方法論記事

移植組織の細菌付着を勉強する平行平板灌流システムのIn Vitroモデル

DOI：

10.3791/58476

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2019年1月7日

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1Cardiovascular Developmental Biology, Department of Cardiovascular Sciences, KU Leuven, 2Centre for Molecular and Vascular Biology, Department of Cardiovascular Sciences, KU Leuven, 3Department of Biohybrid & Medical Textiles, AME - Helmholtz Institute for Biomedical Engineering, RWTH Aachen University, 4European Homograft Bank, Saint Jean Clinique, 5Division of Clinical Cardiac Surgery, Department of Cardiovascular Sciences, KU Leuven

この記事について

サマリー

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私たちは、社内に設計された体外流れ商工会議所モデル、移植組織の細菌付着の検討を可能にするについて説明します。

要約

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様々 なバルブ付き導管とステントに取り付けられたバルブは、先天性心疾患患者における右室流出路 (慢性) 弁置換に使用されます。しかし補綴用材料を使用して、これらの移植が細菌感染と様々 な宿主反応を受けやすいです。

重要な役割を果たす微生物の血管内付着細菌とホスト因子の同定が重要である感染性心内膜炎 (IE) などの感染症の発症の病態生理を理解し、予防を開発するには戦略。そのため、生理学的せん断条件下で細菌の付着を調査する有能なモデルの開発が必要です。ここでは、新しく設計された体外灌流チャンバー平行平板に基づく移植組織のさまざまなコンポーネントへの細菌付着に関する研究など細胞外マトリックス、内皮細胞および不活性領域を公開することができますの使用について述べる.このメソッドはコロニー形成と組み合わせるユニット (CFU) カウントは移植材の流れの下で細菌の粘着の方の傾向を評価する適切な。さらに、流れ溜まりされる可能性がありますせん断条件下で細菌の付着の血液成分の役割を調査するため。我々 は、組織、形態、および菌種特異性のソースは当社社内に設計された体外灌流モデルを用いた組織を移植への細菌付着の主要な決定要因ではないことを示した。

概要

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黄色ブドウ球菌(黄色ブドウ球菌) は、さまざまな病原性敗血症など重症の血管内感染につながる人間の循環注入生物や非生物の表面を植民地化ホストの免疫の防衛システムを回避する戦略を採用していて、IE1,2,3,4,5。IE のまま患者の IEare の発症に貢献することの個々 の要因がまだ完全に理解6,7人工心臓弁の移植後合併症が重要な治療に関連付けられています。流れの条件の下で細菌が発生せん断力容器壁8に準拠するために克服する必要があります。彼らはより多くの体内の状況を反映して、流れの下で血管内皮細胞や人工弁組織細菌間の相互作用を研究することで、モデル、関心です。

いくつかの特定のメカニズムは、血管内皮細胞 (Ec) へと組織の植民地化と植生、IE9の重要な初期の手順の中の成熟に至る露出内皮下マトリックス (ECM) に細菌の付着を促進します。様々 なブドウ球菌表面蛋白または MSCRAMMs (認識性接着剤マトリックス分子微生物表面部材) が, フィブロネクチンなどの分子との相互作用によって宿主細胞と ECM タンパク質の付着仲介人として記載されています。フィブリノーゲン、コラーゲン、フォン ・ ヴィレブランド因子 (VWF)8,10,11。ただし、大抵静的な条件で研究のいくつかの病原因子の分子内折りたたみの観点からこれらの相互作用の多くは循環血液中血管内感染の異なる関連性にあります。

本稿で、社内に設計された体外平行平板流チャンバー モデル、慢性位置に注入する組織移植のコンテキストで ECM と ECs のさまざまなコンポーネントへの細菌付着の評価を可能にします。この作品で説明されているメソッドの全体的な目的は細菌やよう血液中の病原体の生体内環境に密接に関連の流れの条件の基になる血管内の組織間の相互作用のメカニズムを研究するには黄色ブドウ球菌。この斬新なアプローチは、IE の開発のための潜在的なリスク要因を識別するために細菌の付着を移植組織表面の感受性に焦点を当てています。

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プロトコル

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1.体外研究移植組織の準備

注: 組織の 3 つのタイプは使用された: ウシ心膜パッチ (BP)、凍結保存同種 (CH) および牛の頚静脈移植 (BJV)。BJV 導管、CH (組織処理欧州同種銀行 (エッブ) によって、液体窒素を使用する前に格納されている) の場合は、壁と弁のリーフレットの両方が使用されました。BP パッチと BJV 電線管は、メーカーから購入しました。使用前に次のエッブ指示12CH を解凍します。

