方法論記事

ホルマリン固定癌組織標本の腫瘍免疫研究の自動多重蛍光パネル

DOI：

10.3791/58390

⸱

2019年1月21日

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1Laboratory of Pathology, MedImmune, 2Laboratory of Pathology, MedImmune, 3Akoya Biosciences Inc., 4Department of Translational Molecular Pathology, University of Texas - MD Anderson Cancer Center

この記事について

サマリー

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詳細なプロトコル 6 マーカー多重蛍光パネルの最適化し、実行より一貫した結果と手続き時間の短縮のため自動着色剤を使用しています。このアプローチは、腫瘍免疫研究のあらゆる研究室で直接対応できます。

要約

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免疫腫瘍で継続的な発展には、癌免疫学のメカニズムの理解は深まるが必要があります。ホルマリン固定のパラフィン埋め込まれた (FFPE) 生検から組織サンプルの immunoprofiling 解析は、腫瘍免疫の複雑さを理解し、がん免疫療法の新規予測バイオ マーカーの発見のための重要なツールになりました。組織の Immunoprofiling 解析では、腫瘍微小環境における炎症性細胞の亜集団と免疫チェックポイントを含む結合のマーカーの評価が必要です。新規多重免疫組織化学的手法の出現 1 つティッシュ セクションのより効率的な役立つ multiparametric 分析標準 monoplex 免疫染色 (IHC) よりもできます。1 市販多重蛍光抗体法 (IF) 法はパスチラミドシグナル信号増幅に基づくし、マルチ スペクトル顕微鏡による分析と組み合わせる組織における多様なマーカーの良い信号分離できます。この方法は、標準の IHC FFPE 組織サンプルでの最適化された非標識一次抗体の使用と互換性があります。ここ述べる多重ができる自動プロトコル PD L1 で構成される 6 マーカー多重抗体パネルと癌組織サンプルのラベルする場合 PD 1、CD68、CD8、Ki 67、および 4 ' と AE1/AE3 サイトケラチン 6-diamidino-2-phenylindoleとして細胞核対比染色。多重パネル プロトコルは染色時間が手動の議定書のより短いと直接適用でき、人間 FFPE 組織サンプルでの腫瘍免疫研究のすべての研究室捜査官適応自動 IHC 着色に最適です。いくつかのコントロールと最適化と手法の検証に役立つ新しい多重の場合パネルの細かい品質制御ドロップ コントロール メソッドを含むツールがまた説明されます。

概要

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免疫腫瘍学研究、特に発見と臨床試験1 のコンテキストでの癌免疫療法の新規予測バイオ マーカーの検証のために不可欠なコンポーネントとなっている FFPE 腫瘍組織サンプルの Immunoprofiling 分析 ,2。ジアミノベンジジンなど化学色原体を使用して、発色の IHC 病理生検組織3の反応の標準的な手法のままです。標準 IHC はがん組織 immunoprofiling、腫瘍関連リンパ球のサブポピュレーションとプログラムされた細胞死配位子 1 など免疫チェックポイントの発現レベルの評価 (PD L1)4 の定量などにも使用できます。 ,5。標準 IHC は限られた、しかし、ティッシュ セクションごとに 1 つだけ抗原のラベル付けできます。Immunoprofiling 研究は、通常いくつかのマーカーの組み合わせの式の解析を必要とするため複数の組織切片の染色標準 IHC の使用が必要になります, 各単一のマーカーの染色し、したがって、コア針生検など小さい組織サンプルの解析に大幅に制限されます。標準 IHC 法または PD L1、腫瘍関連マクロファージおよび癌細胞によって表現されるなど免疫チェックポイント マーカーよくの多様な細胞集団で行ったマーカーの評価のために制限されます。この制限は、標準 monoplex IHC の使用などのさまざまな細胞タイプ6によって表される IHC マーカーの定量分析のための病理学者によって報告されています。ちょうど少数の反応によって制限されているものの、標準 IHC monoplex 方法、7以上同じティッシュ セクションを表すの多様な塗装色原体の進歩を用いた多重発色 IHC 技術の開発マーカーも同じ細胞集団の同じ細胞内コンパートメントに発現するタンパク質の適切な評価のための重要な技術的な課題を提示。

