事項

著者は、彼らは競合する金銭的な利益があることを宣言します。

謝辞

この作品に支えられ一部奨学金行動とフローニンゲン大学と国立ナシオナル デ サイエンス y メキシコからテクノロジー (CONACyT) から大学院奨学金の認知神経科学プログラムから付与されたアンドレアソト-padilla さん、Hedderik ・ ファン ・ レインとジャン-クリストフ ・ Billeter に与えられる時間の調査のためのジョン ・ テンプルトン財団からの助成金。FlyStepsラッカーの開発の彼の参加のためピーター ゲリット Bosma に感謝しております。

補足情報として、以下の一時、公開リンクでスクリプトTemperaturePhases、FlySteps、およびFlyStepAnalysisを見つけることができます。
https://dataverse.nl/privateurl.xhtml?token=c70159ad-4d92-443d-8946-974140d2cb78

アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。

材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
ArduinoArduinoA000062ソフトウェアRUG
エレクトロニクスボードRuijsinkダイナミックエンジニアリングFF-Main-02-2014
電源ブーストXP-パワー48。V 65 WECS65US4853 ボルトに設定
電源タイル暖房XP-Power 15.V 80 WVFT80US15
電源冷却XP-Power 15.V 130 WECS130U515
ペルチェ素子マーローインダストリーRC12-42 素子、制御された DC フィード
ヒートシンクフィッシャーテクニックLA 9/150-230V振動のために分離
温度センサー測定の専門分野MCD_10K3MCD1 マイクロサーミスタプローブ
銅ブロック/タイルRuijsink ダイナミックエンジニアリングFF-CB-01-2014
AuminumリングRuijsinkダイナミックエンジニアリングFF-RoF-02-2015
サ4104ホワイトテープ25 x 66 mmRSコンポーネント111-2300 白色導電性テープ
赤色LEDラッキーライトll-583vc2c-v1-4da波長 625 nm、20 mAmp、6 V 温
白色LEDストリップLedstripkoningHQ-3528-SMD60 LEDs/メートル
スイッチ電源汎用T-36-12
Logitech c920Logitech Europe S.APN960-001055
QuickTimeプレーヤーアップルコンピュータ録音プログラム
トラッキング解析ソフトウェアRパッケージ: pacman
トラッキング解析ソフトウェアMATLAB
サーマルイメージングFLIR T400sc
グラフと統計ソフトウェアグラフパッド プリズム
SigmacoteSigma-AldrichSL2-100MLシリコン化剤
フライ飼育ボトルフライスタッフ32-1306オンス ショウジョウバエストックボトル
フライパッドフライスタッフ59-114
フライ飼育バイアルドミニク・ダッチャー789008ショウジョウバエチューブ 狭い 25x95 mm
インキュベーター三洋MIR-154
磁気ホットプレートハイドルフ505-20000-00MR ヘイスタンダード
寒天カルディック 成分B.V.さん010001.26.0
グルコースGezond&wel1019155デキストロース/Druivensuiker
ショ糖Van Gilseニュー糖
コーンミールフライスタッフ62-100
小麦胚芽Gezond&wel1017683
大豆粉フライスタッフ62-115
糖蜜フライスタッフ62-117
活性ドライイーストレッドスター
テゴセプトフライスタッフ20-258100%
によるのズ テ培地 グラ

