炎症の好中球を介したイベントの検出で使用するムバーラク40ペプチド

サマリー

ここでは、固定/グリセリン組織学セクションで好中球の存在を検出し、ライブの精製された好中球の活性化状態を評価するためのプロトコルを提案する.特に、ムバーラク₄₀ペプチドは、ラクトフェリンの好中球固有および第三紀の顆粒に存在をバインドします。透過や好中球活性化を介して顆粒内容の暴露は、好中球のマーキングが可能です。

要約

ここでは、我々 はムバーラク₄₀, 好中球の特定、三次顆粒の高濃度に格納されているグリコ ラクトフェリンを結合する機能を有する合成ペプチドの使用を含むプロトコルを提供します。これが好中球活性化の解消の肉芽を試金する生細胞イメージングに使用ことができますどのように同様の固定/グリセリン体内好中球を染色する方法ムバーラク₄₀共役、fluorophore に直接このプロトコルの詳細を使用できます。好中球の検出方法は、種特異的なモノクローナル抗体、常に特定のアプリケーションに最適ではないに限定されます。ムバーラク₄₀が細胞膜に浸透していない、従って非-活性化/非-グリセリン好中球に格納されているラクトフェリンから除外されています。ムバーラク₄₀ことが複数の研究モデルを含む調査の結果を比較する場合に特に便利、広いホストの範囲からラクトフェリンを認識の利点は、重複する試薬の数を減らし、シンプルなプロトコルを通してシングル ステップの汚損。

概要

好中球は生得の免疫組織の主な武器の 1 つで、日常的に体の周りの炎症部位に補充されます。好中球の研究は、その短い寿命で体外(8 h 未満) と基底条件下または活性化後の限られた検出ツールで主に障害されています。ここでは、固定/グリセリン サンプルで哺乳類の好中球の広範かつ特定の検出のための十分にテストされたプロトコルを提案する.またムバーラク₄₀ライブ好中球の汚損のための詳しいプロトコルをいたします。ライブの好中球の汚損のプロトコルを使用して、タイミングおよび好中球活性化位置を特定することがことができます。このプロトコルは、好中球活性化または顆粒のリリースを勉強したい人に最適です。抗菌職務を超えて好中球は今病気と免疫応答 (生得および適応)^1,2の広い範囲で関与する免疫調節細胞として歓迎します。好中球が多数感染した組織、炎症性腫瘍³IBS とクローンの再燃⁴、およびリウマチ性関節炎 (関節液などの非感染性炎症の領域で、最も炎症性組織の存在RA) 患者⁵。好中球には、前もって形成された顆粒 azurophil (α)、特定 (β 1)、第三紀 (β 2) 顆粒、分泌小胞 (γ)⁶という名前の 4 つのクラスが含まれています。炎症性サイトに移行する時に採用した好中球がアクティブになり、順次募集をさらに促進しに貢献する顆粒内容 (接着、抗菌物質、免疫調節分子から成る) を分泌します。感染症 (だけでなく、ホスト組織の損傷) 解像度⁷。好中球を考慮しながらそこまでの生得の免除の重要な側面は、それらを勉強する利用可能ないくつかの検出試薬とさらに少ない使用できる生活好中球の活性化状態を評価します。

好中球を検出する現在の方法は Ly-6 G²や特に基底条件 (例えばミエロペルオキシダーゼの下で好中球の顆粒内のタンパク質などの細胞表面露出抗原に対して生成されたモノクローナル抗体に依存します。、ラクトフェリン)。モノクローナル抗体、その強い結合、感度、およびさまざまな試金の条件の下での汎用性をメリットします。ただし、特にモノクローナル抗体と抗-Ly-6 G を使用していくつかの欠点があります。これらの欠点は、Ly-6 G は骨髄と好酸球; を含むすべての顆粒球を骨髄細胞の大多数の存在、特異性したがって、このマーカーで好中球好酸球からの解読より多くの複合体アプローチ⁸必要があります。モノクローナル抗体の別の頻繁なトレードオフは、1 つ以上の動物種での比較研究を困難、多くの場合限られた宿主特異性範囲です。3 番目の抗体検出法、特に生きた細胞や生体内でを使用する場合の欠点は、細胞の機能を中断させたり、細胞の活性化につながる可能性です。たとえば、管理の対策-Ly-6 G マウスは一般的好中球減少と一時的な好中球減少症⁹に適用されます。さらに、抗体の注射が抗好中球¹⁰を促進することが実証されています。最後に、好中球の抗体の検出は、細胞の活性化状態を明らかにしません。

