方法論記事

単一細胞解析、バイオ マーカー探索をシグナル蛍光セル バーコードとリン フローサイトメトリー

DOI：

10.3791/58386

⸱

2018年10月4日

1Centre for Molecular Medicine Norway (NCMM), Nordic EMBL Partnership, University of Oslo, 2K. G. Jebsen Centre for B cell malignancies and K. G. Jebsen Centre for Cancer Immunotherapy, University of Oslo

この記事について

サマリー

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ここでは、細胞レベルでのタンパク質のリン酸化イベントの媒体-高スループット分析のためのプロトコルが表示されます。リン フローサイトメトリーは、シグナル伝達異常を特徴付ける、識別およびバイオ マーカーの検証し、薬効学を評価する強力なアプローチです。

要約

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

異常な細胞シグナル伝達は、癌の発生と進展に中心的な役割を果たしています。最も新しい目標とされた療法は確かにタンパク質とタンパク質機能に向け、細胞シグナル伝達異常したがって個別の治療オプションを示すバイオ マーカーとして役立つかもしれない。DNA および RNA の解析ではなくタンパク質活性の変化はより効率的に薬剤感受性および抵抗性のメカニズムを評価できます。リン フローサイトメトリーは、細胞レベル、他の抗体に基づくアプローチからこのメソッドを区別する重要な特徴でタンパク質リン酸化イベントを測定する強力な手法です。メソッドは、複数のシグナル伝達タンパク質の同時解析できます。蛍光セル バーコードと組み合わせると、短い時間で標準の cytometer ハードウェアによって大きな - ハイスループット データ セットを取得できます。リン フローサイトメトリーは、基礎生物学の研究と臨床研究、信号解析、バイオ マーカーの探索と薬理学の評価などの両方のアプリケーションを持ってください。ここでは、例として慢性リンパ性白血病細胞を用いて精製した末梢血単核細胞のリン流れ解析のため詳細な実験的プロトコルが提供されます。

概要

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

リン フローサイトメトリーを使用して、単一セルの解像度でタンパク質リン酸化レベルを分析します。メソッドの全体的な目標は、指定された条件の下で携帯電話の信号パターンをマップすることです。フローサイトメトリーの多項目の能力を悪用し, 末梢血など異種細胞集団のさまざまなサブセットでいくつかのシグナル伝達経路を同時に分析できます。これらの特徴は、免疫組織化学、酵素免疫測定法 (ELISA)、蛋白質のアレイ、逆相蛋白質配列 (セルシグナル)1など他の抗体に基づく技術上の利点を提供しています。リン フローサイトメトリーの併用蛍光セル バーコード (FCB) を混ぜ合わせた、ステンド グラスおよび単一のサンプル2として分析できるように、個々 のセルのサンプルが蛍光染料の独特な特徴と分類されることを意味することができます。これは抗体の使用量を削減、コントロールと扱われたサンプルの組み合わせによるデータ保全性を向上、習得のスピードを向上します。合計 FCB 人口の小さいサンプルに分割および開始材料の量に応じて、最大 35 の異なるリン酸化型特異抗体で染色できます。大型プロファイル実験は、標準の cytometer ハードウェアで、それにより実行できます。リン フローサイトメトリーは、慢性リンパ性白血病 (CLL)3,4、

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プロトコル

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

血液サンプルは、すべてのドナーから次の書面によるインフォームド コンセントを受信しました。研究は、医療と健康研究倫理の南東ノルウェーの地域委員会によって承認された、人間の血液の研究はヘルシンキ宣言8に従って行われました。

注:手順 1-3 は、ティッシュ文化フードの無菌条件下で行わなければなりません。

1. 末梢血単核球 (PBMCs) CLL 患者の血液サンプルからの分離

注意: ヒトの血液バイオ セーフティ レベル 2 の規則に従って処理されます。

  1. 1:1 リン酸緩衝生理食塩水で血液を希釈 (PBS: 136.9 mM NaCl、KCl、2.7 mM 10.1 mM ナ2HPO4 x 2 H2O、1.8 mM KH2PO4、pH 7.4) と 50 mL チューブ (30 mL/チューブ) に移転。
  2. 10 mL のピペットを使用してチューブの底に層の密度勾配媒体 (例えばLymphoprep) 10 mL の慎重に。
  3. 800 x g で 4 ° C で 20 分間遠心PBMCs は密度勾配中のレイ....

