空間と時間の温度変化に対応したショウジョウバエのパフォーマンスを決定する自動化された方法

温度が一定の環境要因の生物機能し、¹を動作に影響を与えるです。緯度や高度の違いは、生物が、温度^2,3への応答に対する進化的選択の結果にさらされている気候の種類の違いに します。⁴自分の特定の環境下でのパフォーマンスを最大化する形態学的、生理学的なおよび行動の適応によって異なる温度に応答する生物。例えば、ミバエショウジョウバエのさまざまな地域からの人口がある異なる温度の設定、本体サイズ、発達度、長寿、多産、歩行性能別温^{2 ,5,6,7}。異なる起源のハエとの間観察された多様性は遺伝的変異とプラスチック遺伝子式^8,9によって部分的に説明されます。同様に、さまざまな分野からショウジョウバエ種温度勾配の間で異なる配布し、極端な暑さと寒さテスト^10、11,12に抵抗性の差異を表示します。

ショウジョウバエも最近温度知覚^{13,14,15,16,17}の遺伝学的および神経の基礎を理解するための好みのモデルとなっています。成虫が温度を感知するアンテナの冷・温の周辺温度センサーと温度センサー脳^13,14,,1516を通して広く、^,17,18,19,20. 高温下に末梢受容器表現Gr28b.d¹⁶または発熱²¹周囲中冷たい受容器はBrivido¹⁴によって特徴付けられます。脳の温度はTrpA1¹⁵を表現するニューロンによって処理されます。これらの経路の突然変異体の行動研究は温度の処理方法の私達の理解を改善しているし、さまざまな地域からショウジョウバエの個体数によって異なるメカニズムに洞察力を与えます。

ここで高速かつ正確な温度変化を生成する温度制御のアリーナをについて説明します。捜査済み人手を介さず標準化され、再現性のある温度を操作することができますこれらの変更プログラムできます。ハエは記録および実験の異なるフェーズでその位置と速度を決定するための特殊なソフトウェアを使用して追跡。このプロトコルで主な測定は各温度下での歩行速度である個々 の熱的適応性⁵を識別できる生理学的な性能の生態学的関連性の高いインデックス。温度受容体変異体と共にこの手法は細胞および生化学的レベルでの温度適応のメカニズムを明らかにすることができます。

1. はえの食糧媒体の作製

1. 2 L ガラス ビーカーに水道水 1 リットルを注ぎ、電磁攪拌棒を追加します。沸騰の温度に到達するまで、300 ° C で磁気ホット プレートにビーカーを置きます。
2. 500 発/分に攪拌し、以下を追加します: 寒天 10 g、ブドウ糖 30 g、15 g のショ糖、コーンミールの 15 g、小麦胚芽の 10 g、きなこ 10 g、糖蜜の 30 g と 35 g アクティブな乾燥酵母。
3. ミックスは精力的に発泡するとき、は、攪拌を続けながら 120 ° C にホット プレートの温度を下げてください。
4. 10 分後にホット プレートの温度をさらに 30 ° C までを切り、ミックスは 48 ° C に冷却するまで攪拌を続行ビーカーの壁に触れることがなく直接食品に温度計を挿入することによって温度を測定します。
5. 96% エタノール 10 mL に p ヒドロキシ安息香酸メチルエステルの 2 g を溶解し、ミックスは、一緒に 1 M プロピオン酸 5 mL を加えます。3 分間攪拌を続けます。
6. ホット プレートの電源を切り、飼育ボトルと 6.5 mL コレクション バイアルに食品に食品の 45 mL を注ぐ。

2. ハエの準備

1. 場所 20 男性および 20 雌飛ぶ飼育びんはえの食糧媒体の 45 mL を含みます。ダウンそれらをタップして新鮮なボトルにそれらをタップし新しいボトルに 3 〜 4 日後のハエを転送します。3 つの変更後のハエを破棄します。
   1. 25 ° C の一定温度で 12 h 光/12-h 明暗周期下インキュベーター中ボトルを配置します。
      注: ハエの新世代は、10 日後 eclose になります。
2. 最大 4 分の二酸化炭素パッドこのハエを新しく麻酔し、絵筆を使ってはえの食糧媒体の 6.5 ml 2.5 × 9.5 cm 飛ぶ飼育瓶でそれらを収集します。
   1. 唯一の童貞でハエを収集、飼育バイアルあたり 20 ハエのグループにセックスでそれらを区切ります。
   2. 5-7 日、ハエに新しいバイアルごとに 2-3 日間の実験の前に、の日に変更するためのインキュベーター内バイアルを配置します。

