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方法論記事

体液性免疫のキープレーヤーの解明: 高度なマウス Peyer のパッチからのリンパ球の隔離のプロトコルを最適化

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DOI:

10.3791/58490

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2018年11月21日

 ,  ,  ,  , 
1Division of Hematology-Oncology, Beth Israel Deaconess Medical Center, Harvard Medical School, 2Department of Medicine, Beth Israel Deaconess Medical Center, Harvard Medical School

この記事について

サマリー

本研究で提案する小説とリンパ球の隔離のための効果的なプロトコル卵胞 T の流れフローサイトメトリーによる調査と同様に、体内と体外の機能アッセイにその後使用できますパイエル パッチ (PPs) からヘルパーおよび胚中心 B 細胞。

要約

消化管粘膜の免疫細胞は、病原体に対する免疫防御を同時に付与しながら免疫寛容を促進するユニークな免疫学的実体を構成します。まあ、パイエル板 (PPs) がいくつかのエフェクター T および B 細胞のサブセットをホストすることによって粘膜免疫ネットワークの重要な役割をあることを設立します。これらのエフェクター細胞、卵胞の T ヘルパー (TFH) および (GC) 胚中心 B 細胞のある特定の一部分は、体液性免疫の調節に professionalized します。したがって、PPs 内の分化プログラムと機能性の面でこれらの細胞のサブセットの特性は、粘膜免疫に関する重要な情報を提供できます。このため、簡単に適用可能な効率的な再現性のある PPs からのリンパ球分離法は研究者に有益でしょう。本研究では細胞の高安マウスからリンパ球を分離するための効果的な方法を生成する目的とします。我々 のアプローチの処理消化試薬と組織の動揺の使用など、初期組織を明らかと同様、細胞染色条件と抗体パネルの選択、品質と分離リンパ球のアイデンティティに大きな影響を与える実験結果。

ここでは、効率的に再現性のある流れ cytometry TFH と GC B 細胞サブセットに主に焦点を当て、T および B 細胞のサブセットの評価を許可する PPs からリンパ球集団を隔離して研究者を有効にするプロトコルについて述べる。

概要

最後に、最初から全体の消化管はよりも他の人間の器官とマウス1免疫細胞を含むリンパ網で飾られて。Peyer のパッチ (PPs) は、この細胞の免疫組織、いわゆる腸管関連リンパ性ティッシュ (GALT)2,3の腸の枝の主要なコンポーネントを構成します。PPs、食材由来の抗原の数百万の何千もの内で共生微生物叢と病原体が連続的にサンプルされているし、それらに向かって必要な適切な免疫応答がマウントされた維持腸管免疫恒常性。その意味で、PPs は「小腸の扁桃」として名前可能性があります。PPs から成っている主要な小班: 上皮下ドーム (SED) 大規模な B 細胞濾胞ゾーン;T 細胞がある4を覆う濾胞関連上皮 (FAE) と胞間領域 (IFR)。協力する PPs により異なるエフェクター細胞のサブセットのこのユニークな区画は、したがって、腸内免疫を与えます。

PPs 求心性リンパ管の欠如し、この理由のため小腸から PPs に運ばれる抗原は他のリンパ器官のほとんどと対照をなしてリンパ管を介して行われているないです。代わりに、FAE、いわゆる M 細胞にある特殊な上皮細胞が PPs5への抗原の転送を担当します。その後、運ばれた抗原は、樹状細胞 (Dc) によって拾われますと FAE6,7下上皮ドーム (SED) 地域にある食。PP で DCs によって、この抗原並べ替えプロセスは適応免疫応答8および IgA 産生細胞9の次の世代を開始することが重要です。