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結果

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

図 1 aにリン流れの cytometry のプロトコルの主な手順を示します。提示の例では、CLL 細胞は 4 希釈でパシフィック ・ ブルー バーコード化試薬で染色しました。三次元バーコードは、図 1 bに示すように 3 つのバーコードの染料を組み合わせることで実行できます。個々 のサンプルは、各バーコード試薬対SSC A (図 1) にその後ゲートで、deconvoluted します。バーコード化試薬の詳細については、表 1に表示されます。

ここで説明する手順に従って、リン酸化蛋白質のレベルは B 細胞 CLL 患者と様々 な条件3の下で健常人で特徴付けられました。20 B.......

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ディスカッション

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

リン フローサイトメトリーは、単一細胞におけるタンパク質リン酸化レベルを測定する強力な手法です。メソッドは、抗体で染色に依存しているので、リン フローサイトメトリーは抗体の可用性によって制限されます。さらに、信頼性の高い結果を得るために全ての抗体滴定、使用する前に検証します。リン酸化型特異抗体の滴定のための詳しいプロトコルがされている12を他の場所で説明されています。パネルのデザイン、時に信号対雑音比の検討は重要です。提示の例では、全てのリン酸化抗体は Alexa Fluor 647 に共役しました。この蛍光の多い低対とサンプル間の最適な差動リン酸化蛋白質の高レベルを提供します。さらに、リン蛋白質の 1 つだけの色を使用して、他のチャンネルが残ります無料 FCB と表面マーカー染色します。このパネルのデザインは、リンのチャンネルに波及を低減します。同じ fluorophore に活用される全てのリン酸化抗体を持っていることによってデータ分析も簡単になります。

提示プロトコルで固定とセルの透過後すべての抗体染色を行った.......

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開示事項

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

著者は、何を開示します。

謝辞

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

この仕事は教授 Kjetil Taskén のラボで実施された、ノルウェーのがん社会と Stiftelsen クリスチャン ゲルハルト ・ Jebsen によって支持されました。原稿の批判的読解のヨハネス ・ Landskron とマリアンヌ Enger を認めた

....