多重の発色 IHC 法の制限と同様、臨床サンプルから組織の可用性に関する上記の注意事項は、腫瘍免疫研究に基づく多重化法の改良を開発する必要性に上昇を与えています。蛍光標識は、同じスライドから複数の同時の信号を分離することができます効果的にシステムをイメージングと組み合わせます。このような手法の 1 つは、効率的な色分離8のマルチ スペクトル顕微鏡イメージングと組み合わせるパスチラミドシグナル信号増幅 (TSA) に基づいています。市販の TSA ベース キット採用 fluorophores マルチ スペクトル イメージング8用に最適化 (材料の表を参照してください)。このシステムの重要な利点は、検証および標準的な発色 IHC9,10,11用に最適化された同じ非標識一次抗体との互換性です。これは、新しいターゲットを組み込む最適化とパネルの変更で高速化だけでなく、柔軟性をことができます。Monoplex からの簡単な転送を可能にする、自動化された市販の IHC 着色システムのための多重蛍光 (mIF) TSA メソッドの最適化さらに、mIF に発色 IHC。

ここで腫瘍免疫研究に基づいている mIF パネル自動 mIF TSA 染色とイメージングのための多重分光スキャナーを使用してプロトコルを提案します。このプロトコルは、適応および記述されている計測・試薬へのアクセスを持つ研究室ユーザで変更できます。プロトコルには、癌の immunoprofiling の六つの一次抗体のパネルが含まれています: PD-L1、PD 1、CD68 (パン ・ マクロファージ マーカー) として、CD8 (T 細胞傷害性細胞)、キ-67 と AE1/AE3 の同定に上皮性マーカーとして使用 (汎サイトケラチン、癌細胞)。最近の研究では、染色12多重化を検証するための標準の参照として発色 IHC を使用して手動 TSA mIF プロトコルの最適化について説明します。自動着色剤、また染色の一貫性を向上させながら 14 時間 3-5 日から染色時間を飛躍的に短縮で最適化された市販の七色の TSA キットを使用して更新されたメソッドここで紹介をしました。ここで示した詳細な主なプロトコル、に加えて補足資料セクションには「ドロップ コントロール」法、最適化ためのテクニカル ノートと同様、新しい mIF パネルを評価する追加の品質管理プロセスが含まれていますトラブルシューティング、およびセットアップおよびカスタマイズされた mIF パネルの mIF TSA メソッドを最適化する研究所ユーザーを支援する新しい多重パネルの開発。

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プロトコル

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注:ここで提示されたプロトコル 6 抗体の TSA を使用して mIF パネルの immunoprofiling を実行する方法を説明します (キ67、CD68 PD L1、PD 1、CD8、AE1/AE3) 自動着色に (材料の表を参照してください)。プロトコルも新しい mIF パネルの品質管理のコントロールをドロップを実行する方法を説明します (補足資料を参照してください)。このプロトコルでは、ヒト扁桃 (肯定的な制御) から 8 つの無染色 FFPE スライドとひと肺腺癌からの 8 つの無染色スライド染色が行われます。最初のスライドは、すべての六つのマーカー、一次抗体が利用されていません、アイソタイプ コントロールの 2 番目のスライド (補足資料参照) ドロップ コントロールの残りの 6 つのスライドと染色完全多重化に使用されます。組織の自家蛍光の追加コントロールを強く推奨し、多重で常に含まれる必要があります研究 (補足資料を参照してください)。ただし、捜査官は、他の腫瘍のタイプと自分のプロジェクトの目標によるとコントロールを使用できます。MIF TSA 法と多重分光スキャナー技術以前の経験のない研究室ユーザーの多重 IHC 開発ガイドを参照 (利用できるオンラインで http://info.perkinelmer.com/2016-lp-Opalassaydevelopmentguide-lp)。このガイドでは、手動のプロトコルについて説明します、染色法 mIF へのよい紹介もあります。このプロトコルで採用されているすべての組織切片は、匿名化され、ヘルシンキ宣言に従って承認されました。

1. 組織サンプル

  1. ヒト扁桃の FFPE サンプル肯定的な制御および PD L1 知られている FFPE ひと肺腺癌サンプルとして使用されるリンパ様過形成を含むを選択正。腫瘍の存在を確認する選択した肺がんブロックのヘマトキシリンとエオシン (H & E) スライドを確認します。これは非特異染色を高める可能性があります、腫瘍壊死の豊富な地域を避けるために重要です。
    注:この最適化のため 10 年以上保存されているパラフィン ブロックを使わないとパラフィン ブロック (組織の技術者と相談) で乾燥した外観を持つ組織。
  2. 各ブロックからの 10 の連続した連続切片、厚み 4 μ m カット、ミクロトームを使用しています。IHC、スライドごとに 1 つのセクションに対して使用する正荷電ガラス スライド上のセクションをマウントします。
    注:しわは、染色のアーティファクトを生成する可能性がありますので、しわがなく完全に平坦のセクションをマウントしなければなりません。番号を 1 から 10 まで連続切片のスライド。
  3. 最初のセクションに新しい H & E スライドを準備します。残りのブロックで扁桃組織や肺腫瘍の存在を確認する病理学者の助けを借りて、H & E のスライドを確認します。
    注:その後、マルチ スペクトル解析と表現型解析のための関心領域の選択と、この H & E のスライドができます。
  4. 3ヶ月までの 4 ° C でプラスチック製のスライド ボックスで無染色のセクションを保存します。