共生植物や食材から抗原上負担による PPs ホスト内生と活性化エフェクター T TFH と伊賀+ GC B 細胞10など大きな元素に B 細胞サブセット PPs 表すアクティブな免疫のサイトであることを示唆しています。応答11。20-25% の検出 TFH セル合計 CD4 内+ T 細胞のコンパートメントとを GC B 細胞, B 細胞内で 10-15% に採集された unimmunized 若い C57BL/6 マウス12PPs で可能です。他の T ヘルパー細胞型とは対照的 (すなわち。、Th1、Th2、Th17 細胞)、TFH 細胞 CXCR5 式 CXCL13 勾配13に沿って TFH 細胞のホーミングを促進するため主に B 細胞濾胞にユニークな親和性を示します。PPs の B 細胞濾胞ゾーン、TFH 細胞誘導を誘導する IgA クラス スイッチ組換え活性化 B 細胞の高親和性 IgA を生産細胞分化14で体性 hypermutation。その後、これらの抗体分泌形質細胞は粘膜 (LP) に移行し、腸10免疫恒常性を調節します。

PPs 内 TFH と GC B 細胞集団の同定と解析は、時間のかかる免疫モデルを必要とせず定常条件の下で液性免疫応答の動態を調査する研究者を可能にするかもしれないTFH GC B 細胞研究15,16,17,18で伝統的に使用。PPs 内 TFH 細胞を解析は他の細胞のサブセットと同様に簡単ではありません。技術的な課題には、理想的な組織の準備条件、表面マーカー抗体の組み合わせを識別するだけでなく、適切な正と負のコントロールを選択することが含まれます。TFH と PP の研究分野では、実験手続きの面で大きな変動性を示すし、いくつかの理由のために標準化されたプロトコルを確立する合意を授与から遠く離れています。まず、PPs 内各細胞のサブセットは、特異的細胞サブセット固有の方法でさらに変更を必要とする組織調製条件の影響を受ける傾向があります。第二に、安第三に、理想的な組織調製技術と実験条件調査プロトコル ベースの比較研究の数からのセルの準備の詳細について報告の方法の間で大きな差異があります。PP と TFH の研究はかなり限られています。

TFH や B 細胞指向 GC、PP 細胞調製19,20,21,22の提案した現在のプロトコル ベースの研究はありませんでした。さらに、PPs19,20コラゲナーゼ ベースの消化などをお勧めしますいくつかの組織調製条件がフローサイトメトリーによる TFH 同定の結果に悪影響を与える判明した18。これに基づき、私たちは PPs 内 TFH と GC B の細胞動態を研究するために使用できる最適化された、標準化された、再現性のあるプロトコルがこのトピックに取り組んでいる研究者に価値があると判断。この必要性は私たちの分離と細胞回復、生存率、およびいくつかの T および B の流れフローサイトメトリー評価の効率を最適に細かく PP リンパ球の特性の改善と最新プロトコルを生成するきっかけとなった細胞サブセット。また、必要な操作と PPs から組織・細胞の準備のための時間を減らすことにより、以前のプロトコルで提案されているいくつかの面倒な準備手順を除外する目指しました。

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プロトコル

機関動物ケアおよび使用委員会 (IACUC) ベス イスラエス ディーコネス メディカル センターのガイドラインの下ですべての研究とこのプロトコルで記述されている実験を行った。

1. 設計の実験の設定とマウス グループ

  1. (省略可能)共同実験的マウス実験的マウスの腸内細菌の水平伝播を容易にして PP リンパ球内で非固有の可変性を減らすための家します。また、同じ性別の濾胞を使用して変動を最小限に抑えます。

2. 外科的切除および組織の準備のステップ:

