体外流れ球サブポピュレーションの募集の同時研究

サマリー

ここでは、単球 subpopulation の特定の表面マーカーと共焦点蛍光顕微鏡を用いて in vitro における流動場下における人身売買対策統合のプロトコルを提案する.このプロトコルは、他の特定の表面マーカーを使用して他の白血球のサブタイプをプロファイルとして順次募集手順同様を探索する使用できます。

要約

ターゲットの末梢組織に血液中から単球の採用は、組織の損傷、腫瘍の開発、自己免疫疾患の中に炎症性プロセスに不可欠です。これは、基になる影響を受ける組織に接着や内皮下移行 (輪廻) が続いて活性化の内皮細胞の管腔表面に自由な流れからのキャプチャのプロセスによって実現されます。ただし、単球サブポピュレーションの優遇とコンテキスト依存の募集をサポートするメカニズムはまだ完全に理解しました。そこで、同時に可視化し、流動場下における測定に異なる単球サブポピュレーションの採用を可能にする方法を開発しました。タイムラプス顕微鏡を用いたイメージング、に基づいて、このメソッドは明確な付着性と転生の球を区別することができます。ここでは、このメソッドを使用して、同時にプロ血管新生と血管新生の非単球の in vitro の募集カスケードを勉強する方法について述べる。さらに、このメソッドは、最大 3 つの単球集団のリクルートの別の手順を勉強する拡張できます。

概要

単球は、損傷した組織、血管新生、癌^{1,2,3 を含む多くの疾患の病態をクリーンアップする病原体と戦うために不可欠な免疫の貪食コンポーネントを構成します。}.単球は骨髄由来細胞が血液中を循環するが、特定の分子機構を末梢組織における炎症のサイトに募集することができます異種の集団から成る。白血球は、単球の募集カスケードは一般に、キャプチャ、圧延、クロール、逮捕、内皮下浸潤 (輪廻)、血管壁 (基底膜と壁画を通じて移行などの異なる手順を関係づけるセル)⁴。これらの手順は主にセレクチンのリガンドなどの白血球に注目している、糖タンパク質リガンド、ケモカイン、細胞と接合部の接着分子、その受容体など、内皮細胞内腔で炎症誘起分子を含むインテグリンです。血管内皮細胞の接合点 (傍細胞) や内皮細胞体 (transcellular) を通じて人身取引の経路は、内皮バリア⁵を横断する白血球により使用できます。単球は歴史的に transcellular ルートを通じて霊界に記載されている、しながら、単球はもはや均質の細胞集団を考えられているように、渡り鳥の経路に潜在的な相違が提案されている.多様性単球ごとの相違点と共通点の定義することができます、彼らの独特の血管外漏出に対するカスケード^3,6ことが明らかとなりつつあります。したがって、明確に、単球集団間差別するために可視化することが重要だし、募集中のこれらの異なる集団のそれぞれの行動の表現型を処理します。

人間から単球、ブタ、ラット、マウス特定の生得的機能と特定の渡り鳥動作^7,8,9形質集団に分割されました。たとえば、ヒトでは、単球が細菌リポ多糖のコレセプター CD14、CD16、Fc γ レセプター III の表面表現に基づく 3 つのサブセットに分けることが。ひと単球のサブポピュレーションを含めるクラシック CD14⁺CD16^-、CD14 を中間⁺CD16⁺と非古典的 CD14^薄暗いCD16⁺細胞^6,9。古典の CD14⁺CD16^-単球は、主に炎症性であることを示したに対し CD16 のプール⁺単球は現在 TIE2 発現と血管新生関数¹⁰総称して発見されました。一貫して、人間の腫瘍の壊死などの炎症性サイトカインと内皮細胞刺激因子 (TNF) α やインターロイキン (il-1) ベータ (従来の炎症) は古典的な CD14 の完全な募集をトリガーするのに十分な⁺CD16^-単球。ただし、血管内皮増殖因子 (VEGF) と tnf α (血管新生因子による炎症) の同時作用が、CD16 の輪廻を挑発する必要⁺単球³の血管新生プール。歴史的には、伝統的な Transwell 静的な条件、平行平板の流れ区域や μ スライド流室制度は、時間の in vitro^{11 で 1 つの末梢血白血球ポピュレーションの募集を定量的に解析に使用されています。 ,12,13}。これらのプロトコルを検証しながら複数の単球サブポピュレーションの同時解析を許可より強固な方法がより洞察力があると見なされます。このような手法必要があります複数の対話および各それぞれの人口の異なる周波数のアカウントし、類似点と特異性のメカニズムの理解は、各単球を定義する募集カスケードサブセット。