ムバーラク₄₀、アッセイのライブ好中球¹¹の活発化の状態と同様、生体外でまたは生体内での条件の下で好中球をラベルに試金の数に使用できると呼ばれる 40 アミノ酸ペプチドを同定しました。ムバーラク₄₀は、ムバーラク₇₀¹²、もともと粘液^13,14をバインドするには、その能力の説明乳酸菌ロイテリ表面粘液結合タンパク質のドメインから派生されます。ムバーラク₄₀は、好中球に固有、三次顆粒の高濃度で存在しているグリコ ラクトフェリンと対話します。これらの顆粒標準透過手順を病理組織学的または固定好中球の堅牢な染色 (FACS) プロトコルをソート蛍光活性化細胞に存在するムバーラク₄₀を公開できます。ライブの好中球を不活化状態で保持すると、ムバーラク₄₀ペプチド、顆粒内容から除外され、細胞では染色されない肯定的なマーカー。起動時に、ムバーラク₄₀は公開されているラクトフェリンにバインドし、ペプチドと堅牢な染色に 。したがって、ムバーラク₄₀は、それに感染プロセスに従うこと魅力的なマーカーを作る精製の好中球の活性化状態を確認する使用できます。活性化好中球をライブにバインドする機能ムバーラク₄₀ライブ動物モデル (例えば、マウス関節炎モデル¹⁵) における好中球炎症の領域を検出するツールとして使用することができます。好中球組織組織と体外ライブ浄化された好中球の活性化を試金する方法を明らかにするためどのように蛍光ラベル ムバーラク₄₀この原稿詳細にプロトコルを使用できます。

プロトコル

ここで説明するすべての方法が検討されており、配慮 (Comité デ凝ったクリニーク)、CPP (Comité デ保護デ Personnes)、CNIL フランス組織によって承認された (委員会国立情報学自動制御エ リベルテ)。

1. 染色による病理組織における好中球蛍光標識ムバーラク₄₀

1. 病理組織学のティッシュを得るためには、試料の厚みに応じて h 4 まで 4% パラホルムアルデヒド (PFA) 30 分間の適切な音量で生検/セクションを修正します。4 ° C の冷却装置で固定中にサンプルを配置します。
   注: 代替固定方法/タイミング置き換えることができますユーザーの独自のニーズに基づいて。
   1. PFA を削除、16% ショ糖溶液サンプルを完全に覆うに十分なボリュームを追加し、4 ° C 4 h まで一晩でサンプルを置きます。
   2. 16% ショ糖液を削除し、サンプルを完全にカバーする十分な音量で 30% ショ糖液を追加し、4 一晩まで h 4 ° C でそれを置きます。
   3. 30% ショ糖液を削除し、ペーパー タオルで組織から余分な溶液をしみ。最適な切削温度 (OCT) メディアにティッシュ セクションを配置、2 methylbutane (-72 ° C) エタノール ドライアイス浴で冷却で凍結。凍って (~ 2 分) 後、一度 2 methylbutane からブロックを削除し、すべてのブロックが終了し、長期的なストレージの準備ができてまでドライアイスを配置します。長期保存のための-80 ° C で冷凍ブロックを格納します。
2. 夜はティッシュのブロック カット、-80 ° C のフリーザーからそれらを削除し、平衡に一晩に-20 ° C でそれらを配置する前に。
   1. クライオスタットを使用して、OCT 埋め込まれたティッシュを 10-30 μ m の厚さにスライス カットし、高品質ガラスに吸着します。
      注: 厚いまたは薄いスライスは、実験の要件に応じて使用できます。
   2. ワックス ペン又は他の疎水性方法、スライド ガラスの組織スライスの周りにボックスを描画し、乾燥させます。
   3. ムバーラク₄₀縮尺希釈を行い染色液の準備-Cy5 (または他の蛍光ムバーラク₄₀バージョン、1 mg/mL 原液) 0.1% サポニン PBS 溶液。最適な最終ムバーラク₄₀濃度は、1 μ g/mL をする必要があります。
      注意: 最終濃度を使用することがあります (0.1 0.01 μ g/mL) が信号強度を低く可能性があります。
      注意: サポニン粉末は、呼吸刺激を引き起こすことができます。キャビネットまたは保護されたエリアにサポニンを比較検討することを確認します。トリトンなど代替の透過方法を使用できます。メーカー推奨濃度で追加マーカーを追加 (e.g。, 4 ', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) ファロイジン、蛍光抗体)。
   4. 優しく 3 回 0.1% サポニン-PBS のソリューションにスライド ガラスをディップします。
   5. 慎重にティッシュ セクションを離れて余分な液体をしみし、完全にティッシュ セクションをカバーする十分な染色液を追加します。蒸発を避けるために、室温で 1 時間インキュベート湿度チャンバーにスライドを配置します。それを光から保護してください。
   6. 0.1% サポニン PBS 溶液 3 にスライドを優しくディップ x。優しくディップ PBS 解決策 3 にスライド x。最後に、優しく蒸留 H₂O にスライドをディップ 3 x。慎重にスライドから余分な液体を乾燥させます。
   7. 組織スライスの横にある取付中 (20 mM トリス pH 8.0、N-プロピルガ レートを 0.5%、90% のグリセロール) の少量 (~ 20 μ L) を追加し、スライド ガラスの上にガラス基板をそっと置きます。ゆっくりと均等に、coverslip 組織切片にし、coverslip の縁を押し出しマウント メディアを丁寧にペーパー タオルを使用すると。
   8. 固化するメディアをマウントできるように 24 時間暗いキャビネットにマウントされたスライドを配置します。また、1 h の 37 ° C にマウントされたスライドを配置します。
3. 必要な獲得手法によると蛍光顕微鏡の組織スライスをイメージします。

