大きな腫瘍サプレッサー (ラッツ) のキナーゼ活動を定量化するルシフェラーゼを用いたバイオ センサーの紹介-中央キナーゼ シグナル伝達経路カバで。このバイオ センサーには、カバ経路レギュレータの in vitroとin vivoの調査を目的とした基礎やトランスレーショナル研究の多様なアプリケーションがあります。
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方法論記事
信号経路活性ルシフェラーゼ ベースの大きい腫瘍のサプレッサー (ラッツ) バイオ センサーを用いたカバを監視
* These authors contributed equally
この記事について
サマリー
要約
シグナル伝達経路カバは臓器のサイズの節約されたレギュレータし、開発および癌の生物学で重要な役割を持っています。技術的な問題のため、このシグナル伝達経路のアクティビティを評価して、生物学的文脈の中で解釈することは困難残ります。大きな腫瘍サプレッサー (ラッツ) に関する既存の文献は、スクリーニングを質的、ことはできません簡単にするスケール アップ法に依存します。最近では、カバのキナーゼカスケードの背筋のコア コンポーネントのキナーゼ活動を監視する生物発光に基づくバイオ センサーを開発しました。ここでは、我々 はカバ経路レギュレータを特徴付けるためのこの背筋バイオ センサー (LATS BS) の使用方法について手順を説明します。まず、背筋 BS を使用して背筋活動発現タンパク質候補者 (例えばVEGFR2) の効果を調査するための詳しいプロトコルをいたします。その後、小規模なキナーゼ阻害剤スクリーンのための背筋 BS の使用方法を示す.このプロトコルはうまくカバ経路の新規規制当局が確認されます間違いなく大画面を実行するスケール アップをすることができます。
概要
カバはシグナリング経路最初ショウジョウバエの細胞の成長と動物サイズ1,2の新規調節因子として同定されました。その最初の発見以来証拠説得力を示しているカバ経路が (例えば、初期胚、臓器サイズ制御、および三次元の [3-D] 形態)、開発に重要な役割を果たしていること腫瘍 (例えば腫瘍の開発、転移、血管新生、免疫回避、ゲノム不安定性、ストレス応答、および薬剤耐性)、および組織恒常性 (例えば、幹細胞の複製分化と損傷後の組織再生)3,4,5,6,7,8,9,10. カバがシグナル伝達は頻繁に様々 な癌7,8....
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プロトコル
1。 カバはラッツ BS を使用して信号の推定レギュレータの調査
-
めっきと細胞のトランスフェクション
- 細胞培養の準備
- 1x PBS、10 %fbs と 1% ペニシリン/ストレプトマイシンと約 30 分間水浴の 37 ° C に 0.25% トリプシン-EDTA を含む DMEM を温めます。
- 70% のエタノールの安全キャビネットを徹底的に掃除します。
- 必要に応じて、ティッシュ文化フードにティッシュの培養皿、パスツール ピペット、血清ピペット、ピペット チップを配置します。
- PBS、メディア、および水の風呂からトリプシン-EDTA x 1 を取り出し、70% エタノール、それらをきれいに、フードにそれらを置きます。
- メンテナンスとセルの transfection のためのめっき
- 実験のため (例えばHEK293) 高いトランスフェクション効率のセルの行を選択します。ウエスタンブロット カバ信号がアクティブかどうかを確認するこの細胞におけるカバ経路コンポーネントの式を確認します。
- 37 ° C、5% CO2でインキュベーターで 10 cm シャーレに DMEM HEK293 細胞を成長します。顕微鏡下で細胞を毎日監視します。80-90% の ....
- 細胞培養の準備
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結果
ラッツ BS は背筋活動 (図 3) に及ぼす影響を評価するための異なる遺伝子を持つ cotransfected だった。この実験では、 Renillaは内部統制として使用されました。ヤップ 5SA の一過性の発現、ヤップの構成アクティブ フォーム設立されたフィードバック経路25ラッツ キナーゼ活性のヤップ転写ターゲットとその後の増加のレベルを増やす原因。MST、カバ経路 (図 1)、ラッツの上流活性化バイオ センサーの信号強度が高まります。しかし、VEGFR の発現、PI3K/MAPK シグナルをトリガーする背筋を阻害する、背筋 BS の信号強度が低下します。
2 番目のプロトコル ラッツ BS HEK293AD に導入され、24 時間後、細胞は 96 ウェルのプレー.......
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ディスカッション
カバ経路は様々 な生物学的プロセスに重要な役割を果たしているが、カバ経路の制御不全癌6につながる、様々 な刺激への応答でカバの経路を調整する方法は完全にわかりません。また、カバのコア コンポーネントのアクティビティを評価する定量的およびリアルタイム システムはないずっと。最近、我々 は開発およびカバ経路24ラッツ キナーゼ活性を測定する新しいバイオ センサーを検証します。定量的かつ正確にカバ シグナル細胞の活動を監視するため、薬が癌治療のためのカバ経路をターゲットの画面だけではなく、このバイオ センサーを使用できます。さらに、バイオ センサー ベースのスクリーニングはカバ経路の規制の新規遺伝子の発見につながることができます。カバががんにおけるシグナル伝達の重要性を考えると、他の遺伝子とカバ経路の発見重要なクロストークはすべて癌生物学者のために着手する貴重な研究になります。したがって、このバイオ センサーは現在がん治療における技術革新を作る可能性を秘めて、癌の巧妙な処置の有用な新しい治療戦略を提供可能性があります。
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開示事項
著者が明らかに何もありません。
謝辞
この作品が助成金からカナダの健康研究所 (機構 #119325 148629) によって支えられた、XY にカナダ乳がんがん財団 (CBCF)。TA は、ヴァニエ カナダ大学院奨学金とオンタリオ州国際大学院奨学金によってサポートされます。HJJVR は、女王エリザベス II 大学院の奨学金科学技術によってサポートされます。
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材料
| 名前 | 会社 | カタログ番号 | コメント |
|---|---|---|---|
| <ストロング>トリプシン-EDTA | Life Technologies | 2520056 | 0.25% |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Sigma | F1051 | |
| DMEM | Sigma | D6429-500ml | DMEM with high glucose |
| ペニシリン ストレプトマイシン | Life Technologies | 15140122 | |
| PolyJet In Vitro DNA トランスフェクション試薬 | Signagen | SL100688.5 | |
| 5x Passive lysis buffer | Promega | E194A | 30 ml |
| Dual-Glo®ルシフェラーゼアッセイシステム | Promega | E2940 | 100 ml キット |
| 20/20 ルミノメーター | Turner Biosystems | 998-2036 | シングルチューブリーダー ルミノメーター |
| GloMax®デュアルインジェクター付きナビゲーター | Promega | GM2010 | 96ウェルプレートリーダールミノメーター |
参考文献
- Justice, R. W., Zilian, O., Woods, D. F., Noll, M., Bryant, P. J. The Drosophila tumor suppressor gene warts encodes a homolog of human myotonic dystrophy kinase and is required for the control of cell shape and proliferation. Genes & Development. 9 (5), 534-546 (1995).
- Xu, T., Wang, W., Zhang, S., Stewart, R. A., Yu, W.
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再版と許可