同時に共焦点顕微鏡を用いた研究に異なる単球サブポピュレーションの渡り鳥のカスケードを可能にする流動場下における単球採用のタイムラプス イメージングに基づく方法を紹介します。このメソッドは、単球後毛細血管細静脈の循環の血行動態、白血球動員の生体内での主要な場所と同様に、血管内皮細胞炎症を模倣する特定の重要な機能を統合します。提案手法は、ひと臍帯からの分離の確立されたプロトコルを介して生成されるひと臍帯静脈血管内皮細胞 (新生活) を使用します。この臨床のリソースも臍静脈から分離でき、血管内皮細胞の合理的な利回りを提供しながら生物学的副産物として簡単に利用できるという利点があります。我々 も蛍光色素や蛍光を別の細胞成分と共焦点顕微鏡による単球の位置 (abluminal 対内腔) の明確な定義を区別する使用時間をかけて。ここで提示されたプロトコル開発した同時に測定する単球サブポピュレーションの転生レベル。また、他の白血球サブポピュレーションや採用プロセスを研究するこの方法を異なるバイオ マーカーおよびラベルの使用によって拡張できることに注意してください。

プロトコル

人間の材料は、ボランティア ドナーとスイス臨床研究倫理委員会に従ってインフォームド・コンセントと使用されました。

1. 分離と凍結ひと臍帯静脈血管内皮細胞 (株)

1. 螢光分離を開始する前に、37 ° C で 30 分間 T75 フラスコ (0.1 mg/mL コラーゲン G とリン酸緩衝生理食塩水 pH 7.4 PBS で 0.2% のゼラチン) にコーティング溶液 5 mL を追加します。
2. PBS のコードをきれいに、滅菌湿布を拭き、滅菌 20 cm シャーレに配置。滅菌ハサミでコードの端をカットします。
3. 単一の大きい静脈と 2 つの小動脈を特定します。優しくコード両端静脈下肢にそれに付す三方活栓でカニューレを挿入します。
4. コードとワイヤーの長さとしっかりとカニューレの接続を締めます。
5. 100 U/mL ペニシリン、100 U/mL ストレプトマイシン 250 ng/mL コードの静脈を洗うアムホテリシン B を含む RPMI 培地 20 mL で 2 回コードを灌流します。このプロセスは、コードの外観をより白くより明確になります。コラゲナーゼ加算の前に静脈を空には、一方の端に注射器で、RPMI を収集します。
6. 1 mg/mL コラゲナーゼ型の 12 ml 静脈灌流私 (0.22 μ m フィルター)。
7. すぐコードで活栓を終了し、12 分の 37 ° C でコードを孵化させなさい。
8. 静脈腔から血管内皮細胞をデタッチするのにはコードを優しくマッサージします。
9. 50 mL の注射器で 10% 牛胎児血清を含む RPMI 30 mL をとり、臍帯の一方の端に接続します。
10. 臍帯のもう一方の端に空 50 mL 注射器を接続します。
11. 活栓を開き、もう一方の端から相互を集めながら端から端まで静脈を灌流します。
    注:収集した懸濁液には、内皮細胞が含まれています。
12. 200 x gで 5 分でこの細胞懸濁液を遠心します。
13. 上澄みを廃棄し、10 ml の完全 M199 培地 (20% の FCS を含む、15 μ g/ミリリットルで内皮細胞増殖サプリメント M199、100 μ g/mL のヘパリン ナトリウム、0.5 μ M のヒドロコルチゾン、10 μ G/ml L-アスコルビン酸、100 U/mL ペニシリン、100 U/mL の細胞ペレットを再懸濁しますストレプトマイシンと 250 ng/mL アムホテリシン B)。
14. T75 フラスコからコーティング ソリューションを削除し、PBS で 1 回洗浄します。
15. 種子セル T75 フラスコに 1.13 のステップから収集し、5% CO₂と 37 ° C でインキュベーターで置きます。
16. 次の日は、残留の赤い血液細胞を削除しの変更媒体合流点まで 2 日おきに完全 M199 培地で 3 回フラスコをすすいでください。
17. 80-90% の合流点で 5 mL の PBS と一度血管内皮膜を洗浄、5 ml の M199 5 分追加 4 mL、1 mL のトリプシンのアクションを停止する FCS の 37 ° C で 1 mM EDTA で 0.05% トリプシンの細胞を切り離します。すべての血管内皮をデタッチするフラスコをフラッシュします。
18. VE カドヘリン PECAM 1、gp38、汚損に使用して、血管内皮の純度を確認するフローサイトメトリーによる分析に 50 μ L の因数を収集します。
19. 室温で 5 分間 200 x g で 15 mL の管および遠心分離機のステップ 1.18 から新生活の残りの部分を収集します。
20. ステップ 1.19 から上澄みを廃棄、cryotubes で 5 × 10⁵セル/ml の密度で凍結溶液 (10 %dmso を含む FCS) で細胞ペレットを再懸濁します、-80 ° c または液体窒素を使用するまで凍結します。
21. 螢光純度を確認: する
    1. 1.18 のステップで収集した螢光を 50 μ l 添加の因数に抗ポドプラニン APC 抗体の 1 μ L、1 μ L 抗ひと PECAM1 PE 抗体の抗ひと VE カドヘリン FITC 抗体の 1 μ L を追加します。
    2. 10 分間室温でインキュベートします。
    3. 400 x g 30 で 100 μ L の PBS と遠心分離機を追加 s。
    4. 上澄みを廃棄し、100 μ L の PBS に再懸濁します。データは流れ cytometry 技術で今すぐ取得できます。
       注:新生活はポドプラニンの陰陽である VE カドヘリンの PECAM-1 です。