  1. 0.9 %nacl 前に使用すると、すべての組織をすすいでください。
  2. 使用して使い捨ての皮膚生検組織生検循環組織部分 (直径 10 mm) をカットするパンチを準備します。
  3. 組織のすべてのパッチを使い捨て滅菌メスを使用して同じ高さにカットします。
  4. グルタルアルデヒド (たとえばBJV 導管) 固定した組織、定着剤を中和するためにアルブミン 200 g/L と 4 ° C で一晩移植作品を孵化させなさい。
  5. 0.9% グルタルアルデヒドの残渣を洗浄マイクロタイター プレートにおける塩化ナトリウム。 1分間に 3 回繰り返します。

2. 灌流実験用細菌の準備

注: 3 つの細菌分離株を用いて:黄色ブドウ球菌コーワン (ATCC 12598)、ATCC 149900 をS の表皮を、 s. 血統NCTC 7864。黄色ブドウ球菌とsトリプシン大豆スープ (TSB) で 37 ° C で栽培し、, S. 血統ブレインハートインフュー ジョン (BHI) で 5% CO2で 37 ° C で育った。

  1. 一晩培養中固体血液寒天培地プレート上を準備します。
    1. 滅菌ループを使用して、冷凍の細菌をこすり、37 ° C で一晩かけて培養のミューラー ・ ヒントン血液寒天培地プレート上に接種します。
  2. 一晩かけて血液寒天培地培養からシングル コロニーをピックアップし、37 ° C で一晩 14 mL チューブ文化で TSB の BHI 10 mL に接種する滅菌接種ループを使用してください。
  3. 一晩文化 (g, 4 ° C, 10 分 x 3000) を遠心し、リン酸緩衝生理食塩水 (PBS) 10 mL にペレットを再懸濁します。氷の上 14 mL の管を配置します。
  4. 5 (6) - カルボキシ - フルオレセイン N-ヒドロキシ - サクシニミジルエステル (CF) エタノールの 3.7 mg/mL の溶液の因数を準備し、-20 ° C で保存さらに「純水」を使用して 150 μ g/mL CF 株式を希釈します。
    注: アルミ箔を使用して光から管を保護し、-20 ° C で保存
  5. 遠心分離機の細菌 (g, 4 ° C, 10 分 x 3000) と 800 μ L の PBS でペレットを再懸濁します 150 μ g/mL CF ソリューション (30 μ G/ml 灌流実験用の最終濃度) を 200 μ l 添加します。アルミ箔を光から保護して管と軌道のシェーカーを使用して 30 分間インキュベートします。
  6. ラベル付け後に PBS のウシ血清アルブミン (BSA) ソリューションの 2% をブロックし、スピン (3000 x の g, 4 ° C, 10 分間)。10 mL の PBS とペレットの細菌を用いた遠心分離 (3000 x の g, 4 ° C, 10 分) 洗浄ステップに従ってください。
  7. PBS (CFU)/mL (CFU を頼りにミューラー ・ ヒントン血液寒天培地プレートによって確認される)、107コロニー形成単位を取得する、外径 φ600 (光密度) 0.65 に対応する細菌を希釈します。灌流実験前に氷に暗闇の中にチューブを維持します。
    注意してください。外径600測定が細菌のおおよその数を反映して覚えておいてください。効果的な接種量をカウントするには、シリアル希釈法は 3.8 項で説明したように OD を確認する追加の必要なステップが番号をベースです。