2. レトロ Inverso ムバーラク₄₀による好中球活性化の可視化-Cy5 ペプチド

1. ひと好中球の次のプロトコルを使用してを取得します。以下のソリューションを準備し、無酸素キャビネット一晩で配置します。酸素への露出は、好中球をアクティブにし、さらに誘導細胞死^16,17に開始されます。
   注: 好中球がまた浄化される"ベンチ"にムバーラク₄₀-ラベル実験;しかし、酸素暴露が好中球活性化に影響を与える開始されます注意してください。
   1. 次のソリューションを準備します。
      解決策 1 [0.9% 塩化ナトリウム (NaCl)]: H₂o. フィルター ソリューションの 500 mL に塩化ナトリウムの 4.5 グラムを追加します。
      解決策 2 (デキストラン 6%): 100 mL に食塩 0.9% デキストランの 6 g を追加。
      解決策 3 (洗浄液): 2 mM の最終的な EDTA 濃度を PBS ph 7.2 エチレンジアミン四酢酸 (EDTA) を解散。使用前にすぐに最終的な BSA 濃度が 10 %w/v PBS/EDTA 溶液中のウシ血清アルブミン (BSA) を溶解します。
   2. 休憩をせずに 20 分間 650 x g で採血管を遠心分離します。
   3. 区切られた血を中断せず、採血管を 50 mL の円錐管に無酸素のキャビネットと収集プラズマ分数 (top) に転送します。
   4. 無酸素のキャビネットおよび 2,900 x g で血小板をペレットに改で 20 分間遠心からプラズマを含むチューブを削除します。
   5. 小球形にされた血小板を中断することがなく優しく無酸素キャビネットやピペットで移しなさい (以下、「プラズマ」と呼ばれる) 新鮮な 50 mL チューブに血小板貧しい血しょうに戻ってプラズマ チューブを転送します。
2. 白血球と赤血球の分離
   1. 2.1.3 ステップから赤い血球 (赤血球) を含むチューブを使用して。、50 mL のコニカル チューブ (5 血液コレクション チューブ内容 50 mL チューブあたり) に赤血球を組み合わせます。
   2. 総容積 44 mL に達するまで 0.9 %nacl を追加します。デキストラン 6% (最後) の 6 mL を追加します。
   3. 優しく 10-20 回チューブを反転による血液/デキストラン混合物を混ぜます。少なくとも 30 分管の堆積物をしましょう。
   4. 沈降が発生している間、パーコール液 4.2 mL を 15 mL の円錐管にプラズマの 5.8 mL に追加することによってパーコールを準備し、チューブを反転でよく混ぜます。
   5. ピペッティング赤血球を回避しよう、デキストランのトップ画分を収集します。
   6. スクリュー キャップを締めて無酸素商工会議所からデキストラン チューブを削除し、10 分休憩のため 300 x g でチューブを遠心分離します。
   7. 慎重にチューブに戻し無酸素商工会議所小球形にされた細胞を乱すことがなく、ピペッティングを介して液体を除去します。
   8. 優しく再プラズマの 1 mL の細胞ペレットを中断し、パーコール液の上部に非常にゆっくりと追加。上の細胞を分注するとき、層の混合を誘発しないように注意します。
   9. (混合を避ける) 無酸素商工会議所と休憩をせずに 20 分間 800 × g で遠心分離から Percoll ソリューション管を慎重に取り外します。末梢血単核球 (PBMCs) Percoll 溶液表面に残ります、好中球、赤血球とペレットします。
3. 赤血球の汚染除去
   1. 14 mL 洗浄液 14 mL に 700 μ L の PBS + 10 %bsa を追加することによって緩衝液を洗浄の準備をします。
   2. 無酸素の商工会議所にパーコール ソリューション管を配置します。ピペッティングでパーコールと PBMCs を取り外し、再洗浄緩衝液 1 mL に小球形にされた細胞を中断します。再浮遊するペレットでお越しの際にも汚染の赤血球のため赤い色。