2. 新しい mIF 自動着色に染色プログラムの作成: 試薬の登録

注:試薬は、プロトコルで使用できる前に自動着色ソフトウェアで試薬リストに追加する必要があります。自動着色モデルおよびソフトウェアのバージョンについては材料の表を参照してください。

  1. 自動着色ソフトウェア内で試薬] タブをクリックします。新しい試薬を指定する追加をクリックします。名 (など、「520 TSA 試薬」) と最大 8 個の文字があることを指摘し省略名 (例えば、"520 TSA") を入力します。ドロップ ダウン メニューから補助的な選択し、仕入先を設定します。シングル/シーケンシャル DSから、シングル/ダブル染色を変更しないでください。汚損のプロトコルプロトコル Fにデフォルトを設定します。ER120 デフォルト HIER のプロトコルを設定します。
  2. 新しい試薬と手順 2.1 すべて試薬の表 1に記載されている節約します。

3. 自動着色: コンテナーの登録

  1. 各コンテナーの側に使用する試薬の名前を書きます。側のバーコードをスキャンします。ポップアップ ウィンドウで、リストから正しい試薬を選択します。有効期限の日付を選択し、保存します。
  2. 表 1に示すすべての試薬の 3.1 の手順で手順を繰り返します。
  3. オープンな研究キットを登録します。キットの側面両方のバーコードをスキャンし、に従って、画面に表示されます。名前のキット「多重の研究キット 1.」1 x tris (ヒドロキシメチル) アミノメタン (トリス) の登録-このキット (表 1) の一部として緩衝生理食塩水。

4. 自動着色: mIF プロトコル ・ プログラムの作成

  1. 基本多重プロトコルは新しい自動方向づける (テーブルの材料モデルとソフトウェアのバージョンを参照してください) にオパール 7 多重名前でプリロード済です。プロトコル画面に「推奨」の代わりに「すべての」フィルター プロトコルを探します。基本プロトコルが存在しない場合は、製造元に問い合わせると自動着色ソフトウェアを更新します。
  2. すべての変更は、元のプロトコルのコピーで行われなければなりません。変更を行う前にオリジナルを保存し、[プロトコル] タブをクリックすると、[オパール 7 多重プロトコルを右クリックし、コピーを選択してコピーを作成します。
  3. 7 多重プロトコル 1新しいウィンドウで名前を変更し、正しいデバイス (床のモデルまたは卓上型) に関連付けられているタブを選択します。補足テーブル S1のプロトコルと一致します。追加試薬10 分ペルオキシダーゼ阻害ステップ (標準プロトコルの一部ではない) を追加し、試薬としてペルオキシダーゼ阻害剤を選択するをクリックします。
  4. ブロックの手順が PKI のブロック バッファーを利用することを確認します。二次抗体の手順利用 HRP ポリマーとそのスペクトル 4 ', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) マルチ スペクトル オートメーション キットに付属の利用、各一次抗体が適切な試薬を指すことを確認します。プロトコル画面のドロップ ダウン メニューの各それぞれステップに指定されている試薬をチェックしてすべての選択肢を確認します。

5. 自動着色: ドロップ コントロール、およびアイソタイプ コントロール プロトコルの追加

  1. 名前7 多重プロトコルの 1をコピーし、 1 CD68 ドロップ 7 多重プロトコルに変更します。マウス IgGにCD68 抗体試薬を変更し、プロトコルを保存します。
  2. 同じ方法で、各ドロップ コントロールのと (適切なアイソタイプに全ての抗体を変更) 完全なアイソタイプ コントロール用の六つのより多くの新しいプロトコルを作成します。

6. 自動着色: スライドの準備のプロトコル

  1. Prestaining プロトコルをコピー * 焼くし、Dewax マルチ スペクトルを焼くと Dewax 2 hこのプロトコルの名前を変更します。
  2. 表 2に示す試薬を一致するようにプロトコルを調整します。60 ° C で 2 時間焼くスライド30 dewax s 72 ° C で