2. 血管内皮が霜取り

注:(最大 5 通路) の実験のための低い通路では、血管内皮を使用します。

1. 30 分の 37 ° C でコーティング溶液 1 mL と T75 フラスコをコートします。
2. 2 分の 37 ° C で新生活を defreeze かつ完全な M199 の 10 mL の細胞を再懸濁します。
3. 200 x gで 5 分間室温で細胞を遠心分離し、上澄みを廃棄します。
4. 完全な M199 の 10 mL の細胞ペレットを再懸濁します。
5. プレコート フラスコ細胞懸濁液を転送します。5% CO₂と 37 ° C でインキュベーターでフラスコを配置します。2 日ごとに細胞培養培地を変更します。

3. 新生活文化 0.4 μ スライド室

1. 流れの実験を開始する前に 5 日間は、0.1 mg/mL コラーゲン G、30 分の 37 ° C で 0.2% のゼラチンを含んでいる PBS の 30 μ L で 0.4 μ-スライドの部屋事前コートします。
2. 100 μ L の PBS とチャンバーを洗います。
3. T75 フラスコの 80-90% コンフルエント新生活から細胞をデタッチします。
4. 5 mL の PBS で新生活を洗い、5 ml の 5 分の 37 ° C で 0.05% トリプシンの切断します。
5. フラッシュし完全な M199 に細胞懸濁液を収集し、最も便利な方法でセルをカウントします。室温で 5 分間 200 × gで遠心分離機します。
6. 10⁶セル/ml 細胞ペレットを再懸濁し、商工会議所あたり 30 μ L (30,000 細胞) を配布します。
7. 1 h の 5% CO₂と 37 ° C でインキュベーターでセルを孵化させなさい。
8. 各商工会議所に完全な M199 の 150 μ L を追加し、37 ° C、5% CO₂でインキュベーターで 5 日間培養します。2 日ごとに媒体を変更します。