  1. 外科的切除小腸 (SI)
    1. CO2窒息または動物倫理委員会によって承認された同等のメソッドを使用してマウスを安楽死させます。
    2. 外科的切除のための専用の領域にマウスを転送します。裏面を置くし、70% エタノールで腹部をサニタイズします。腹部の皮膚と腹膜腹膜腔を開くので胸郭に恥骨から正中線に沿って切断することによって開腹したを実行します。
      メモ: は、腹腔内を貫通し、腸組織の損傷を避けるために皮膚の比較的小さい区域の最初の切開を行います。目的の解剖学的境界線まで切除を続行します。
    3. 盲腸は、小腸遠位のセグメントを構成する回腸末端部の検出のための理想的なランドマークを識別します。
      注: 盲腸は通常マウスの腹部の左下にあります。
    4. 回盲部の接合部を特定し、盲腸から小腸を分離することが可能として、遠位このレベルに切り付けます。次の手順では、全体ため壊れやすい PPs 崩壊タッチ時に簡単に腸管壁に過度の物理的な接触を避けてください。
    5. 優しくはさみを使って腸を切断することによって幽門括約筋まで小腸全体を削除します。幽門、十二指腸、間の接合部を特定し、腹腔内から腸の剥離を完了につながるこのレベルで十二指腸を切り取る。
      注: (i) を避けるため過伸展、これはの腸の壁の破裂を引き起こす可能性があります。(ii)腸間膜の脂肪を完全に除去が必要な PP リンパ球に加えて LP リンパ球の隔離が必要な場合。ただし、PP 分離のみ、残りの腸間膜脂肪でした提供するいくつかの利点それ以上の分離手順中にしたがって、それは保持する必要があります。
    6. 冷たい RPMI + 10% 牛胎児血清 (FBS) でいっぱい 6 ウェル プレートで小腸の戸を置き、腸内のすべてのセグメントが冷たいメディアで水中に沈むまで手動で組織を振といます。次の手順で氷の上の組織を維持します。
    7. マウス小腸の必要な数を解剖した後に、収集された小腸から PP 切除に進みます。
  2. PPs と単一細胞懸濁液の準備の外科的切除は:
    1. 優しく把持鉗子を使用して腸間膜脂肪、ペーパー タオルに小腸を転送し、ペーパー タオルに直面して腸間膜側を配置します。冷たい RPMI + 10% 腸管全体を湿らせて組織の脱水と粘りを避けるために政府短期証券。
      注: 残りの腸間膜脂肪することでこの段階で、SI の腸間膜のサイト上の脂肪質のティッシュのセグメント直面している反腸間膜のサイトを維持するペーパー タオルに固執するでしょう。
    2. PPs は、腸管壁の反腸間膜側に「カリフラワーのような」形で白い多葉状集計として表示されますを識別します。
      注: すべての PPs を切除まで、フラッシング、内腔のコンテンツは推奨されません。内腔のコンテンツを空に PPs の崩壊を引き起こす可能性があります、PPs と PPs の視覚的な識別のため非常に便利です, 腸管壁の色のコントラストを防ぎます。
    3. 抗腸間膜側に PPs を識別した後 PPs に手術の湾曲最後シザーを配置 (曲線上に向きます) の遠位と近位の境界線から PP を抑制します。
      指先を使用してシザーの刃に向けて優しく PP はオプション: プッシュします。この演習は、周囲 PP 非組織の良い排除に します。周囲の腸組織を除く、PPs を優しく、消費税します。
      注: (i) この手順から LP と腸上皮、T 細胞に富んでいるもなど腸内の区画を隣接セルの汚染を最小限に抑えながら最大の PP 細胞収率を取得することが重要です。(ii) から 1 つの SI c57bl/6 マウスから摘出した、5-10 PPs (平均サイズ、多葉状) を収集できます。までも小さい PPs (多葉状ではない) のコレクションを目指してマウス (C57BL/6) あたり 12-13 PPs がこのプロトコルを使用できます。