3 平行平板流チャンバーを用いた灌流実験体外。

  1. 内面の細菌懸濁液との接触を取得する上向き流れ溜まりに 10 mm の直径と同じ厚さ (1.1 〜 1.5 の手順で準備) の組織生検をマウントします。
    メモ: 様々 な移植で同じ組織の厚さは、すべての条件で層流をできるようにチャネルで同じ組織高さに達することを確認します。流れ区域のすべての要素を提示し、図 1に示した。
    1. プロトコルを開始するには、8 mm 円形穿孔顕微鏡スライドとゴム製のガスケットの間ラウンド組織片を配置します。
      注: 顕微鏡のスライドは 8 mm の穴の生成を許可する極薄底フィルムを所有しています。ゴム シートと共にそれは標本と流れる媒体との間の直接の接触を有効に組織を修正し、また実験中に、生検の転位を防ぐ。(小径) の流れにさらされている調査の組織の表面は、鉗子で操作できません。
    2. 商工会議所の下の金属フレームに埋め込まれているガスケット シートに組織のホルダーを挿入します。
    3. 商工会議所の下の部分に対応するガスケット シート上部の金属フレームの以前に挿入されたティッシュ ホルダー付します。その後 8 本のネジで全体の部屋をマウントし、ナットをネジします。商工会議所の高さが常に同じである移植全体を確認します。
      注: 商工会議所の高さは、ネジを締める時に常に決まる必要があります。ノギスや定規を使用します。
  2. 蠕動ポンプとチューブ流体流れ区域を接続します。
  3. 3 ダイン/cm2 (平方センチメートルの圧力単位ダイン) のせん断応力 107 CFU/mL (CFU カウントと OD600測定に関連によって確認される) の蛍光標識した細菌は PBS での懸濁液と組織を灌流して蠕動ポンプの手段 (流量 4 mL/分) プレート サーモスタット (材料表) を使用して 37 ° C でエアコン 400 mL 細菌貯水池 (社内設計図 1) を使用して 1 時間。
  4. 同じコレクション リザーバーを使用して 100 mL の細菌懸濁液を連続的に循環させます。
  5. 後、グラフトを解放し、3 分間研究所軌道シェーカーを使用して 12 ウェル プレートで PBS の 4 mL で 2 回組織部分を洗浄室を解体します。その後より小さい直径のパンチ皮膚生検を使用して移植片の内側の部分をカットします。
  6. 滅菌の 0.9 %1 mL を含む独立した 14 mL チューブに各組織生検を配置塩化ナトリウム。#1 としてチューブ ラベルを付けます。
  7. 10 分間超音波処理浴を用いた組織から細菌をデタッチ (振幅 = 100% と周波数 = 45 kHz)。
    注: パッチ OD600測定に続いて TSB 液体培地で 37 ° C で一晩の培養移植が評価されるべき組織から細菌の完全剥離に比べてパッチ細菌無料溶液で処理を制御します。
  8. ミューラー ・ ヒントン血液寒天培地プレート上 CFUs をカウントするのにシリアル希釈法を使用します。
    1. 超音波処理後に得られた細菌懸濁液のシリアル希薄を滅菌生理食塩水 10 mL で単一 14 mL のチューブを準備します。第 2 位このチューブ ラベルを付けます。
      注: 各組織の実験の 1 つの管 10 ml の 0.9% の塩化ナトリウムは必要です。
    2. 10 mL 滅菌 0.9 %3 14 mL チューブの準備手順 2.7 から初期の細菌懸濁液のシリアル希薄を塩化ナトリウム。チューブ 3 #、4 #、#5 を次のようにラベルを付けます。
      注: この手順は、灌流実験用細菌懸濁液に CFU 実数を知っておく必要です。
    3. 渦は、15 s. 渦管にシリアル希薄にする初期の細菌懸濁液と同様、組織生検で各チューブをミックスします。
    4. 3 寒天、組織実験 (細菌の灌流および PBS のコントロール灌流) の 2 つと 3 つ目初期細菌懸濁液 perfusions の使用のための準備します。
    5. 10-410-3次方法 10-1組織実験用プレートごと 3 つのセクターにラベルを付けます。細菌の perfusates で CFUs の数をカウント、する次のようにプレートをラベル: 10-710-5 10-310-1。
      注: すべての兆候の寒天プレートなど 10-1, 10-3 CFU/mL の次の日に計算の最後の番号を参照してください。制御板の任意のセクターを必要はありません。使用前に血液寒天培地プレートを層流フードの下に配置し、余分な水分を削除するを開くください。
    6. シリアルの希薄の準備を続行するには、#2 管にチューブ #1 の 100 μ L を転送し、渦と精力的にミックスします。
    7. 1 と対応するセクター 10-1に #2 チューブの内容の 100 μ L と 10-3寒天プレートを します。同様に、拡散チューブ #2 セクター 10-410 μ L、10 μ L の各ボリュームから 4 別々 の成長を取得するこの手順を 4 回繰り返します。
      注: セクター 10-4にめっきに使用される小さなボリューム、ためお勧め栽培 CFUs の平均数を作成する液滴の複数の数を持っています。
    8. 初期の文化のシリアル希薄を準備するには、チューブ #3 ステップ 2.7 からの細菌懸濁液 100 μ L を転送し、渦と精力的にミックスします。#4 管にチューブ #3 の 100 μ L を追加しよく混ぜて、後続管 #5 の手順を繰り返します。
    9. 血液寒天培地プレート 10-1 10-7 10-5セクター 10-3にチューブ #3 #4 #5、調整細菌懸濁液 (ステップ 2.7) の内容の 100 μ L をそれぞれ、 します。
    10. 空気層流フードの血液寒天培地プレートにドライな細菌のスプレッドは、通常は 10 分のために残します。その後、一晩インキュベートの 37 ° C でプレートを配置します。
    11. 一晩インキュベートした後開始細菌懸濁液灌流用 CFUs/mL と同様、組織生検に密着性から生じる CFUs の番号を取得する細菌のコロニーをカウントします。CFU/cm2結果を表現します。

