ここでは、急速に下流の並列 RNA 配列のため新鮮なまたは冷凍組織から高品質の核を分離するためのプロトコルを提案する.我々 オプションを含める洗剤機械と低張性機械組織破壊とセル換散の核の隔離のどちらも使用できます。
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この記事について
訂正のお知らせ
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サマリー
要約
個々 の細胞の遺伝子発現を調査セルの種類および細胞の同定ができます。単一細胞 RNA シーケンスは、中枢神経系など異種組織の特に細胞の転写プロファイルを勉強するための強力なツールとして浮上しています。ただし、セルを 1 つのシーケンスに必要な解離メソッドは、遺伝子発現と細胞死の実験的な変更につながることができます。さらに、これらのメソッドは、一般にアーカイブに関する研究とバイオ銀行材料が少なくて、新鮮な組織に制限されます。単一核 RNA シーケンス (Seq snRNA) は転写研究、それが正確に細胞の種類を識別する、冷凍または分離することは困難である組織の研究を許可を与えられた魅力的な代替され、解離による転写。ここでは、提案する下流 snRNA シーケンスの核の急速な隔離のための高スループット プロトコルこのメソッドでは、新鮮なまたは冷凍脊髄由来の核の隔離を有効にし、2 つの並列の液滴カプセル化プラットフォームと組み合わせることができます。
概要
神経系は、形態学的、生化学的、および電気生理学的特性の多様な配列を表示するセルの異種グループで構成されます。一括 RNA シーケンスは、異なる条件下での遺伝子発現の組織全体にわたる変更を決める際に有用されている、単一細胞レベルでの転写の変化の検出ができなくなります。単一細胞の転写解析における最近の進歩は、異種細胞の機能グループ分子をレパートリーに基づく分類を有効にし、最近活躍していたニューロンのセットを検出にも利用できます。1,2,3,4過去 10 年間単一細胞 RNA シーケンス (Seq-scRNA) の開発が有効に細胞タイプの多様にビューを提供する個々 の細胞における遺伝子発現の研究。5
超並列 scRNA-Seq などの拡張性の高いアプローチの出現は、中枢神経系の多くの地域を含むシーケンス異種組織のプラットフォームを提供しています。6,7,8,
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プロトコル
国立神経疾患と脳卒中動物ケアおよび使用委員会によって承認されたプロトコールに従ったすべての動物の仕事を行った。8 の間、男性と女性の ICR/CD-1 野生型マウスのサンプルを分散し、12 週古い、すべての実験に使用されました。マウスは、地域機関動物ケアおよび使用委員会ガイドラインに沿った処理必要があります。
1. 材料とバッファーの準備
- すべてのバッファー使用の日の準備し、事前氷で冷やします (表 1参照)。
- 洗剤機械換散を使用している場合は、洗剤の換散バッファー (> 500 μ L サンプルごと)、低糖バッファー (サンプルごとの > 6 mL)、ショ糖密度バッファー (> サンプルあたり 12.5 mL)、および再懸濁液 (> 1 mL) を準備します。
- 低張性機械換散を使用すると、低張性換散バッファー (サンプルごとの > 5 mL)、なして中 (サンプルごとの > 5 mL)、低糖バッファー (サンプルごとの > 3 mL)、ショ糖濃度バッファーを準備 (> サンプルあたり 12.5 mL)、および再懸濁液 (> 1 mL)。
- プロトコルを開始する直前に 25 mL の低糖バッファーと 25 mL のショ糖密度勾配バッファーに DTT の別の 25 μ L ジチオトレイトール (DTT) の 25 μ L を追加します。
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結果
ここでは、下流の並列 RNA シーケンスの成体マウスの腰椎脊髄から核の分離を行った。プロトコルは 3 つの主要なコンポーネントを関与する: 組織混乱と細胞換散、均質化、およびショ糖密度遠心分離 (図 1)。秒以内に、洗剤機械換散は細胞およびティッシュの残骸 (図 2 a, 表 2) と同様に、核の数が多いと原油の核の準備をもたらした。15 分後に、低張性機械換散はいた以下の残骸 (図 2 b, 表 2) も少ない核原油核の準備をもたらした。両方の準備は、均質化を施行した (図 2 とD) と 0.04 %bsa を PBS に再懸濁の前にショ糖密度勾配遠心法 (.......
