ここでは、脊髄スライス培養における膠 (SG) ニューロンから作られた全細胞パッチク録音のために不可欠な手順について述べる。このメソッドでは、組み込みの膜特性、シナプス伝達、調査される SG ニューロンの形態的特性をことができます。
このコンテンツを表示するには、JoVEへの購読が必要です。 または、無料トライアルをお申し込みください。
この記事について
サマリー
要約
膠 (SG) ニューロンからの最近の全細胞パッチク ランプ-研究は、膨大な感覚伝達、侵害受容規制と慢性的な痛みやかゆみの開発の基礎となる脊髄のメカニズムについての情報を提供しています。急性脊髄スライスの効用に基づく形態学的研究と電気生理学的記録の実装は、神経膜特性の理解と SG の局所回路の構成にさらに改善しています。脊髄スライスとショー代表全細胞記録の形態の調製のための詳しく、実用的なガイドを紹介します。このプロトコルは、理想的な神経の保存を許可し、生体内である程度条件を模倣することができます。要約すると、脊髄スライス培養準備を取得できる安定した電流、電圧クランプ録音を有効にしたがって局所神経回路の組み込み膜プロパティに詳細な調査を促進する可能性があり、様々 な実験的アプローチによる神経の構造。
概要
膠 (SG、ラミナの脊髄後角 II) は送信および感覚情報を規制する議論の余地なく重要な中継センターです。一次求心性線維、ローカル介在ニューロンと内因性下行抑制系1から入力を受ける興奮性と抑制性の介在ニューロン、それで構成されます。最近十年間の急性脊髄スライス標本の開発と全細胞パッチク ランプ記録の出現 SG ニューロン2,の本質的な電気生理学的および形態学的特性の様々 な研究が可能にします。3,SG5,6の局所神経回路の研究と同様、 4 。また、体外脊髄スライス標本を使用して、研究者は、神経 excitabilities7,8の変化を解釈できる、9,10チャンネルはイオンの機能と各種病態下でシナプス活動11,12 。....
アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。
プロトコル
説明すべての実験のプロトコルは、動物倫理委員会の南昌大学 (南昌、PR 中国、倫理 No.2017-010) によって承認されました。すべての努力は、実験動物の苦痛やストレスを最小限に抑えるため行われました。ここで実行される電気生理学的記録は、常温 (RT、22-25 ° C) を実施しました。
1. 動物
- どちらの性別の Sprague-dawley ラット (3-5 週齢) を使用します。12 時間の明暗周期下動物の家し、十分な食糧や水に自由にアクセスします。
2. ソリューションおよび材料の準備
- ソリューション
- (MM) における人工髄液 (アプライド) を準備: 3.6 117 塩化ナトリウム、KCl、1.2 NaH2PO4·2H2O、2.5 CaCl2·2H2O、1.2 MgCl2·6H2O、25 NaHCO3、11 D グルコース、0.4 アスコルビン酸 2ピルビン酸ナトリウム。表 1を参照してください。
- (MM) のショ糖アプライドの準備: 240 ショ糖、2.5 KCl、1.25 NaH
アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。
結果
急性脊髄スライスは、図 1に示す図に従って調製しました。スライスと回復後、脊髄スライスは、記録室に移されました。健康的なニューロンは、IR DIC 顕微鏡を用いた相馬外観に基づいて識別されました。次に、SG ニューロンの活動電位が脱分極電流パルス (1 時間) のシリーズによって誘発されるときのニューロンは、RMP で開催されました。に示すよう図 2、発火パターン SG ニューロンが含まれている強壮剤焼成、遅延発火で観察されたギャップ焼成初期バースト、一過性破裂、単一スパイク、消極的焼成前の調査によって分類や記載されています。
この準備を実装すると、我々 にも記録サブスレッショルド電流と自発的に現われる電流電圧クランプ。サブスレッショルド電流、電流の過分極反応活性化の代表的な痕跡 (私h)、T 型カルシウム電流 .......
アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。
ディスカッション
このプロトコルの詳細 SG ニューロン18,19,20,21の全細胞パッチク ランプ-実験を行う際、我々 は正常に使用している脊髄スライスを準備するための手順。このメソッドを実装すると、我々 は最近報告ミノサイクリン、テトラサイクリンの第二世代は著しく19SG ニューロンのシナプス メカニズムを介して抑制性シナプス伝達を高めることができます。さらに、このエージェントがh私の振幅を減少でき、さらに21SG ニューロンの興奮性を抑制します。これらを支援する公開データと我々 表示ここでは、現在この方法は電気生理学的研究の広い範囲での使用に適した代表的な結果。
前述のとおり、transcardial 潅流は健康的な試料を.......
アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。
開示事項
著者は利益相反を宣言しません。
謝辞
この作品は、中国の国家自然科学基金 (第 81560198、31660289) からの助成金によって支えられました。
....アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。
材料
| 名前 | 会社 | カタログ番号 | コメント |
|---|---|---|---|
| NaCl | Sigma | S7653 | ACSFおよびPBSの調製に使用 |
| KCl | Sigma | 60130 | ACSF、スクロース-ACSF、およびK+ベースの細胞内溶液 |
| NaH2PO4·2H2O | Sigma | 71500 | ACSF、ショ糖-ACSFおよびPBS |
| CaCl2·2H2O | Sigma | C5080 | ACSFおよびスクロース-ACSF |
| MgCl2·6H2O | Sigma | M2670 | ACSFおよびスクロース-ACSFの調製に使用 |
| NaHCO3 | Sigma | S5761 | ACSFおよびスクロース-ACSF |
| D-グルコース | Sigma | G7021 | ACSFの調製に使用 |
| アスコルビン酸 | シグマ | P5280 | ACSFおよびスクロース-ACSF |
| の調製に使用ピルビン酸ナトリウム | Σ | A7631 | ACSFおよびスクロースACSFの調製に使用 |
| ショ糖 | Sigma | S7903 | ショ糖ACSFの調製に使用 |
| 和光 | 169-11835 | K+ベースの細胞内溶液の調製に使用 | |
| Na2-Phosphocreatine | Σ | P1937 | 細胞内溶液の調製に使用 |
| EGTA | シグマ | E3889 | 細胞内溶液の調製に使用 |
| HEPES | シグマ | H4034 | 細胞内溶液の調製に使用 |
| Mg-ATP | シグマ | A9187 | 細胞内溶液の調製に使用 |
| Li-GTP | シグマ | G5884 | の調製に使用細胞内溶液 |
| CsMeSO4 | Sigma | C1426 | Cs+細胞内溶液の調製に使用 |
| CsCl | Sigma | C3011 | Cs+ベースの細胞内溶液の調製に使用 |
| TEA-Cl | Sigma | T2265 | Cs+細胞内溶液の調製に使用溶液 |
| ニューロビオチン 488 | ベクター | SP-1145 | 0.05% ニューロビオチン 488 形態学的研究に使用できる |
| 寒天 | シグマ | A7002 | 3% 寒天ブロックがプロトコルで使用されました |
| パラホルムアルデヒド | シグマ | P6148 | 4% パラホルムアルデヒドは免疫組織化学処理に使用されました |
| Na2HPO4 | Hengxing Chemical | PBS | |
| スリッピング 媒体 | Polyscience | 18606 | |
| ウレタン | 国立食品医薬品管理研究所 | 30191228 | 1.5 g/kg, i.p. |
| ホウケイ酸ガラス毛細血管 | ワールド精密機器 | TW150F-4 | 外径1.5mm、内径1.12mm |
| マイクロピペットプーラー | サッター機器 | P-97 | マイクロピペットの準備に使用 |
| ビブラトーム | ライカ | VT1000S | |
| 防振テーブル | テクニカルマニュファクチャリングコーポレーション | 63544 | |
| 赤外線CCDカメラ | Dage-MIT | IR-1000 | |
| パッチクランプアンプ | HEKA | EPC-10 | |
| マイクロマニピュレーター | サッター装置 | MP-285 | |
| X-Y ステージ | Burleigh | GIBRALTAR X-Y | |
| 直立顕微鏡 | オリンパス | BX51WI | |
| 浸透圧計 | Advanced | FISKE 210 | |
| PH meter | メトラートレド | FE20 | |
| コンフォコール顕微鏡 | Zeiss | LSM 700 |
参考文献
- Todd, A. J. Neuronal circuitry for pain processing in the dorsal horn. Nature Reviews Neuroscience. 11 (12), 823-836 (2010).
- Yoshimura, M., Nishi, S. Blind patch-clamp recordings from substantia gela....
アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。
再版と許可