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
RPMI 1640 GlutaMAXThermoFisher Scientific61870-010細胞培養培地
ウシ胎児血清ThermoFisher Scientific10270169細胞培養培地への添加物
ピルビン酸ナトリウムThermoFisher Scientific11360-039細胞培養培地への添加物
MEM 非必須アミノ酸ThermoFisher Scientific11140-035細胞培養液への添加物
LymphoprepAlere Technologies AS1114547密度勾配培地
Anti-IgMSouthern Biotech2022-01B細胞受容体の刺激用
BD Phosflow Fix Buffer IBD557870Fixation buffer
BD Phosflow Perm Buffer IIIBD558050透過化バッファー
Alexa Fluor488 5-TFPThermoFisher ScientificA30005バーコード試薬
Pacific Blue Succinimidyl EsterThermoFisher ScientificP10163バーコード試薬
Pacific Orange Succinimidyl Ester, Triethylammonium SaltThermoFisher ScientificP30253バーコード試薬
Compensation beadsDefined by userCorrect species反応性
ファルコンチューブ<em> ユーザー
エッペンドルフチューブ ユーザー
96ウェル V底プレート >フローサイトメーターと互換性
遠心分離機 ユーザーエッペンドルフチューブ、ファルコンチューブ、プレート
ウォーターバス ユーザー温度調整
フローサイトメーター ユーザーハイスループットサンプラー(HTS)付き
NameCompany>カタログ番号コメント
Antigen
AKT (pS473)Cell Signaling Technologies4075Clone: D9E
Reference:strong Myhrvold et al., 2018, Single cell profiling of phospho-protein levels in.., Oncotarget, 9(10):9273-9284
Parente-Ribes et al., 2016, Spleen tyrosine kinase inhibitors reduce…, 血液学、101(2):e59-62
Skånland et al., 2014, T-cell co-stimulation through the CD2 and CD28…, Biochem J, 460(3):399-410
Kalland et al., 2012, Modulation of proximal signaling in normal and transformed…, Exp Cell Res, 318(14):1611-9
ATF-2 (pT71)Santa Cruz Biotechnologysc-8398Clone: F-1
参照: Skånland et al., 2014, T-cell co-stimulation through the CD2 and CD28…, Biochem J, 460(3):399-410
Pollheimer et al., 2013, Interleukin-33 drives a proinflammatory endothelial…, Arterioscler Thromb Vasc Biol, 33(2):e47-55
BLNK (pY84)Beckton Dickinson Pharmingen558443Clone: J117-1278
参照: Myhrvold et al., 2018, Single cell profiling of phospho-protein levels in.., Oncotarget, 9(10):9273-9284
Parente-Ribes et al., 2016, Spleen tyrosine kinase inhibitors reduce…, Haematologica, 101(2):e59-62
Kalland et al., 2012, 正常および変換における近位シグナル伝達の調節…, Exp Cell Res, 318(14):1611-9
Myklebust et al., 2017, Distinct patterns of B-cell receptor signaling in…, Blood, 129(6): 759-770
Btk (pY223)/Itk (pY180)Beckton Dickinson Pharmingen564846Clone: N35-86
Reference: Myklebust et al., 2017, Distinct patterns of B-cell receptor signaling in…, Blood, 129(6): 759-770
Btk (pY551)Beckton Dickinson Pharmingen558129Clone: 24a/BTK (Y551) 
参考文献: Kalland et al., 2012, Modulation of proximal signaling in normal and transformed…, Exp Cell Res, 318(14):1611-9
Btk (pY551)/Itk (pY511)Beckton Dickinson Pharmingen558134Clone: 24a/BTK (Y551) 
Reference: Myhrvold et al., 2018, Single cell profiling of phospho-protein levels in.., Oncotarget, 9(10):9273-9284
Parente-Ribes et al., 2016, Spleen tyrosine kinase inhibitors reduce…, Haematologica, 101(2):e59-62
CD3ζ(pY142)ベクトン・ディキンソン・ファーミンゲン558489Clone: K25-407.69
Reference: Skånland et al., 2014, T-cell co-stimulation through the CD2 and CD28…, Biochem J, 460(3):399-410
Histone H3 (pS10)Cell Signaling Technologies9716Clone: D2C8
>Reference:
IκB&アルファ;Cell Signaling Technologies5743Clone: L35A5
Reference: Myklebust et al., 2017, Distinct patterns of B-cell receptor signaling in…, Blood, 129(6): 759-770
LAT (pY171)Beckton Dickinson Pharmingen558518Clone: I58-1169
Reference: Skånland et al., 2014, T-cell co-stimulation through the CD2 and CD28…, Biochem J, 460(3):399-410