7. 自動着色: 試薬の調製

  1. 1 つの研究の検出キットを準備します。1 試薬の塗り 30 mL オープン コンテナー 1 x TBS と 1 x 含有トリス緩衝生理食塩水 (TBS) のマークし、この研究検出キット指定研究用マルチプレックス キット (ハンドル) から最も遠い位置 1 で見つけるのでこのキットに恒久的に関連付けられてある必要があります。1. この試薬研究キットに恒久的に関連付けられるし、将来使用するための位置を変更する必要があります。
  2. 30 mL の 2 つのオープン コンテナーマルチ スペクトルのブロックおよびマルチ スペクトル セカンダリにラベルを付けます。30 ml のブロック バッファー/抗体希釈マルチ スペクトルの染色キットからのスペクトルのブロックコンテナーを入力します。30 ml のマルチ スペクトルの染色キットからアンチ mouse/抗うさぎ抗体ポリマーのスペクトル セカンダリコンテナーを入力します。
  3. 10 7 mL オープン容器を準備します。マイクロリットルの必要量は 600 + (150 × [スライド番号])。それぞれの抗体は、この場合 (6 扁桃および六つの肺) で 12 枚のスライドに適用されます。ラベル付けとボリュームのすべてのコンテナーは、表 3に示されます。
  4. 各抗体チューブ最初追加抗体希釈のボリュームに集中して一次抗体に続いて、表 3に示されています。穏やかなピペッティングで混ぜます。
  5. DAPI、ダブル蒸留水の 1 ミリリットルあたり DAPI 集中の 4 滴を使っての 7 mL オープン コンテナーを準備します。16 の合計は DAPI で染色される (600 + [150 x 16] = 3,000 μ L)。コンテナーに二重蒸留水 3 mL プラス スペクトル DAPI の 12 滴を追加します。新鮮な DAPI を実行するたびに備えます。
  6. ペルオキシダーゼ阻害剤を 7 mL オープン コンテナーを準備します。すべての 16 のスライドはペルオキシダーゼ阻害剤と扱われます (600 + [150 x 16] = 3,000 μ L)。ペルオキシダーゼ ブロックの 3 mL をコンテナーに追加します。
  7. Fluors の作業濃度を準備する前に、製造元から提供された各蛍光管にジメチルスルホキシドの 75 μ L を追加することによってすべての凍結乾燥 fluors を再懸濁します。ピペッティングで混ぜます。これは TSA 蛍光株式です。4 ° C でのストア
  8. 6 滴定の容器があり、各フローの 1 つを準備します。マイクロリットルの必要量は 350 + (150 × [スライド番号])。それぞれの蛍光は、この場合 (8 扁桃および 8 つの肺) の 16 のスライドに適用されます。ラベル付けとボリュームのすべてのコンテナーは、表 4に示されます。
  9. すべての試薬が登録されて、準備、ラックの任意の位置に各コンテナーを配置し、自動着色にすべての試薬を読み込みます。プローブは、各試薬の量を確認します。

8. 自動着色: サンプル セットアップとマルチ スペクトル染色

  1. 自動着色ソフトウェアで、画面の上部にスライド セットアップをクリックします。追加研究をクリックします。検査の ID、試験名、コメントとポップアップ ウィンドウを作成します。
    1. ドロップ ダウン リストから染色の実行を行う研究者の名前を選択します。150 μ Lでディスペンス ボリュームを残します。選択マルチ スペクトル Dewax の準備のプロトコルのため。[Ok] 追加のスライドをクリックします。下のコメント、入力「123 abc 肺 1 多重化」。示されているように、以下のフィールドを完了:組織の種類= テスト組織;ディスペンス ボリューム= 150 μ L;染色モード= 単一ルーチン;マーカー = ネガティブ染色=「7 多重プロトコル 1」; を入力準備= マルチ スペクトル焼く Dewax 2 h;HIER = HIER ER1 で 20 分。
  2. 追加スライドをクリックし、コメントやドロップ コントロールのスライドと、アイソタイプ コントロール スライドを追加するプロトコルを変更します。研究にすべてのスライドを追加すると、追加のスライドウィンドウを閉じるし、ラベルを印刷します。各スライド上の適切なラベル領域にラベルを適用されます。
  3. 自動着色にラックを挿入し、トレイを下げる、正しい向きでカバー タイルを適用、ラックにスライドをロードします。デバイスのスライドのラベルをスキャンします。
  4. ときすべてのスライドと試薬がスキャンされ、測定します。実行ボタン (►) がアクティブになります。オスミウムは、不十分な試薬の分注量などのエラーを検出した場合、黄色の警告シンボルが影響を受けるトレイで表示されます。エラーが発生すると、警告の記号を右クリックし、エラーを解決します。
  5. すぐに染色を開始またはスケジュール遅延開始。プロトコルは、期間約 14 時間です。注:プロトコルが染色の結果に影響を与える可能性過剰洗浄としてスライドをすぐに削除することができるときに完了を確認します。