    4. 12 ウェル培養プレートに転送摘出 PPs は満ちて冷たい RPMI + 10 %fbs と鉗子または湾曲の外科はさみを使用しての維持の氷。
      注: (i) 直後に PPs の切除、粘液や PP 表面に腸内容で洗浄できますペーパー タオルの上にティッシュをこすりします。この手順では、PP 細胞の生存率を向上します。(ii) PPs をプレートに転送するの代わりにチューブを分離への転送も考えられる総サンプル数に応じて。
    5. オプション: PP 切除およびウェル プレートに後続の配置が完了したら、数と別の実験/マウス グループから収集した PPs のサイズことができます文書化する PPs を含む組織培養プレートの写真を撮るに。
    6. 50 mL コニカル チューブ RPMI + 10 %25 ml のセットを準備 (37 ° C に加温) FBS。1 mL ピペットで PPs の吸引ができる距離から 1,000 μ L チップのエッジをカットするはさみのペアを使用して。1 mL ピペットで PPs を吸引し、準備 50 mL の円錐管に 12 も組織培養プレートからそれらを転送します。
      注: は、サンプル間のクロスコンタミネーションを避けるために各マウスのサンプルのための新しいヒントを使用します。
    7. 蓋を保護し、125-150 rpm で 10 分間の連続攪拌と 37 ° C で軌道シェーカーでチューブを垂直方向に配置します。一方、50 mL チューブの新しいセットを準備し、単一細胞懸濁液の準備を通じて、各チューブの上に 40 μ m セル ストレーナーを配置します。
      注: (i) かくはん手順を PP リンパ球の回復、細胞生存率を減少しない場合は削除腸内のコンテンツ、粘液や細胞の残骸の残りが削除されます。(消化過程が細胞表面から CXCR5 式の劇的な損失を原因、PP 組織に消化酵素の任意の種類を適用されません ii)。
    8. ・攪拌後 40 μ m の細胞のストレーナーに転送、PPs は、新しく準備された円錐 50 mL チューブ上に配置。単一細胞懸濁液を生成するセル ストレーナーを介して PPs が中断される 10 mL シリンジのプランジャーの丸い側を使用して、優しく。15-20 ml の冷たい RPMI + 10% のストレーナーを洗浄 FBS。
      メモ: (i) 抽出前に PPs を水平方向に入りチューブを振ります。この短い揺れはセル ストレーナーに PPs の転送を容易にするため。(ii) 非リンパ系免疫細胞の隔離のため 70 μ m セル ストレーナを使用して (e.g。、単球、マクロファージ、DCs) をお勧めします。
    9. 4 ° C で 10 分間 350-400 x g で単一細胞懸濁液を遠心分離します。
    10. 慎重に上澄みを廃棄し、10 x 106セル/mL の濃度で細胞を再懸濁します。診断を使用してセルをカウントします。
      注: (i) セルがカウントする前マウス PP グループごとに総細胞数約推定できる次の数式を使用して:「0.5-1 x 10 の6セル (PPs の数) x = 総セル数"。トリパン ブルーのセルをカウントするため、さらに希釈は必要かもしれません。(ii) として手動カウントの代わりに、自動化された細胞カウンターを使用できます。
    11. 適切なボリュームの 10 の6セル × 2 2.5 を転送 (e.g。、200 μ l) 96 ウェル丸底プレートに。
      注: 単色および否定的なコントロールのサンプルは、0.5-1 x 10 の6セルがあります十分です。
    12. 4 ° C で 5 分間 350 x g でプレートを遠心分離します。プレートにフリックします。
    13. 染色バッファーの 200 μ L のセルを洗浄します。