3. ライトのフレーム

1. 厚さ 0.5 センチ、高さ 4 センチ、幅 4 cm 長さ 10 cm の木枠を作る。
2. 短い辺のそれぞれで、4 cm の長さ、高さ 4 センチ、幅 1.5 cm 幅の内部の方の枠を作成する木製フレームの領域。国境開放内部の顔をまま。
3. 直径 0.5 cm 短い端の境界線のそれぞれ、1 つの木製のフレームの長い端の交差点の 2 つの穴をドリルします。
4. 各微小エッジの枠線の内側の暖かい白色 LED ストリップの場所 10 cm。すぐに場所に接着する LED ストリップの背中の皮をむきます。
   注: 暖かい白色 LED ストリップを赤外線 LED に置き換えることが排除される照明ニーズの実験用ストリップします。
5. スイッチング電源、LED ストリップの反対側の境界線上にもう一方の端にボーダーの 1 つの LED ストリップの 1 つの端を接続します。
6. 両方の LED ストリップがオンになったことを確認するスイッチング電源をオンにします。
7. 紙の白い部分とそれぞれの国境の開放側をカバーします。
8. 長い辺の内部フェーズのそれぞれに紙の別の部分に接着します。

4. 低温アリーナ

1. 温度制御アリーナ (図 1 a 1 C) をオンにします。ファンが実行を開始、アルミのリングは、ウォーミング アップを開始を確認します。
2. 温度シーケンスTemperaturePhasesスクリプトを実行する制御コンピューターに温度管理されたアリーナを接続するのに USB ケーブルを使用します。
3. 制御コンピューターのTemperaturePhasesスクリプトを開き、(ビデオ 1) 温度シーケンスが正しく設定されていることを確認します。
   1. 各実験段階の期間 60 に設定されていることを確認"par を確認することによって s.StimulusDur「である 60 s。
   2. 1) 数に等しい必要数段階、2) 反復オン/オフ発光ダイオード (Led)、段階ごとの 3) 2 ° C 温度上昇を示す赤ランプのセットアップの開始温度として 4) 16 ° C が"開始実験の下ですべて正しいことを確認します。ブロック"セクション。
      注: は、最初の実験段階 (図 2) で速度の人工増加を避けるためには 16 ° C で 7 分間飛ぶアリーナに順応するハエを許可します。
   3. TemperaturePhasesスクリプトを実行します。ソフトウェア初期化を 5 秒間どおりに「アリーナ。"待機して停止します。
   4. ハエが飛ぶアリーナ (ステップ 5.3) に吹き飛ばされている一度実験フェーズの実行を開始するキーボードのスペースバーを押します。
      注: TemperaturePhasesは、ボックスを制御する現在のスクリプトしかし、さまざまな実験の条件に調整するこのデバイスを使用するその他のカスタム スクリプトを作成することが可能です。
4. カメラの USB ケーブルを使用して記録コンピューターに競技場の上にカメラを接続します。
5. ビデオ録画プログラムを開く (材料の表を参照) を選択して記録コンピューターで「ファイル |新しい動画撮影」。カメラからイメージを表示する画面が開きます。
   1. カメラの画像キャプチャ アリーナと示す赤色 Led のすべての端することを確認します。
   2. ライトのフレームを設定する (ステップ 5.4) アリーナの周りにカメラ画像を表示画面の下端の中央にある赤いボタンを押すと録音を開始します。
      注: 照明の小さな変化追跡の精度に影響することができます。装置の位置を固定することによって低温アリーナの照明を一定に維持することをお勧めします。