Lck (pY505)Beckton Dickinson Pharmingen558577Clone: 4/LCK-Y505 
Reference: Myhrvold et al., 2018, Single cell profiling of phospho-protein levels in.., Oncotarget, 9(10):9273-9284
MEK1 (pS298)Beckton Dickinson Pharmingen560043Clone: J114-64
Reference: Myhrvold et al., 2018, Single cell profiling of phospho-protein levels in.., Oncotarget、9(10):9273-9284
Skånland et al., 2014, T-cell co-stimulation through the CD2 and CD28…, Biochem J, 460(3):399-410
NF-κB p65 (pS529)Beckton Dickinson Pharmingen558422Clone: K10-895.12.50
Reference: Myhrvold et al., 2018, Single cell profiling of phospho-protein levels in.., Oncotarget, 9(10):9273-9284
Skå, 2014, T-cell co-stimulation through the CD2 and CD28…, Biochem J, 460(3):399-410
Kalland et al., 2012, Modulation of proximal signaling in normal and transformed…, Exp Cell Res, 318(14):1611-9
Pollheimer et al., 2013, Interleukin-33 drives a proinflammatory endothelial…, Arterioscler Thromb Vasc Biol, 33(2):e47-55
NF-κB p65 (pS536)Cell Signaling Technologies4887Clone: 93H1
Reference: Myhrvold et al., 2018, Single cell profiling of phospho-protein levels in.., Oncotarget, 9(10):9273-9284
Skå, 2014, T-cell co-stimulation through the CD2 and CD28…, Biochem J, 460(3):399-410
Kalland et al., 2012, Modulation of proximal signaling in normal and transformed…, Exp Cell Res, 318(14):1611-9
p38 MAPK (pT180/Y182)Cell Signaling Technologies4552Clone: 28B10
参照: Myhrvold et al., 2018, Single cell profiling of phospho-protein levels in.., Oncotarget, 9(10):9273-9284
Skånland et al., 2014, T-cell co-stimulation through the CD2 and CD28…, Biochem J, 460(3):399-410
Pollheimer et al., 2013, Interleukin-33 drives a proinflammatory endothelial…, Arterioscler Thromb Vasc Biol, 33(2):e47-55
p44/42 MAPK (pT202/Y204)Cell Signaling Technologies4375Clone: E10
参考文献: Myhrvold et al., 2018, Single cell profiling of phospho-protein levels in.., Oncotarget, 9(10):9273-9284
Parente-Ribes et al., 2016, Spleen tyrosine kinase inhibitors reduce…, Haematologica, 101(2):e59-62
Skå, 2014, T-cell co-stimulation through the CD2 and CD28…, Biochem J, 460(3):399-410
Kalland et al., 2012, Modulation of proximal signaling in normal and transformed…, Exp Cell Res, 318(14):1611-9
Pollheimer et al., 2013, Interleukin-33 drives a proinflammatory endothelial…, Arterioscler Thromb Vasc Biol, 33(2):e47-55
p53 (pS15)Cell Signaling TechnologiesNNClone: 16G8
Reference: Irish et al., 2007, Flt3 Y591 duplication and Bcl-2 overexpression…, Blood, 109(6):2589-96
p53 (pS20)Cell Signaling TechnologiesNNClone: Polyclonal
参考文献: Irish et al., 2007, Flt3 Y591 duplication and Bcl-2 overexpression…, Blood, 109(6):2589-96
p53 (pS37)Cell Signaling TechnologiesNNClone: Polyclonal
Reference: Irish et al., 2007, Flt3 Y591 duplication and Bcl-2 overexpression…, Blood, 109(6):2589-96
p53 (pS46)Cell Signaling TechnologiesNNClone: Polyclonal
Reference:strong Irish et al., 2007, Flt3 Y591 duplication and Bcl-2 overexpression…, Blood, 109(6):2589-96
p53 (pS392)Cell Signaling TechnologiesNNClone: Polyclonal
Reference: Irish et al., 2007, Flt3 Y591 duplication and Bcl-2 overexpression…, Blood, 109(6):2589-96
PLCγ2 (pY759)Beckton Dickinson Pharmingen558498Clone: K86-689.37
Reference: Myhrvold et al., 2018, Single cell profiling of phospho-protein levels in.., Oncotarget, 9(10):9273-9284