3. 表面抗体の汚損

  1. 生存率は染色:
    1. 最終的な洗浄の後に、100 μ L の PBS (1:1, 000) で希釈した修正可能性色素で細胞を再懸濁します。氷や闇の 4 ° C で 30 分間インキュベートします。
      注: (i) 細胞内染色の重要な転写の検出 Foxp3 などの要因や Bcl 6 セルの固定が必要です。その場合、非修正可能な生存の染料 (e.g。 DAPI 7 AAD, ) は使用できません。(ii) 修正可能性色素を希釈するタンパク質を含む染色バッファーを使用しないでください。この手順で使用されるメディアは、タンパク質無料する必要があります。(死んだ細胞を false につながるかもしれない流れフローサイトメトリー分析蛍光を発光、結合の表面抗体特異的、深刻な技術的な問題を引き起こすので、iii) 生存の染色を使用して死んだ細胞の排除は重要です肯定的な結果。
    2. 染色バッファーで 2 回洗浄を行う。350 x g で 4 ° C で 5 分間遠心プレートにフリックします。
  2. Fc ブロックおよび表面の層 i:
    1. 染色バッファーで抗体抗 CD16/32 (レバレッジ) を希釈して Fc ブロック ソリューションを準備します。
    2. Fc ブロックの調製した溶液の 20 μ l 細胞を再懸濁します。氷の上の 15 分間インキュベートします。
    3. 洗浄せず表面抗体カクテル 80 μ L は適切な希薄で準備 (概要の抗体の表 1を参照) を追加します。氷上で少なくとも 30 分間インキュベートします。
    4. 過剰な染色バッファーを追加して 2 回洗います。350 x g で 4 ° C で 5 分間遠心プレートにフリックします。
  3. 表面の層 II:
    1. 螢光色素標識ストレプトアビジン染色バッファーで希釈することによってストレプトアビジン染色液を準備します。
    2. 最終的な洗浄の後に、染色液を希釈ストレプトアビジン (1: 100) 100 μ l 細胞を再懸濁します。暗闇の中で氷の上に少なくとも 15 分間インキュベートします。
    3. 染色バッファーで 2 回洗浄します。350 x g で 4 ° C で 5 分間遠心プレートにフリックします。
      オプション: 細胞内染色の濾胞性制御性 T 細胞の検出が必要ない場合は、最後の洗浄後が 200 μ L の染色バッファーと流れの cytometer でデータを取得する適切なチューブに転送で細胞を再懸濁します。サンプルが固定されていない場合、正確な結果を得るために 3-4 時間以内フローサイトメトリーによるデータの取得を行ってください。

4. セル固定

  1. 固定/透過 (修正/パーマ) Foxp3/転写因子染色バッファー設定から試薬を使用して実用的なソリューションを準備します。固定/透過目的の最終的なボリュームに希釈剤の 3 つの部分と固定/透過の一部分の集中をミックスします。
  2. 最終的な洗浄の後に、作業の修正/パーマ液 200 μ l 中で細胞を再懸濁します。
  3. プレート氷の上または 20 分のための 4 ° C で孵化させなさい。このステップの 20 分を超えないようにします。長いインキュベーション時間細胞回復が大幅に低下可能性があります。
  4. 350 x g で 4 ° C で 5 分間遠心プレートにフリックします。(省略可能)この手順の後固定セルをウシ血清アルブミン (BSA) を含むバッファーを染色で 4 ° C で数日間保存ことができますまたは後続の細胞内汚れるか、または流れの cytometry 買収まで FBS。
  5. 透過バッファー (x1) たて精製脱イオン水で希釈済みの 200 μ L で細胞を再懸濁します。
  6. 部屋の温度 (RT) で 5 分間 350 × g で遠心分離機します。
  7. 透過バッファーと 350 × g で遠心する室温 5 分の 200 μ L で 1 回洗浄します。

5. 細胞内染色

  1. Fc ブロック ソリューションを準備するには、透過バッファーで抗体抗 CD16/32 (レバレッジ) を希釈します。
    注: 固定ステップの後、細胞維持されなければならない透過バッファー内細胞内染色のプロセスが終了するまで。
  2. 最終的な洗浄の後に、Fc ブロック ソリューションの 20 μ l 細胞を再懸濁します。暗闇の中で RT で 10-15 分の間孵化させなさい。
  3. 洗浄せず細胞抗体カクテル (100 μ L 最終巻) 透過バッファーで希釈済みの 80 μ L を追加します。室温 30 分間インキュベートします。
  4. 右で 5 分間 350 x g でパーマ バッファー、および遠心分離機の 100 μ L を追加します。
  5. 透過バッファーの 200 μ L で 1 回洗浄、右で 5 分間 350 × g で遠心分離
  6. 最終的な洗浄の後染色バッファーの 200 μ L で細胞を再懸濁します適切な管 (染色バッファーで 400 μ L の最終巻) にセルを転送し、フローサイトメトリーによるデータを取得します。プレート リーダーのオプションを持つ流れの cytometer が利用可能な場合、管に転送することがなく、96 ウェル プレートでステンド グラス サンプルを実行もあります。この手順では、セルを転送する時にセル損失を最小限に抑えます。
  7. GC B 細胞だけでなく、TFH、出生率の再現性の高い分析を実行できるようにする流れの cytometer でセルの総数が 5 x 105の最小値を取得します。