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ディスカッション
このプロトコルの究極の目標は、下流の転写解析のための高品質の RNA を含む核を分離することです。我々 は、すべての脊髄の細胞型をプロファイルするために snRNA Seq メソッドを適応しました。当初、ことが判明した典型的な細胞解離方法ない単一細胞 RNA シーケンス、効果的な脊髄神経が細胞死を特に受けやすい。さらに、細胞解離手法は 100 倍までいくつかによるさまざまな活動とストレス応答遺伝子の発現を誘発します。3,4,16は、単一のセルの準備に関連付けられている欠点を与えられた、私たちと他の人が核の代替として使用します。16,17,18,24このメソッドは、冷凍脊髄組織を含む人間の組織にも使用.......
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開示事項
我々 は明らかに利害の対立があります。
謝辞
この作品は、NINDS イントラミュラル プログラムによって支えられた (1 ZIA NS003153 02) と NIDCD (1 ZIA DC000059 18)。C. ケーテ原稿を確認して、テクニカル サポートと有用な議論の c. i. Dobrott L. 李を感謝いたします。
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材料
| 名前 | 会社 | カタログ番号 | コメント |
|---|---|---|---|
| スクロース | Invitrogen | 15503-022 | |
| 1 M HEPES (pH = 8.0) | Gibco | 15630-080 | |
| CaCl2 | Sigma Aldrich | C1016-100G | |
| MgAc | Sigma Aldrich | M5661-50G | |
| 0.5 M EDTA (pH = 8.0) | Corning | MT-46034CI | |
| Dithiothreitol (DTT) | Sigma Aldrich | 10197777001 | 使用直前にDTTを追加 |
| Triton-X | Sigma Aldrich | T8787 | |
| ヌクレアーゼフリー水 | Crystalgen | 221-238-10 | |
| 1 M Tris-HCl (pH = 7.4) | Sigma Aldrich | T2194 | |
| 5 M NaCl | Sigma Aldrich | 59222C | |
| 1 M MgCl2 | Sigma Aldrich | M1028 | |
| Nonidet P40 | Sigma Aldrich | 74385 | |
| Hibernate-A | Gibco | A12475-01 | |
| Glutamax (100x) | Gibco | 35050-061 | |
| B27 (50x) | Gibco | 17504-044 | |
| 1x PBS | Crystalgen | 221-133-10 | |
| 0.04% BSA | New England Biolabs | B9000S | |
| 0.2 U/μL RNAse阻害剤 | Lucigen | 30281-1 | |
| オークリッジ遠心分離管 | Thermo Scientific | 3118-0050 | |
| 使い捨て綿栓ホウケイ酸ガラスパスツールピペット | フィッシャーサイエンティフィック | 13-678-8B | |
| ガラスティッシュドンス (2 mL) | Kimble | 885303-002 | |
| ガラス大クリアランス乳棒 | Kimble | 885301-0002 | |
| ガラス スモール クリアランス 乳棒 | Kimble | 885302-002 | |
| T 10 Basic Ultra Turrax Homogenizer | IKA | 3737001 | |
| 分散ツール (S 10 N – 5G) | IKA | 3304000 | |
| トリパン ブルーステイン (0.4%) | サーモフィッシャーサイエンティフィック | T10282 | |
| 40 μm細胞ス | トレーナーFalcon | 352340 | |
| MACS SmartStrainers、30 μm | Miltenyi Biotec | 130-098-458 | |
| コニカルチューブ | Denville Scientific | 1000799 | |
| Sorvall Legend XTR 遠心分離機 | サーモフィッシャー サイエンティフィック サイエンティフィ | サイエン | |
| ファイバーライト F15-6 x 100y 固定角ローター | サーモフィッシャー サイエンティフィ | 75003698 | |
| ステロジカルピペット: 5 mL、10 mL | デンビルサイエンティフィック | P7127 | |
| 血球計算盤 | Daigger Scientific | EF16034F | |
| Chemgenes バーコード | Chemgenes | Macosko-2011-10 | |
| RNaseZap RNase 除染ソリューション | Invitrogen | AM9780 | |
| Falcon 試験管 セルストレーナーキャップ付き (35 μm) | Corning | 352235 | |
| MoFlo Astrios Cell Sorter | Beckman Coulter | B25982 | |
| Chromium i7 マルチプレックスキット、96 rxns | 10X Genomics | 120262 | |
| Chromium Single Cell 3'ライブラリー&ゲルビーズキット v2、4 rxns | 10X Genomics | 120267 | |
| Chromium Single Cell A チップキット、16 rxns | 10X Genomics | ||
| Tissue Culture Dish (60 mm x 15 mm) | Corning | 353002 |
参考文献
- Hrvatin, S., et al. Single-cell analysis of experience-dependent transcriptomic states in the mouse visual cortex. Nature Neuroscience. 21 (1), 120-129 (2018).