Myklebust et al., 2017, Distinct patterns of B-cell receptor signaling in…, Blood, 129(6): 759-770
Rb (pS807/pS811)Beckton Dickinson Pharmingen558590Clone: J112-906
Reference:strong Myhrvold et al., 2018, Single cell profiling of phospho-protein levels in.., Oncotarget, 9(10):9273-9284
Pollheimer et al., 2013, Interleukin-33 drives a proinflammatory endothelial…, Arterioscler Thromb Vasc Biol, 33(2):e47-55
S6-Ribos. Prot. (pS235/236)Cell Signaling Technologies4851Clone: D57.2.2E
Reference:strong Myhrvold et al., 2018, Single cell profiling of phospho-protein levels in.., Oncotarget, 9(10):9273-9284
SAPK/JNK (pT183/Y185)Cell Signaling Technologies9257Clone: G9
Reference: Myhrvold et al., 2018, Single cell profiling of phospho-protein levels in.., Oncotarget, 9(10):9273-9284
Pollheimer et al., 2013, Interleukin-33 drives a proinflammatory endothelial…, Arterioscler Thromb Vasc Biol, 33(2):e47-55
SLP76 (pY128)Beckton Dickinson Pharmingen558438Clone: J141-668.36.58 
Reference: Skånland et al., 2014, T-cell co-stimulation through the CD2 and CD28…, Biochem J, 460(3):399-410
STAT1 (pY701)Beckton Dickinson Pharmingen612597Clone: 4a 
Reference: Myhrvold et al., 2018, Single cell profiling of phospho-protein levels in.., Oncotarget, 9(10):9273-9284
Myklebust et al., 2017, Distinct patterns of B-cell receptor signaling in…, Blood, 129(6): 759-770
STAT3 (pY705)Beckton Dickinson Pharmingen557815Clone: 4/P-STAT3
Reference: Myhrvold et al., 2018, Single cell profiling of phospho-protein levels in.., Oncotarget, 9(10):9273-9284
STAT4 (pY693)Zymed/ThermoFisher Scientific71-7900Clone: Polyclonal
Reference: Uzel et al., 2001, Detection of intracellular phosphorylated STAT-4 by flow cytometry, Clin Immunol, 100(3): 270-6
STAT5 (pY694)Beckton Dickinson Pharmingen612599Clone: 47/Stat5(pY694)
Reference:strong Myhrvold et al., 2018, Single cell profiling of phospho-protein levels in.., Oncotarget, 9(10):9273-9284
Skånland et al., 2014, T-cell co-stimulation through the CD2 and CD28…, Biochem J, 460(3):399-410
Myklebust et al., 2017, Distinct patterns of B-cell receptor signaling in…, Blood, 129(6): 759-770
STAT6 (pY641)Beckton Dickinson Pharmingen612601Clone: 18/P-Stat6
参照: Myhrvold et al., 2018, Single cell profiling of phospho-protein levels in.., Oncotarget, 9(10):9273-9284
SYK (pY525/Y526)Cell Signaling Technologies12081Clone: C87C1
Reference: Myhrvold et al., 2018, Single cell profiling of phospho-protein levels in.., Oncotarget, 9(10):9273-9284
Parente-Ribes et al., 2016, Spleen tyrosine kinase inhibitors reduce…, Haematologica, 101(2):e59-62
ZAP70/SYK (pY319/Y352)Beckton Dickinson Pharmingen557817Clone: 17A/P-ZAP70
Reference: Skånland et al., 2014, T-cell co-stimulation through the CD2 and CD28…, Biochem J, 460(3):399-410
Kalland et al., 2012, Modulation of proximal signaling in normal and transformed…, Exp Cell Res, 318(14):1611-9
Myklebust et al., 2017, B細胞受容体シグナル伝達の明確なパターン…, ブラッド、129(6):759-770
によって定義<あり によって定義

参考文献

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Lu, Y., et al. Using reverse-phase protein arrays as pharmacodynamic assays for functional proteomics, biomarker discovery, and drug development in cancer. Seminars in Oncology. 43 (4), 476-483 (2016).
  2. Krutzik, P. O., Nolan, G. P.

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