9. マルチ スペクトルのスライドの Coverslipping

  1. 自動着色からスライドを削除し、1 で冠水したラックに保管 TBS. x
  2. 第 1.5 coverslips とマウント メディア (材料表を参照してください) の 15 μ L のサンプルをマウントします。ピペット チップの coverslip の優しく押すことによって任意の泡を削除します。
  3. 研究室のベンチに室温で一晩治すためスライドを許可します。未硬化のスライドは、慎重な取り扱いをすぐにスキャンできます。

10. 多重分光スキャナー

  1. 多重分光スキャナーとコンピューターの電源を入れます (モデルとソフトウェア情報の材料表を参照)。顕微鏡制御ソフトウエアを起動します。デバイスの前面にタッチ センサー式ボタンを押すことによって多重分光スキャナーの前面ドアを開きます。スキャナー内の各バネ付きキャリアは、4 つのスライドを保持しています。キャリアにすべてのスライドをロードし、デバイスにキャリアをロードする前に順序を記録します。
  2. プロトコル フィルターを編集を選択し、[新規]; をクリックしてくださいその後、多重パネル 1 とドロップ コントロールのプロトコル名を作成します。研究名多重パネル開発を作成し、プロトコルの作成をクリックします。概要スキャン フィルター DAPI;全体スライドをスキャンし、ピクセルの解像度 0.50 μ m (20 X)を選択します。すべてのフィルターとバンドを表現する必要があります。そうでない場合は、[フィルターの編集とバンド(DAPI、FITC、CY3、テキサス赤および cy5 の組合せ) の 5 つのフィルターをすべて選択、エクスポー ジャーの編集をクリックします。
  3. 肺腺癌における多重化とキャリアを選択することによってキャリアをロードします。グラフィック ユーザー インターフェイスを使用して正しいスライドを選択します。手動またはオート フォーカスを使用して、組織の焦点を当てます。許容可能な DAPI 染色の任意の領域に移動し、ミリ秒単位で露出を設定する自動公開をクリックして (0-2,000 ミリ秒)。
  4. 全体スキャンと MSI 地域の両方の列内のすべての 5 つのフィルター セットに同じ手順を繰り返します。必ず許容染色領域に移動し、フィルターと倍率ごとに露出を設定する前に、顕微鏡の焦点します。全体的なスキャン x 20 およびマルチ スペクトル イメージング (MSI) マルチ スペクトル領域 x 20 のすべての 5 つのフィルターの自動公開します。0.50 μ m (20 倍) のピクセルの解像度を選択します。プロトコルを保存し、戻ってベクトラ ソフトウェアのホーム画面に戻るをクリックしてくださいスライドのスキャンをクリックします。
  5. 各スライドのインターフェイスを開き、スキャンするタスクを設定します。多重パネル開発に研究を設定、多重パネル 1 とドロップ コントロール、プロトコルを設定、スライド IDを多重肺 ABC123、多重 CD68 ドロップ肺 ABC123など、.すべてのスライドがラベル付けされているし、タスク設定、スキャンをクリックします。自動多重分光スキャナーはすべて 5 つのフィルターを使用してすべてのスライドのスライドのスキャンを実行します。

