方法論記事

プロトプ ラストを用いた葉緑体への蛋白質輸送を勉強

DOI：

10.3791/58441

⸱

2018年12月10日

 ,  , 
1Division of Integrative Biosciences and Biotechnology, Pohang University of Science and Technology, 2Department of Life Sciences, Pohang University of Science and Technology

この記事について

サマリー

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ここでプロトプ ラストにペグを介した変換法を用いた蛋白質を表現するプロトコルについて述べる。メソッドが、興味の蛋白質、蛋白質のローカリゼーション、種々 の実験条件のインポート プロセスの効率的な調査の簡単な表現を提供します体内。

要約

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葉緑体は、光合成など多くの二次代謝と脂質の生産植物の様々 な細胞プロセスを担当する重要な細胞小器官です。葉緑体は、これらの様々 な生理学的なプロセスの多数の蛋白質を必要とします。以上葉緑体タンパク質の 95% は、核でエンコードされ、細胞質から、葉緑体にインポートをゾル性細胞質のリボソームで翻訳後です。したがって、適切なインポートまたはこれら核葉緑体タンパク質が葉緑体にターゲットは葉緑体として植物細胞の適切な機能にとって不可欠です。核葉緑体タンパク質の解析には、葉緑体に特定の対象信号シーケンスが含まれています。葉緑体や細胞質に局在する分子機械はこれらの信号を認識し、インポート処理を実施します。タンパク質インポートまたは体内の葉緑体にターゲットのメカニズムを調べるためには、シロイヌナズナの葉緑体への蛋白質輸送を分析するための迅速で効率的な原形質体ベースの方法を開発しました。このメソッドでは、シロイヌナズナの葉組織から分離したプロトプ ラストを使用します。ここでは、プロトプ ラストを使用して、タンパク質が葉緑体にインポートされる機構を調査するための詳しいプロトコルを提供します。

概要

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葉緑体は植物の最も重要な器官のひとつです。1光合成を行う葉緑体の主な機能の 1 つです。葉緑体は、脂肪酸、アミノ酸、ヌクレオチドおよび多数の二次代謝産物1,2の生産のための他の多くの生化学的反応をまた運ぶ。これらの反応のすべてについて、葉緑体は多数の異なる種類のタンパク質を必要とします。しかし、葉緑体ゲノムにはだけおよそ 100 遺伝子3,4が含まれています。したがって、葉緑体は細胞質からのタンパク質の大部分をインポートする必要があります。実際には、ほとんどの葉緑体タンパク質翻訳4,5,6後に細胞質からインポートすることが示されました。植物細胞の葉緑体細胞質から蛋白質にインポートする特定のメカニズムが必要です。しかし、これらのタンパク質インポート メカニズムが過去数十年間検討されてきたがまだ完全にかわからないそれら分子レベルで。ここでは、プロトプ ラストを準備し、外因プロトプ ラストの遺伝子を表現するため詳細な方法を提供します。このメソッドは、詳細に葉緑体への蛋白質輸....

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プロトコル

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1. シロイヌナズナ植物の成長

  1. 1 L Gamborg B5 を準備 (B5) 媒体 B5 培地の 3.2 g を追加することによってビタミン、糖 20 g、0.5 g を脱イオン水の約 800 mL 2-(N-morpholino) エタン スルホン酸 (MES) の水酸化カリウム (KOH) と 5.7 を pH 調整など。追加より脱イオン水は 1 l. 追加 8 グラム、phytoagar、121 ° C で 15 分間オートクレーブに総量をもたらす
  2. 55 ° C まで冷却し、クリーン ベンチでシャーレ (直径 9 cm、高さ 1.5 cm) に B5 培地の 20-25 mL を注ぐに許可します。2-3 日間板を乾燥、クリーンなラップでそれらをパック、使用するまで冷蔵庫に保管してください。
  3. シロイヌナズナを用いた滅菌 70% (v/v) エタノール 2-3 分間継続的に揺れによる遠心分離機管 (電子管) での 1 ml 種子上澄みを除去、1% (v/v) 次亜塩素酸ナトリウム溶液の 1 mL を追加し、2-3 分間継続的に振る準備 100-シャーレ 150 種。
    1. 培養上清を削除し、1 mL の蒸留水と種子を洗浄します。4 x この手順を繰り返します。種子の発芽を同期する 3 日間の 4 ° C で滅菌の種子を置きます。
  4. マイクロ ピペットを使用して B5 版に 100-150 種をまく....