   3. 再浮遊細胞に抗 CD235a (グリコフォリン) 磁気ビーズの 200 μ L を追加、優しくミックス、および最低 15 分間インキュベートします。この手順では、彼らは削除することができますようにマグネティック ビーズを用いて汚染の赤血球を読み込みます。
   4. 2 ml の洗浄分離カラムの洗浄バッファーの 3 倍。
   5. 分離カラムの下 15 mL コニカル チューブを押しながらゆっくりとピペットの列の上部に好中球/RBC 混合物。通過する 15 mL の円錐管の細胞を収集します。フローを通じて曇りし、赤血球の残りの列にバインドされているため、赤い色を失うしてください。
   6. 洗浄バッファーの列の上部に 2 mL を追加し、同じ 15 mL の円錐管に収集します。2 mL 洗浄末流れをはっきりすべき、すべての好中球が収集されていることを示します。
   7. 好中球の均一な分布を確保し、セルをカウントする 10 μ L を収集管を軽く混ぜます。目的を数えるセルの最終的なボリュームに注意してください。計数法の任意の標準セルとセルの合計数を列挙します。
   8. 無酸素のチャンバーから好中球のチューブを外し、休憩 20 分間 300 x g で好中球を遠心分離機します。
   9. 無酸素の商工会議所に戻し堆積好中球、ピペッティングを介して洗浄バッファーを削除します。10 の最大セル密度プラズマにおける好中球のペレットを再中断⁷ PMN/mL。
4. 精製された好中球とムバーラク₄₀を使用して可視化の列挙
   1. RI ムバーラク₄₀の 1 μ L を追加-cy5 の組合せ (1 mg/mL) フェノールレッドなしローズウェル公園記念研究所 (RPMI) 1640 培地 1 mL に。よくピペッティングで混ぜます。
   2. この議定書の目的のため強力な好中球の活性化試薬、N-formylmethionyl-ロイシル-フェニルアラニン (FMLP) が追加された場合、結果を概説されています。RPMI/RI-ムバーラク₄₀FMLP の 1 μ m を追加-Cy5 チューブとピペッティングを介してミックス上下。
      注: 各実験は取り上げられている質問によって異なります、この時点からになります。
   3. 転送 1 mL RPMI/RI-ムバーラク₄₀-ガラス底顕微鏡皿 Cy5/FMLP 混合物。この料理 10⁶総好中球に対応する浄化された細胞のボリュームを追加します。軽くピペッティングで混ぜます。
   4. 倒立蛍光顕微鏡に皿を置き、画像集録を開始します。たとえば、ベースライン FMLP や細菌など好中球活性化の試薬の付加の前に画像を取得することをお勧めします。この例では RPMI/RI-ムバーラク₄₀の集録を開始-Cy5/好中球と後で timepoint でピペットのガラス皿に好中球活性化試薬と画像の取得を続行します。
      注: これらの手順を変更するに基づいて行うことが科学的ニーズ。
   5. プロセスは、画像/タイムラプス ムービーとして使用される特定の顕微鏡に関係を取得しました。

結果

ムバーラク₄₀の結果-ステンド グラス組織病理スライドから通常、組織全体に散在する個々 のセルを明らかにします。ムバーラク₄₀汚れラクトフェリン、好中球の顆粒中に存在し、区分であります。したがって、通常見られる点状の汚れるか、または信号のいくつかの大規模な分けられた区域から来ている個々 の好中球 (図 1)。共同染色細胞とムバーラク₄₀信号をローカライズするために DAPI などの 2 番目のセル マーカーを追加することをお勧めします。検出されたセルの合計数は好中球ビューのフィールドの存在の数に依存し、劇的にソースと免疫反応の強さによって異なります。ここでは代表的な画像固定精製ひと好中球 (図 1A)、潰瘍性大腸炎患者 (図 1B) の組織生検から。また肺...