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結果

以前のプロトコル20と対照をなして PPs は SI 全体均等に配布されていないに示すように、SI の遠位と近位端に向かってより密ローカライズを観察している図 1 a.フローサイトメトリーによる解析を示した場合、我々 のプロトコルと脾細胞 (図 2 a、E、および2 D, H) と同様の前方側方散乱分布を示す PP リンパ球の人口に与えること、> 95% のセル生存率 (図 2 bおよび2 階)。その他二次リンパ器官 (Slo) と対照をなして c57bl/6 マウスで PP リンパ球の合計の約 70-80% から成っている B 細胞に対し CD4+...

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ディスカッション

ここでは、TFH および GC B 細胞の流れフローサイトメトリー評価のために最適化されたプロトコルについて述べる。プロトコルの主要な利点の 1 つは、任意の消化プロセスがなければ最大 107 (平均 4-5 x 10 の6セル) 単一のマウス (C57BL/6 ひずみ) から合計 PP 細胞の分離できます。総細胞収量が PPs の数と正の相関は、実験計画のために有用である次の単純な式から推定することができる観察:"マウスあたり合計 PP 細胞数 = 0.5-1 x (摘出 PPあたりの数マウス) x 106"。この高い細胞収量が強化されたセル実行可能性に補完された (> 95%)。改良された細胞の回復と生存率並列でパネルを染色多様な抗体を用いた PPs の各種リンパ球サブセットのフローサイトメトリーによる解析を実行することを許可しました。

最近の PP 隔離のプロトコルでは、De イエスら刊と比較。20と前レポート...

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開示事項

利害の対立が宣言されていません。

謝辞

役に立つ議論のローラ シュトラウス、ピーター ・ セージを感謝し、フローサイトメトリー解析でサポートしたいと思います。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
抗マウスCD4抗体eBioscience, Biolegend*17-0041-81 ,10054*詳細については、表1、
抗マウスCD19抗体eBioscienceMA5-16536詳細については、表1
抗マウスPD-1抗体eBioscience61-9985-82詳細については、表1
抗マウスICOS抗体、eBioscienceを参照詳細については表1
抗マウスGL7抗体Biolegend144610詳細については、表1
抗マウスCXCR5抗体、Biolegend*、BD Bioscience145512*、551960詳細については、表1
抗マウスBCL-6抗体Biolegend358512詳細については、表1
抗マウスFoxp3を参照。抗体eBioscience17-5773-82詳細については、表 1
Streptavidin-BV421BD Bioscience563259詳細については、表 1
FixableViability DyeeBioscienceL34957を参照してください。詳細については、表 1
7AADBiolegend420404詳細については、表 1
FcBlock (CD16/32) を参照してください。BD Bioscience553141詳細については、表 1
コラゲナーゼ IIワージントンLS004176
コラゲナーゼ IVワーシントンLS004188
Foxp3/転写因子染色バッファーセットeBioscience00-5523-00
6ウェル、12ウェル、96ウェルプレートファルコン/コーニング353046,353043/3596
50 mLコニカルチューブFalcon3520
40 & micro;m細胞ストレーナーFalcon352340
10 mLシリンジプランジャーExel INT26265
RPMICorning15-040-CV
PBSCorning21-040-CM
FBSAtlanta BiologicalsS11150
オービタルシェーカーVWRModel 200
湾曲した端のはさみ
細かい鋸歯状の鉗子
小さな湾曲したはさみ
、を参照、、、を参照、、、、、を参照、、を参照、、、、、 を参照してください。

参考文献

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