5. 温度行動実験

1. 飛ぶアリーナ (図 1) を準備します。
   1. すべてのエッジが覆われていることを確認、銅のタイルの上に白の導電性テープの鎖を場所します。
   2. 銅のタイルの周り温水アルミのリングを配置します。リングのエッジは銅のタイルの周りを完璧にフィットし、ので、それは常に同じ場所に配置されます。
   3. クリーンな組織とガラスのカバーをきれいにし、ハエで吹き飛ばされることがギャップを残して、アルミのリングの上に置きます。
      注: 実験前に滑りやすいサーフェスを作成する反応剤とガラスのカバーをコートします。24 h の反応剤を適用し、使用前に水ですすいでください。
2. TemperaturePhasesスクリプト (ステップ 4.3.3) を実行し、ビデオ録画プログラム (ステップ 4.5) を開きます。
3. 飼育バイアル (ステップ 2.2.2) から飛ぶアリーナに場を爆破 (e.g。、男性 1 が図 3に飛ぶ)。
   1. 2 回行き、底に口の吸引器と 1 つのフライ トラップし近く、バイアル、インキュベーターに戻し、強制的にそれをタップ、インキュベーターからハエの入った瓶を取る。
   2. ガラス カバーとアルミのリング (ステップ 5.1.3) との間に残されている隙間からアリーナでフライを置きます。
   3. ハエが飛ぶアリーナに導入されてすぐにアルミのリングの端に達するまで、ガラス カバーを押すことによってガラス カバーとアルミのリング間のギャップを閉じます。
4. 対称照明を確保するためアリーナの周りのライトのフレームを配置します。
   1. マークの場所 (e.g。、永久的なマーカーを使用して) 飛ぶアリーナ (図 1) フレームは常に同じ場所に配置ことを確認するの周りのフレームの。
5. ビデオ録画プログラム (ステップ 4.5.2) と録音を開始し、実験段階 (ステップ 4.3.4) の実行を開始する制御コンピューターのキーボードの space キーを押します。
6. 結局のところ実験段階 .mp4 または .avi 形式でビデオを保存を行い、口吸引と飛ぶアリーナから場を削除します。
   注: 両方の示す赤色 Led がオフになっていることはTemperaturePhasesスクリプトの停止によって、実験段階の終わりを決定できます。
   1. 録画プログラム画面の下端の途中で停止ボタンを押すと録画を停止します。プレス"ファイル |名前を付けてビデオを保存します。

6. ビデオ追跡とデータ解析

1. ビデオを追跡するのにトラッキング ソフトウェア (動画 2) FlyStepsを使用します。
   1. "FlyTracker"フォルダー内の"configuration_file.ini"を開きます。
   2. "Video_folder"のビデオの場所と"video_files"のビデオの名前を設定します。
   3. "Arena_settings"に基づくで飛ぶアリーナの罫線を指定 (x, y) アリーナの端に複数のポイントのピクセル座標です。
   4. "Led_settings"に基づくに示す赤色 Led の場所を指定 (x, y) Led の中心の位置のピクセル座標です。
   5. "Arena_settings"、「保存」をクリックし、ターミナルでスクリプトを実行するのに「デバッグ」を設定することによって"true"に飛ぶアリーナの境界線の位置を確認します。ビデオの画面キャプチャは、"arena_settings"の入力座標によって形成される青い四角形が表示されます。
      注: この広場を囲む領域を追跡します。
   6. "False""arena_settings"、「デバッグ」に変更、「保存」をクリックして、端末の画面を実行してもう一度。
      注: 追跡プロセスが起動します。
      注: ハエは温水のアルミのリングを追跡領域外歩くことができます。これはその後ハエが温水のリングに触れることを停止し、追跡領域内部に残って、実験の最初の数秒間の間に起こる。
      注: ビデオは実験者の好みに合わせて他のトラッキング ソフトウェアを追跡できます。
2. 使用 (x, y) 温性能の関心の単位を計算するトラッキング ソフトウェアによって提供される各場の場所。カスタム スクリプト (e.g。、 FlyStepsAnalysis 補助で) 使用することができます。
3. 繰り返し測定 (RM) 分散分析 (ANOVA) と非定型の統計ソフトウェアを使用して複数の比較を使用してさまざまな飛行グループの温度性能曲線を比較 (材料の表を参照してください)。

温度制御アリーナ (図 1 a) は温度はプログラマブル回路を個別に制御することができます銅の 3 つのタイルから成っています。各銅のタイルでは、プログラマブル回路にフィードバックを与える温度センサーを所有しています。回路は、各タイルの温度が上昇するため電源をアクティブにします。受動的な熱電変換素子は、一定の冷却ファンにより冷却ヒートシンクを提供しながら、所望の温度を維持するために一定に加熱要素として機能します。温度変化の大きさは、非線形の方法でプロセスの速度を決定します。2 の ° C の増加が必要なだけ 0.1 s、および 18 の ° C の増加が必要です 4 s。プログラマブル回路 (図 1) に接続されている画面各タイルの温度センサーで測定した温度のユーザーに通知します。銅のタイルは、常に周囲の半導体 (図 1 bと1 C) 50 ° C に加熱、アルミのリングで囲まれます。このリングは、飛ぶアリーナ (図 1)、ハエを配置する領域のエッジを形成します。飛ぶアリーナは、ハエが歩くが、飛ぶことを保障する 3 mm 高空間を提供するシリコーン ガラス カバー (図 1 a 1 C) によって覆われています。飛ぶアリーナの横にあるさまざまな実験的段階をマークするようにプログラムすることができます 2 つの赤色 Led (図 1) にあります。たとえば、図 2 aに示すように結果を得るのため、各 LED が関連付けられている異なる温度図 2 b中、各 led 60 s。FlyStepsソフトウェアを示す Led のそれぞれが上と研究者は自動的に温度や時間に基づく実験的段階を決定するこの情報を使用できます、登録できます。