参考文献

  1. Abram, P. K., Boivin, G., Moiroux, J., Brodeur, J. Behavioural effects of temperature on ectothermic animals unifying thermal physiology and behavioural plasticity. bioRxiv. , (2016).
  2. Rajpurohit, S., Schmidt, P. S. Measuring thermal behavior in smaller insects: A case study in Drosophila melanogaster demonstrates effects of sex, geographic origin, and rearing temperature on adult behavior. Fly. 10 (4), 149-161 (2016).
  3. Jezovit, J. A., Levine, J. D., Schneider, J. Phylogeny environment and sexual communication across the Drosophila genus. The Journal of Experimental Biology. 220 (1), 42-52 (2017).
  4. Sinclair, B. J., Williams, C. M., Terblanche, J. S. Variation in Thermal Performance among Insect Populations. Physiological and Biochemical Zoology. 85 (6), 594-606 (2012).
  5. Gibert, P., Huey, R., Gilchrist, G. Locomotor performance of Drosophila melanogaster: Interactions among developmental and adult temperautures, age, and geography. Evolution. 55 (1), 205-209 (2001).
  6. Trotta, V., et al. Thermal plasticity in Drosophila melanogaster: A comparison of geographic populations. BMC Evolutionary Biology. 6, 1-13 (2006).
  7. Klepsatel, P., Gálikova, M., De Maio, N., Huber, C. D., Christian, S., Flatt, T. Variation in thermal performance and reaction norms among populations of Drosophila melanogaster. Evolution. 67 (12), 3573-3587 (2013).
  8. Latimer, C. A. L., Wilson, R. S., Chenoweth, S. F. Quantitative genetic variation for thermal performance curves within and among natural populations of Drosophila serrata. Journal of Evolutionary Biology. 24, 965-975 (2011).
  9. Chen, J., Nolte, V., Schlotterer, C. Temperature-related reaction norms of gene expression: Regulatory architecture and functional implications. Molecular Biology and Evolution. , (2015).
  10. Kellermann, V., Overgaard, J., Hoffmann, A. A., Flojgaard, C., Svenning, J. -C., Loeschcke, V. Upper thermal limits of Drosophila are linked to species distributions and strongly constrained phylogenetically. Proceedings of the National Academy of Sciences. 109 (40), 16228-16233 (2012).
  11. Andersen, J. L., Manenti, T., Sørensen, J. G., Macmillan, H. A., Loeschcke, V., Overgaard, J. How to assess Drosophila cold tolerance: Chill coma temperature and lower lethal temperature are the best predictors of cold distribution limits. Functional Ecology. 29 (1), 55-65 (2015).
  12. Krstevska, B., Hoffmann, A. A. The effects of acclimation and rearing conditions on the response of tropical and temperate populations of Drosophila melanogaster and D. simulans to a temperature gradient (Diptera: Drosophilidae). Journal of Insect Behavior. 7 (3), 279-288 (1994).
  13. Frank, D. D., Jouandet, G. C., Kearney, P. J., Macpherson, L. J., Gallio, M. Temperature representation in the Drosophila brain. Nature. 519 (7543), 358-361 (2015).
  14. Gallio, M., Ofstad, T. A., Macpherson, L. J., Wang, J. W., Zuker, C. S. The coding of temperature in the Drosophila brain. Cell. 144 (4), 614-624 (2011).
  15. Hamada, F. N., et al. An internal thermal sensor controlling temperature preference in Drosophila. Nature. 454 (7201), 217-220 (2008).
  16. Ni, L., et al. A gustatory receptor paralogue controls rapid warmth avoidance in Drosophila. Nature. 500 (7464), 580-584 (2013).
  17. Liu, W. W., Mazor, O., Wilson, R. I. Thermosensory processing in the Drosophila brain. Nature. 519 (7543), 353-357 (2015).
  18. Neely, G. G., et al. TrpA1 Regulates Thermal Nociception in Drosophila. Public Library of Science ONE. 6 (8), e24343(2011).
  19. Zhong, L., et al. Thermosensory and non-thermosensory isoforms of Drosophila melanogaster TRPA1 reveal heat sensor domains of a thermoTRP channel. Cell Reports. 1 (1), 43-55 (2012).
  20. Barbagallo, B., Garrity, P. A. Temperature sensation in Drosophila. Current Opinion in Neurobiology. 34, 8-13 (2015).
  21. Tang, X., Platt, M. D., Lagnese, C. M., Leslie, J. R., Hamada, F. N. Temperature integration at the AC thermosensory neurons in Drosophila. Journal of Neuroscience. 33 (3), 894-901 (2013).
  22. Petavy, G., David, J. R., Gibert, P., Moreteau, B. Viability and rate of development at different temperatures in Drosophila: A comparison of constant and alternating thermal regimes. Journal of Thermal Biology. 26 (1), 29-39 (2001).
  23. Diegelmann, S., Zars, M., Zars, T. Genetic dissociation of acquisition and memory strength in the heat-box spatial learning paradigm in Drosophila. Learning & Memory. 13 (1), 72-83 (2006).
  24. Zars, M., Zars, T. High and low temperatures have unequal reinforcing properties in Drosophila spatial learning. Journal of Comparative Physiology A: Neuroethology, Sensory, Neural, and Behavioral Physiology. 192 (7), 727-735 (2006).
  25. Zars, T., Wolf, R., Davis, R., Heisenberg, M. Tissue-specific expression of a type I adenylyl cyclase rescues the rutabaga mutant memory defect: in search of the engram. Learning & Memory. 7 (1), Cold Spring Harbor, NY. 18-31 (2000).
  26. Jones, M. A., Grotewiel, M. Drosophila as a model for age-related impairment in locomotor and other behaviors. Experimental Brain Research. 46 (5), 320-325 (2011).

アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。

再版と許可

このJoVE記事のテキストまたは図の再利用許可をリクエスト

許可をリクエスト

タグ

関連記事