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結果

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葉緑体へのタンパク質のインポートは 2 つの方法を使用して調べることができます: SDS ページを介した分離後の蛍光顕微鏡とイムノブロット分析。ここで、赤血球を使用-nt:GFP、融合は、GFP を融合した輸送ペプチドを含む赤血球の 79 の N 末端アミノ酸残基のエンコーディングを構築します。ターゲット蛋白質赤血球からの信号は緑色蛍光タンパク質を葉緑体へインポートするとき-nt:GFP からクロロフィル自家蛍光レッド蛍光シグナルが合併と蛍光顕微鏡 (図 1)。2 つの信号の近くの重なりは、葉緑体へのタンパク質インポートを示します。しばしば GFP シグナルは葉緑体全体に広がっているまたは個々 の蛋白質によって、葉緑体中弱拡散信号と葉緑体の中心に集中しています。蛋白質の輸入は、GFP 抗体を用いたイムノ プロット解析で確認できます。プロトプ ラストから調製した血清総蛋白および西部のしみの分析 (図 2) に続いて SDS-PAGE によって分離が。ほとん.......

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ディスカッション

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プロトプ ラストの葉緑体への蛋白質輸送を研究するシロイヌナズナの使用のための詳しいプロトコルを提供しました。このメソッドは、強力なタンパク質インポート プロセスを調査するため。このシンプルで汎用性の高いテクニック、予定された貨物タンパク質が葉緑体にターゲットを調べるのに役立ちます。このメソッドを使用すると、プロトプ ラストから非常に早く完全に成熟した葉に至るまで多くの異なる生育段階での植物から得ることができるシロイヌナズナ11,12の葉組織から用意しています。ただし、成長する植物のプロトプ ラストの調製に使用するとき注意が必要があります。健康な植物から調製したプロトプ ラストは、ペグ-仲介された変形に関与する多くのステップを耐えることができます 1 つは、非常に健全な植物を使用ください。別の重要な予防策は、新鮮なソリューションを使用することです。ソリューションの濃度のわずかな変化は、彼らは壊れやすく、浸透圧に非常に敏感であるので大きく、プロトプ ラストを損傷することが。

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開示事項

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著者が明らかに何もありません。

謝辞

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この仕事は農業科学技術開発プロジェクト号共同研究プログラムの支援で実施されました。PJ010953012018)、農村開発行政と科学省と ICT (第 2016R1E1A1A02922014)、によって資金を供給国立研究財団 (韓国) グラント韓国。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
GAMBORG B5 MEDIUM INCLUDING VITAMINSDuchefa BiochemieG0210.0050
スクロースDuchefa BiochemieS0809.5000
MES MONOHYDRATEDuchefa BiochemieM1503.0250
寒天、粉末JUNSEI24440S1201
Micropore Surgical tape3M1530-0
Surgical bladeステンレス No.10フェザー利用不可
コニカルチューブ 50mlSPL LIFE SCIENCES50050
マセロチーム R-10ヤクルト製薬入手できない
セルラーゼ オノヅカ R-10ヤクルト製薬利用できない
アルブミン、ウシ(BSA)VWR0332-100G
D-マンニトールSIGMAM1902-1KG
塩化カルシウム、二水和物MP BIOMEDICALS0219463505-5KG
ツイスタービジョン サイエンティフィックVS-96TW
CD-1 用スクリーン カップSIGMAS1145
CD-1 用スクリーンSIGMAS3895
ペトリ皿SPL LIFE SCIENCES10090
パスツールピペットヒルゲンベルク3150102
研究室用遠心分離機/ベンチトップビジョン SCIENTIFICVS-5500N
塩化ナトリウムJUNSEI19015S0350
塩化カリウムSIGMAP3911-1KG
D-グルコース、無水バイオベーシックGB0219
酸化カリウムDUKSAN40
硝酸カルシウム四水和物SIGMAC2786-500G
ポリ(エチレングリコール)SIGMAP2139-2KG
塩化マグネシウム六水和物SIGMAM2393-500G
チューブ13ml、100x16mm、PPザルシュテット55.515
スライドMARIENFELD1000412
顕微鏡カバーメガネMARIENFELD101030
チャンバーMARIENFELD650030
Axioplan 2イメージング顕微鏡ツァイス利用不可
マイクロチューブ1.5mlSARSTEDT72.690.001
2-メルカプトエタノールSIGMAM3148-250ML
ドデシル硫酸ナトリウム (SDS)、プロテオミクスグレードVWR M107-500G
TRIS、超高純度グレードVWR0497-5KG
DTT (DL-ジチオスレイトール)、バイオテクノロジーグレードVWR0281-25G
ブロモフェノールブルーナトリウム塩 ACSVWR0312-50G
グリセロール純正27210S0350
Living Colors A.v. モノクローナル抗体 (JL-8)タカラ632381
水顕微鏡カウントカール

参考文献

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  1. Jarvis, P., Lopez-Juez, E. Biogenesis and homeostasis of chloroplasts and other plastids. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 14 (12), 787-802 (2013).
  2. Neuhaus, H. E., Emes, M. J. Nonphotosynthetic Metabolism in Plastids. Annual Review of Plant Physiology and Plant Molecular Biology. 51, 111-140 (2000).
  3. Rolland, N., et al.

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