温度制御されたアリーナは、動的温度変化に異なる遺伝的背景からハエの行動応答を比較する使用できます。たとえば、異なる種からハエは熱的性能の違いを比較する (図 3) の温度を徐々 に公開できます。最大のパフォーマンス、それは虫歯や、死んだ後のポイントに到達するまで温度が上昇するにつれては、すべての種の速度。しかし、それぞれの種は、最大応答速度と熱許容範囲で特定の応答曲線を持っています。以前のレポートを示しているショウジョウバエ種から発生時期、長寿、多産、ボディサイズ、性的コミュニケーション、温度耐性3,6,7 の間で異なる ,8,22。したがって、仕事のこの身体を温度勾配で種特異的な歩行の私たちの説明を追加します。

エアコンの温度に基づいて実験への応答を探索する低温アリーナを使用もできます。このアプローチの最も単純な形式は、アリーナ ウォーミング アップされる側で、他の上の 1 つの側面を回避23,24,25を好むためハエが訓練されるオペラント条件づけパラダイムです。私たちは快適な 22 ° C (図 4) で、他のタイルを残しながら中高側タイルの 1 つに 40 ° C に個々 のはえをさらされます。野生型のハエはすぐにアリーナに沿って移動を停止し、快適な場所に残った。対照的に、古典的なメモリ変異体劣等生はアリーナを探索保持し、快適な場所にコントロールよりも少ない時間を費やしています。野生型のハエのパフォーマンスと劣等生の突然変異体の違いは、すべてのタイルは 22 ° C に設定され、試験治療グループ間比較を行ったときにより大きくなった。劣等生の突然変異体はまた、野生型ハエ (図 4) と比較してトレーニングとテスト段階の大きい違いを示した。これらの結果は、快適な場所で残りのメモリの効果をお勧めします。

温度と場所の組み合わせが動的温度変更時に異なる温度受容体の機能を理解するのに役立ちます。我々 は温度上昇への個々 のショージョーバエ ・ Gr28b.dとTrpA1GAL4変異体をさらされて (2 ° C 増加すべての 60 s) 22 ° C (図 5) での快適な場所を提供しながら。快適な場所は左から右へと逆に、イテレーションごと移った。結果は、温度上昇と快適な場所により多くの時間を費やすと、周囲温度受容体Gr28b.dの変異体がコントロールとして動作することを示す.ただし、脳温度受容体TrpA1GAL4変異体は、温度上昇の影響を受けません、アリーナ内の場所を変更しないでください。増加、 TrpA1GAL4変異体のカーブの減少になる前に快適で残ったがその段階ですでに快適な場所に座っていたハエで効果を示します。ピークの整合性とTrpA1GAL4の曲線の谷これらのハエがほとんど実験; のためにまだ残っていることを示唆しています。それ故に、彼らは常に彼らの場所が快適と見なされるものを数えられました。この結論は、記録されたビデオの視覚的検査によって確認されました。以前Gr28b.d17に依存しない高速かつ大規模な変更の周囲の認識を示唆する生理学的なレポートとハエがTrpA1 に基づいて検出温度に主要な中央メカニズムを所有しているこれらの結果のサポート 14,21。

図 1: 温度制御アリーナのダイアグラム。(A) 低温アリーナの側面の景色。プログラマブル回路は、加熱要素の温度を制御する銅のタイルの下に電源供給と温度センサーを接続します。タイルは常にファンに接続されているヒートシンクを介して冷却されます。周りにタイルは、ガラスのカバーがかかっている温水アルミニウム リング。(B) 熱セット 24 の ° C (上) および 30 ° c (下) 中央のタイルで 24 ° c 側タイルでタイルを示す画像します。(C) 競技場の平面図です。カメラは銅タイル、アルミニウム リングと赤色 Led を記録し、実験段階を自動的に決定します。カメラによって記録されない、[ボックスの隅に画面には、現在のタイルの温度が表示されます。(D) 光のリング: ホワイト ペーパーで覆われた木製の箱の中の 2 つの暖かい白の LED ストリップ アリーナ全体の定数、対称性の照明を確保します。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。