ディスカッション

ここでは、2 つのアッセイは、ムバーラク₄₀ペプチドが好中球の炎症と活性化を研究に使用されている説明します。ムバーラク₄₀ことができます明らかにする好中球病理組織学的セクションで提示またはライブ浄化された好中球を使用してのライセンス認証の状態を示す方法を紹介します。染色試薬としてムバーラク₄₀を使用するための重要なステップは、他の蛍光検出法と同じです。蛍光信号の互換性と背景の染色を削除する適切な洗浄のステップを撮影されていることを確保するため注意が必要があります。良好な染色結果を達成するために最も重要な考慮事項は、顕微鏡、ガラスのスライド/カバー スリップ、組織切片の品質です。精製された好中球のライブを表示するには、最も重要なステップは、浄化プロセス自体。好中球は敏感であり、異なる信号の数で実行可能となります。実験が意味のある結果を生成することを確保するために使用する準備ができるまで精製した好中球を非アクティブに保つために注意する必要があります。これは、酸素に好中球の露出を制限する無酸素商工会議所で好中球の浄化のプロトコルを実行することによって実現できます。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
MUB40-Cy5	Benoit Marteyn	benoit.marteyn@pasteur.fr	蛍光MUB40ペプチド(他の標識蛍光色素と併用可能)
RI-MUB40-Cy5	Benoit Marteyn	benoit.marteyn@pasteur.fr	Retro-inverso蛍光MUB40ペプチド。D-アミノ酸と合成され、プロテアーゼに耐性があります(他の共役蛍光色素で利用可能)
パルホルムアルデヒド	Sigma-Aldrich	16005	組織学用固定剤
ショ糖	Sigma-Aldrich	S7903	過剰なPFAを除去するために使用される溶液
最適な切断温度化合物(OCT)	Sakura Finetek USA	4583	クライオスタットセクショニング
2-メチルブタン	Sigma-Aldrich	M32631	クライオスタットの切片化前に組織を凍結するために使用
エタノール	Sigma-Aldrich	1.00974	組織を凍結するためのドライアイスバスに使用
ライカ クライオスタット	ライカバイオシステムズ	CM1520	組織を切片に使用
ガラス顕微鏡スライド	フィッシャーサイエンティフィック	12-518-101
カバースリップ	トールラボ	CG15CH	高精度カバースリップ
ダコペン	Sigma-Aldrich	Z377821	組織染色時の液量損失防止に使用
サポニン	Sigma-Aldrich	47036	IF染色用細胞の透過処理に使用
DAPI	Sigma-Aldrich	10236276001	DNAを染色
アレクサフルーア488ファロイジン	フィッシャーサイエンティフィ	A12379	アクチンを結合
金の褪色防止剤	フィッシャーサイエンティフィック	P36930	は、光退色に対するIF信号と耐性を延長
蛍光顕微鏡	様々な		IFスライドの画像化に使用
無酸素キャビネット	様々な		様々な 生きた不活化好中球の精製に使用されます
ナトリウムNaCL	Sigma-Aldrich	S7653
EDTA	Sigma-Aldrich	E9884	洗浄緩衝液成分
MACS BSA 緩衝液	Miltenyi Biotec	130-091-376	洗浄緩衝液成分
Percoll	Sigma-Aldrich	P4937	好中球精製のための勾配
CD235a グリコフォリン磁気マイクロビーズ	Miltenyi Biotec	130-050-501	汚染されたRBCsのLSのコラムを取除くのに使用
	Miltenyi Biotec	130-042-401	好中球からのRBCsの取り外しで使用され
Sigma-Aldrich	R8755	中球の研修のために使用されて	RPMI-1640

の前に組織を凍結するために使用されますックはし、を延長します します 塩化て フェノール 赤いなしで好