11. 多重分光スキャナー: マルチ スペクトル イメージング

  1. スキャンが完了したら、 QPTIFFソフトウェア ("Phenochart") を開き、左上に負荷のスライド] をクリックします。5 フィルター全体スライド スキャンである、QPTIFF が表示されます。ユーティリティは限られているが、ティッシュの構造および広範な発現パターンが明らかと MSI の領域を選択する使用することができますので、各レイヤーは 1 つ以上の蛍光の情報を含みます。
  2. 移動し、左側のドロップ ダウン ツリーを使用して研究の正しいスライドを開きます。ログイン ユーザーの頭文字 (右上)。
  3. 画面の上部にスタンプツールを使用して、MSI の 5 つの領域を選択します。1 つが利用可能な場合は、病理医を参照してください。選択を、[選択取得;[フィールド サイズ] 選択1 x 1フィールド制限、 0.5 μ m (20 倍)を選択します。サイトケラチン (CK) (主に Cy5) 染色に基づいて、腫瘍 (CK +) と質 (CK-) 全体的なスキャンからイメージを作成するいくつかの領域を選択します。スライドごとにこの手順を繰り返します。
  4. すべての Msi を選んだら、 Phenochartソフトウェアを閉じ、ベクトラソフトウェアに戻ります。各スライドのスキャンからMSIにタスクを変更し、MSI のコレクションを実行するもう一度スキャンをクリックします。

12. スペクトル分離

注:スペクトルの分離手順チャネルセパレーションとスライドの画像解析のため必要です。通知ソフトウェアのスペクトル分離を実行すると、前に、スペクトル ライブラリは染色各弗素 DAPI と単独で肺腺癌のスライドを使用して構築する必要があります。この手順は、前述のマルチプレックス IHC アッセイ開発ガイドに説明されています。

  1. MSI の取得が完了したら、 MSIフォルダーのファイルを開くにスペクトルの分離 (「お知らせ」) ソフトウェアを使用します。これらのファイルは、.im3 のファイル種類の拡張子で終わる。
  2. [イメージ形式] 選択マルチ スペクトル;[サンプル形式、選択蛍光;スペクトル ライブラリのソースの下で通知を選択します。
  3. Fluors を選択するには、選択して搭載し肺腺癌ライブラリ スライド ライブラリからすべての六つの fluors と DAPI を読み込みます。すべての準備(左下) をクリックします。スペクトル分離ソフトウェアは提供したスペクトルのプロファイルを使用して、すべての開いている画像のスペクトル分離を実行します。
  4. 病理学者と同じ組織の連続スライドで同じターゲットの発色の単一汚れに対して染色パターンを評価します。

13. 蛍光強度と信号減衰の評価

注:小さな茶色のボックスを矢印として表示され、カウント ツール多重最適化のための最も重要なツールは、頻繁に使用する必要があります (補足資料を参照してください)。スペクトル分離ソフトウェアでカウント ツールを使用して、少なくとも 10:1 (トラブルシューティングやドロップ コントロールを使った染色多重の評価の補足資料を参照してください) を超えない信号対雑音比を評価します。

  1. 13.1、スペクトル分離ソフトウェアで開いているイメージのカウント ツールを従事し、各チャンネルの蛍光強度を評価するためにイメージを調査します。肺組織における目標強度は、10 と 20 の正規化数の間です。正規化されたカウント ツール、図 1に示します。
  2. 自家蛍光特性とターゲットを離れて染色が本格的な信号と競合しないように、任意のマーカーが 5 未満 10 未満か、通常信号領域数の最大信号数を持つスライドを除外します。
  3. 除外してスライドの最大カウント スペクトルからの出血や非効率的なスペクトル分離を避けるためには、チャネルの 30 を超える。
  4. アドレス ハイまたはローは、TSA の濃度を調整することによって数を正規化します。

14. マルチ スペクトル画像解析

  1. 1 つ以上の MSI をスペクトル分離ソフトウェアで開き、分離するためのみの fluors が少なくとも 1 つ開いているイメージで表されます。準備すべてスペクトル混じり気のない画像を生成するためのすべての現在開いているカラー画像を unmix をクリックします。
  2. 関心の領域を越えて舞うことによって各画像間で数を調査するためのカウント ツールを選択します。
  3. ビューのエディターを開くには目のアイコンを選択します。選択し、独立した各チャンネルのディスプレイの明るさを調整します。
  4. 構成組織分割、セル分割、表現、およびスコアリング モジュールを開くを選択します。これらのツールは、多重染色発色の単一汚れに対しての客観的検証に必要なし、定量的 phenoptic データ (図 S1) を生成する使用ことができます。
  5. さらに分析、アーカイブ、およびプレゼンテーション (図 S1) のグレースケール、蛍光を保存して [エクスポート] タブ、pathview スタイルの非圧縮 TIFF、および phenoptic 分析モジュールからデータ ファイルを使用します。