- Hu, P., et al.
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再版と許可
訂正
Formal Correction: Erratum: Isolation of Adult Spinal Cord Nuclei for Massively Parallel Single-nucleus RNA Sequencing
Posted by JoVE Editors on 11/20/2018. Citeable Link.
An erratum was issued for: Isolation of Adult Spinal Cord Nuclei for Massively Parallel Single-nucleus RNA Sequencing. The Protocol section was updated.
Step 3.1 was updated from:
Place the lumbar spinal cord in a pre-chilled Dounce homogenizer and add 500 mL pre-chilled detergent lysis buffer.
to:
Place the lumbar spinal cord in a pre-chilled Dounce homogenizer and add 500 μL pre-chilled detergent lysis buffer.
Step 3.6 was updated from:
Pass an additional 1 mL low sucrose buffer over the 40 mm strainer, bringing the final volume to 3 mL of the low sucrose buffer and 500 mL of the lysis buffer.
to:
Pass an additional 1 mL low sucrose buffer over the 40 mm strainer, bringing the final volume to 3 mL of the low sucrose buffer and 500 μL of the lysis buffer.
Step 5.5 was updated from:
Once the centrifugation is complete, immediately decant the supernatant in a flicking motion.
NOTE: A residual volume (less than 400 mL) of sucrose buffer can be discarded if desired to produce a lower volume and cleaner final sample, but this residual volume does contain nuclei and can be preserved to maximize nuclei yield
to:
Once the centrifugation is complete, immediately decant the supernatant in a flicking motion.
NOTE: A residual volume (less than 400 μL) of sucrose buffer can be discarded if desired to produce a lower volume and cleaner final sample, but this residual volume does contain nuclei and can be preserved to maximize nuclei yield
Step 5.6 was updated from:
Using 100 mL - 1 mL of resuspension solution, resuspend the nuclei remaining on the wall. Avoid the myelin ‘frown’ that remains with the detergent-based preparation.
to:
Using 100 μL - 1 mL of resuspension solution, resuspend the nuclei remaining on the wall. Avoid the myelin ‘frown’ that remains with the detergent-based preparation.
Steps 6.1.1 - 6.1.4 were updated from:
- Adjust nuclei to a final concentration of 225 nuclei per mL.
- Prepare barcoded beads at a concentration of 250 beads per mL.
- Prepare the lysis buffer with 0.7% sarkosyl.
- Adjust the flow rates to 35 mL per min for beads, 35 mL per min for nuclei, and 200 mL per min for oil.
to:
- Adjust nuclei to a final concentration of 225 nuclei per μL.
- Prepare barcoded beads at a concentration of 250 beads per μL.
- Prepare the lysis buffer with 0.7% sarkosyl.
- Adjust the flow rates to 35 μL per min for beads, 35 μL per min for nuclei, and 200 μL per min for oil.
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