図 2: ハエは温度プロトコルを開始する前に、アリーナに順応する必要があります。(A) 単一の男性のハエはアリーナに導入され、その後温度を増やし始めた 1 分定数の 16 ° C で探検することが。(B) 16 ° C、20 ° C、または 24 ° C にさらされるハエの単一 (グループ違いはありません; 双方向分散 F (2,570) = 4.156, p = 0.162) 5 分後よりも実験の先頭に高い歩行がある (双方向 RM ANOVA F (9,570) = 7.803, p < 0.0001)。データは、平均と 20 処女雌成虫 5 〜 7 日古い複数日にわたるテストの平均値 (± SEM) の標準誤差です。印は群間で有意差 (* * * p < 0.0001;テューキーの多重比較検定、p = 0.05)。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。

図 3: 移動徐々 に温度にさらされる 5ショウジョウバエ属.温帯 (青)、熱帯 (赤) から個々 の男性が飛んできて、コスモポリタン (ブラウン)ショウジョウバエ種が増加する温度勾配にさらされた (2 ° C 毎の 60 s) 16 ~ 46 ° C最初の 7 分は 22 ° C でアリーナを探索するハエを許可するように常にだった。種が大幅に異なる (双方向 RM 分散 F(4,70) = p < 0.001 28.46)。(a)キイロショウジョウバエ(茶色; 円をいっぱい) は速く、アリーナに導入されました。(b) d. 町役場(赤; 空の正方形) 増加する温度と高速だった。(c) D. クニガミサンショウズル(茶色; 塗りつぶされた正方形) はその時点で最大のパフォーマンスの他の国際的なハエよりも遅くなります。(d) d. 菌(茶色; 空の円) + キイロショウジョウバエの最大の時点で崩壊だった。各ポイントは、15 男性ハエ 5 〜 7 日古い数日テストの平均値 (± SEM) を表します。意義が記号で示さ (♦ すべて、p < 0.0001; から違いを = †ショージョーバエ ・以外のすべての違いを = p < 0.0001; •ショージョーバエ ・から違いを = p < 0.01; ¢ショージョーバエ ・ p から違いを = <0.001;= p < 0.0001; 名前付きグループの違いテューキーの多重比較検定、p = 0.05)。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。

図 4: 温度制御されたアリーナはオペラント条件づけに使用できます。ショージョーバエ ・カントン S ひずみ (野生型; 黒ボーダー) dnc1 (劣等生; 赤い境界線) 変異体 (トレーニング、いや 4 分の 40 ° C に真ん中を温暖化後、反対側のタイル 22 ° C で横タイルを好む訓練を受けていたとパターン)。加熱された領域のメモリが 22 ° C (テスト; グリッド パターン) にすべてのタイルを設定することによってテストされます。ハエは、実験の半分に左上のタイルそして他の半分の右側のタイルを好む完備でした。パフォーマンスを比較するトレーニングとテスト中の 22 ° C でタイルの内部時間の合計の割合を測定しました。グループが大幅に異なる (一方通行 ANOVA F(3,76) = p < 0.0001 23.23)、劣等生を全面的に行って野生型よりも悪いと。データは、平均値 (± SEM) 20 処女雌成虫 5 〜 7 日古い数日テストのです。グループ間の差を示すアスタリスク (* * * p > 0.0001; * * * p > 0.001; * * p > 0.01;テューキーの多重比較検定、p = 0.05)この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。

図 5: 温度変異体の快適な場所を提供するとき温度の上昇に対する応答。温度変異体Gr28b.d (グリーン; 正方形) 対応コントロール (w1118黒; 円) 温度上昇として快適なエリアでの時間の割合を増やすことによって (双方向 RM ANOVA F (1,38) 0.5107、p = = 0.479)。TrpA1GAL4変異体 (黄色; 三角形) は、温度が上がるにつれて快適なエリアで時間が増加しないコントロール (w1118黒) と異なる (双方向 RM ANOVA F (1,38) 1.670、p = = 0.019)。データは、20 男性のハエ 5 〜 7 日古い数日テストの平均値 (± SEM) です。TrpA1GAL4とは大きく異なるGr28b.dと制御 (p < 0.05;テューキーの多重比較検定、p = 0.05)。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。

著者は、彼らは競合する金銭的な利益があることを宣言します。