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結果

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ここで説明されているプロトコルは、図 2に示すような結果になります。表面扁平上皮で始まるへんとう腺コントロールの染色性を評価を開始します。扁桃サンプルの組織は、H & E のスライドを参考にして、病理医に確認できます。同じ組織ブロックの同じマーカーで発色 IHC セクションを実行すると場合、これらは密度と mIF のスライドの各マーカーの分布を確認する使用できます。扁桃組織が明確に定義された AE1/AE3 サイトケラチン染色扁桃表面扁平上皮を提供する必要があります図 2Aのように、(図 2A; 赤擬似カラーとしてラベル付け)、リンパで背景なし組織。染色すべき膜のアクセントと時折、細胞質と核を負の値にする必要があります。陰窩に単層上皮はサイトケラチン (赤) の PD L1 (

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ディスカッション

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継続的な癌免疫療法革命は開口部小説と有望な治療方法がん患者13。免疫腫瘍学の分野の進歩の炎症性の腫瘍微小環境、発癌に関与する免疫学的メカニズムの生物学を理解するだけでなく、新しい予測バイオ マーカーを見つけることも増加の知識が必要になります免疫療法を用いた治療法1,2。がん免疫の複雑な生物学による腫瘍組織サンプルの尋問は通常互いに相互作用し、1 体内の多様な細胞集団でよく行ったが、免疫マーカーの成長のリストを開発する必要 ,2,5。臨床試験は、通常コア針などを評価し、患者の応答を監視する療法のさまざまなポイントで収集された内視鏡下生検の結果、小さな生検を採用しています。このような生検組織数がん immunoprofiling を用いることができるティッシュ セクションの数が制限の限られた量...

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開示事項

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この作品は、MedImmune、グローバル バイオ医薬品 R & D アストラゼネカの腕によって支えられました。プレゼントをもらった、韓、c. w. パーキン エルマー試薬 (TSA キット) を生成してこの作品で使用されたマルチ スペクトルのスキャナーの従業員であります。修士課程修了、中啓、a. h. w. Z. C. バグナル、C ・ ブラウン、j. c.、アダムローリー、k. s.、原産地、J.R.C.、MedImmune の従業員持ち株会やストック利益またはアストラゼネカのオプション。

謝辞

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編集のサポートは、MedImmune のデボラ シュマンによって提供されました。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
「InForm 2.4.2」スペクトルアンミキシングおよび画像解析用ソフトウェアPerkinElmerCLS151066本文中「スペクトルアンミキシングソフトウェア」
Phenochart 1.0.9」 MSIの選択およびスライドスキャン全体の表示用QPTIFFソフトウェアPerkinElmerCLS151067テキスト#
1.5 CoverslipsSigma Aldrich2975246
200プルーフエタノールKoptecV1001
20xトリスバッファー生理食塩水VWRJ640-4L
抗体希釈剤DAKOS2203
抗CD68マウスモノクローナルDAKOM087601-2PG-M1
CD8ウサギモノクローナルタナM5392クローンSP239
CKマウスモノクローナルDAKOM351501-2クローン AE1/AE3
抗ki67 マウスモノクローナルDAKOM724001-2クローン MIB-1
抗PD-1 ウサギモノクローナル細胞シグナル#86163クローン D4W2J
抗PD-L1ウサギモノクローナルベンタナ790-4905クローン SP263
ボンド脱ロウ溶液ライカAR9222本文中では「脱ロウ溶液」と呼ばれ
ボンドエピトープリトリーバルソリューション1ライカAR9961本文中では「ER1」
ボンドエピトープリトリーブソリューション2ライカAR9640では「ER2」と呼ばれ
、30mLカOP309700テキストでは「30mLオープンコンテナ」と呼ばれ
、7mLカOP79193「7mLオープンコンテナ」と呼ばれていますテキストの「
」 ボンドポリマーリファイン検出ライカDS9800テキストでは「発色検出キット」と呼ばれ
ボンド研究検出キットライカDS9455テキストでは「研究検出キット」と呼ばれ
ボンド滴定キットライカOPT9049テキストでは「滴定キット」と呼ばれ
ボンドユニバーサルカバータイルノボカストラライカS21.2001本文では「covertiles」と呼ばれ
Bond Wash Solution 10X ConcentrateLeicaAR9590本文では「10x wash solution」と呼ばれ
BondRX AutostainerLeica本文では「automated stainer」と呼ばれ
BondRX Software Version 5.2.1.204Leicaでは「automated stainer software」と呼ばれ
Opal 7-Color AutomationIHC キットPerkinElmerNEL801001KT
ペルオキシダーゼ ブロックライカRE7101
ProLong Diamond 退色防止マウンタントサーモP36965テキストで「スライド マウンタント」と呼ばれる
Starfrost SlidesFisher15-183-51
Vectra Polaris マルチスペクトル顕微鏡 「Vectra 3.0.5」マルチスペクトル顕微鏡制御用ソフトウェアPerkinElmerCLS143455本文中では「顕微鏡制御ソフトウェア」と呼ばれ
「クローン抗ベン抗ていますと呼ばれています テキストライライています ています ています ています ています ています テキストています ています