4. 蛍光顕微鏡組織灌流を移植する付着細菌の

  1. 灌流、洗い流してティッシュ入りの PBS (ステップ 3.5 を参照) より小さい直径のパンチを使用して移植片の内側の部分をカットします。
  2. 6 ウェル プレートを準備し、メディアをマウント (材料表) の滴を配置します。
  3. メディアをマウントの一滴に組織灌流表面下方の各部分を置きます。
  4. 蛍光スキャナー (資材表) を使用して板をお読みください。細菌の分類のために使用される蛍光体によると励起と放射の波長のパラメーターを設定します。

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結果

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背後にあるメカニズムを理解するIE の開発、このモデルにより、細菌の評価と感染症発症の体内状況に存在する関連付けられた組織因子。

詳しくは、新規体外アプローチにより、3-10 ダインの生理的な範囲でせん断応力を発揮する組織に蛍光に分類された細菌を灌によって異なる移植組織へのフロー条件で細菌の付着を定量化する/cm2慢性。この作業で 3 ダイン/cm2に相当する 4 mL/min の流量を使用しました。(図 1に示すように) 灌流チェンバ組織のすべてのパッチは、マウントされている接ぎ木と約 39 mm の中型の入口間の距離 0.3 mm の高さを考慮して、十分に発達した層流を保証 (Re = 3.89 です2000 より有意に減少します。入り口の長さ = 0.05 mm が ' 入口-移植 '、適切...

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ディスカッション

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最近の臨床所見は、慢性6,13の弁置換術を受けた患者における合併症として IE に特別な意識を与えます。IE で注入弁の機能不全は、広範な炎症と凝血促進反応1,14につながる血管グラフトと細菌の相互作用の結果です。提示された新規の in vitroモデルでは、組織構造および細菌性因子の相違が生体内で使用される移植15の感染症に対する感受性を調節する可能性が高い場合を調査することができました。BJV と CH 移植組織フロー条件下で細菌の募集の方と同様の傾向を示した。したがって、データは、一般に組織と表面構造と同様、特定の細菌の接着性タンパク質自体のソースは初期の細菌付着の主要な決定要因をお勧めします。

一般に、炎症を引き起こす経路、感染した血管内サイ...

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謝辞

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本研究は、RH に与えられた研究基金ルーヴェン (OT/14/097) の助成金によって後援されました。TRV は FWO 研究財団 - フランダース (ベルギー; 博士研究員許可番号 - 12K0916N) と RH は UZ ルーヴェン臨床研究基金でサポートされます。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
ウシ心膜(BP)パッチ、Supple Peri-Guard ClecardiumSynovis Surgical Innovations、USAPC-0404SN
ウシ頸静脈コンジット(BJV)コンテグラコンジット;Medtronic Inc, USAM333105D001
CH 凍結保存されたホモグラフトEuropean Homograft Bank (EHB)-
Acu-PunchAcuderm Inc, USAP850 (8 mm);P1050 (10 mm)
ヒトアルブミンFlexbumin;バクスター、ベルギーBE171464
LOT:16G12C
トリプシン大豆ブロス (TSB)フルカ、シュタインハイム、ドイツ22092-500G
心臓注入ブロス (BHI)フルカ53286-500G
リン酸緩衝生理食塩水 (PBS).Gibco14190-094
5(6)-カルボキシフルオレセイン N-ヒドロキシスクシンイミドエステル (CF)Sigma-Aldrich, ドイツ21878-100MG-F
蠕動ポンプ (MODEL ISM444B)Ismatec BVP-Z Standard;コール・パーマー、ヴェルトハイム、ドイツ631942-2
超音波浴VWR超音波洗浄機;VWR、ラドナー、ペンシルバニア州142-6044230V / 50 -60Hz 60VA;HF45kHz, 30W
ProLong Gold AntifadeMountant Invitrogen by ThermoFisherP36930
InCell Analyzer 2000 (fluorescence scanner)GE Healthcare Life Sciences, Pittsburgh, Pa29027886
Arium Pro VF - ultrapure water - H2OMilliQ Millipore87206462
Microscopic slides - Tissue Culture Chambers (1-well)Sarstedt94.6140.102
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参考文献

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