参考文献

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Bethmann, D., Feng, Z., Fox, B. A. Immunoprofiling as a predictor of patient's response to cancer therapy-promises and challenges. Current Opinion in Immunology. 45, 60-72 (2017).
  2. Taube, J. M., et al. Implications of the tumor immune microenvironment for staging and therapeutics. Modern Pathology. 31 (2), 214-234 (2018).
  3. Idikio, H. A. Immunohistochemistry in diagnostic surgical pathology: contributions of protein life-cycle, use of evidence-based methods and data normalization on interpretation of immunohistochemical stains. International Journal of Clinical and Experimental Pathology. 3 (2), 169-176 (2009).
  4. Rebelatto, M. C., et al. Development of a programmed cell death ligand-1 immunohistochemical assay validated for analysis of non-small cell lung cancer and head and neck squamous cell carcinoma. Diagnostic Pathology. 11 (1), 95(2016).
  5. Parra, E. R., et al. Immunohistochemical and image analysis-based study shows that several immune checkpoints are co-expressed in non-small cell lung carcinoma tumors. Journal of Thoracic Oncology. 13 (6), 779-791 (2018).
  6. Rehman, J. A., et al. Quantitative and pathologist-read comparison of the heterogeneity of programmed death-ligand 1 (PD-L1) expression in non-small cell lung cancer. Modern Pathology. 30 (3), 340-349 (2017).
  7. Dixon, A. R., et al. Recent developments in multiplexing techniques for immunohistochemistry. Expert Review of Molecular Diagnostics. 15 (9), 1171-1186 (2015).
  8. Stack, E. C., Wang, C., Roman, K. A., Hoyt, C. C. Multiplexed immunohistochemistry, imaging, and quantitation: a review, with an assessment of Tyramide signal amplification, multispectral imaging and multiplex analysis. Methods. 70 (1), 46-58 (2014).
  9. Feng, Z., et al. Multiparametric immune profiling in HPV- oral squamous cell cancer. JCI Insight. 2 (14), (2017).
  10. Feng, Z., et al. Multispectral imaging of formalin-fixed tissue predicts ability to generate tumor-infiltrating lymphocytes from melanoma. Journal for ImmunoTherapy of Cancer. 3, 47(2015).
  11. Granier, C., et al. Multiplexed immunofluorescence analysis and quantification of intratumoral PD-1+ Tim-3+ CD8+ T cells. Journal of Visualized Experiments. (132), e56606(2018).
  12. Parra, E. R., et al. Validation of multiplex immunofluorescence panels using multispectral microscopy for immune-profiling of formalin-fixed and paraffin-embedded human tumor tissues. Scientific Reports. 7 (1), 13380(2017).
  13. Ribas, A., Wolchok, J. D. Cancer immunotherapy using checkpoint blockade. Science. 359 (6382), 1350-1355 (2018).
  14. Gorris, M. A. J., et al. Eight-color multiplex immunohistochemistry for simultaneous detection of multiple immune checkpoint molecules within the tumor microenvironment. Journal of Immunology. 200 (1), 347-354 (2018).
  15. Parra, E. R., et al. Effect of neoadjuvant chemotherapy on the immune microenvironment in non-small cell lung carcinomas as determined by multiplex immunofluorescence and image analysis approaches. Journal for ImmunoTherapy of Cancer. 6 (1), 48(2018).
  16. Rimm, D., Schalper, K., Pusztai, L. Unvalidated antibodies and misleading results. Breast Cancer Research and Treatment. 147 (2), 457-458 (2014).
  17. Baskin, D. G., Hewitt, S. M. Improving the state of the science of immunohistochemistry: the Histochemical Society's standards of practice. Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 62 (10), 691-692 (2014).
  18. Freedman, L. P., et al. The need for improved education and training in research antibody usage and validation practices. Biotechniques. 61 (1), Letter to the Editor 16-18 (2016).
  19. Hewitt, S. M. Reproducibility: it is just good science. Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 64 (4), 223(2016).
  20. Uhlen, M., et al. A proposal for validation of antibodies. Nature Methods. 13 (10), 823-827 (2016).

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