4. 新生活流動場下における単球採用試金のための汚損

1. M199 と 1 μ M CMFDA (5 chloromethylfluorescein ・ ジアセテート) の作られたラベルのメディアの準備し、細胞ラベリング前に 5 分の 37 ° C に温めてください。
2. 37 ° C で暖められた M199 培地で 2 回洗う新生活
3. 温めたラベリング培 CMFDA の 1 μ M の 30 μ L で媒体を交換し、37 ° C、5% CO₂で 10 分間定温器に配置します。
4. 完全な M199 で 1 回洗浄し、30 分の 37 ° C、5% CO₂でインキュベーターで完全な M199 とセルを孵化させなさい。
   注:ラベリング溶液添加前に血清中のすべてのトレースを削除することが重要だ、それ以外の場合それは螢光染色を変更可能性があります。
5. いずれかの人間の tnf α を含む完全な M199 と媒体を交換 (500 U/mL) または人間の tnf α のミックス (500 U/mL) 人間 VEGFA と (1 μ g/mL) 37 ° C、5% CO₂でインキュベーターで 6 時間。

5. 分離人間パン単球のサブポピュレーションの染色

1. 集中して人間の血のバフィー コートまたは EDTA バキュテナー管実験の日に収集された新鮮単離の人間血 20 mL を使用します。
2. PBS 1 mM EDTA (1:1) で血液を希釈し、優しく密度勾配メディアの 20 mL の上に希釈血液の 20 mL のピペットします。遅い加速とブレーキなしの室温で 30 分間 400 × gで遠心分離機します。
3. 末梢血単核球 (PBMC) の収集-40 mL の PBS-1 mm EDTA を含む新しい 50 mL チューブに (密度勾配メディアとプラズマ層) の間の血小板層。最大 50 mL の PBS-1 mM EDTA をトップします。
4. 室温で 200 x gで 5 分間遠心上清を破棄します。
5. 10 mL の染色バッファー (PBS-1 mM EDTA の 0.5% ウシ血清アルブミン BSA を含む) と細胞ペレットを再懸濁します。
6. 室温で 200 x gで 5 分間遠心上清を破棄します。
7. 5.5、5.6 の手順を繰り返します。
8. 10 ml のバッファーを染色の細胞ペレットを再懸濁します。細胞数の 10 μ L の因数を取る。
9. PBMC 集団を確認し、流れの cytometer で急激にセルをカウントします。
   注:特徴的なリンパ球と単球の集団は、(図 1 a) を観察できます。について期待して新鮮な人間の血の 50 mL から 50-100 × 10⁶ PBMC。
10. Cd14対CD14-PBMC 流動下での募集のため。
    1. フロー バッファーの 3 回餌を洗浄 (M199 0.5 %bsa を含む) と 1 mL あたり 6 x 10 の⁶セルでフロー バッファーの単核細胞を再懸濁します。
    2. 200 μ L 各試金のための因数を作る。アッセイの前に 20 分までは、37 ° C で孵化させなさい。
    3. 抗 CD14 PE のヘキスト 33342 2 μ M の最終濃度 5 μ L をそれぞれ因数に追加します。混合し、37 ° c 10 分間加温します。
    4. 400 x g 30 で因数を遠心分離機 s。
    5. 上澄みを廃棄し、フロー バッファーの 200 μ L でペレットを再懸濁します。
11. 流動場下における単球サブポピュレーションの募集:
    1. 製造元の指示に従ってパン単球分離キットで単球を分離します。
       注:次の隔離のプロトコルは、50 x 10 の⁶セルです。それ拡張できます上下に製造元の推奨事項内にある限り。
    2. 200 x gで 5 分間室温の PBMC 懸濁液を遠心します。
    3. 上澄みを廃棄し、バッファーを染色の 400 μ L でペレットを再懸濁します。
    4. Fc 受容体ブロック試薬を 50 μ l 添加とパン単球抗体カクテルの 50 μ L を追加します。
    5. 10 分間室温でインキュベートします。
    6. 染色バッファーと磁気ビーズ共役反ビオチン抗体の 100 μ L の 400 μ L を追加します。15 分間室温でインキュベートします。
    7. 2 mL の染色バッファーを追加し、磁石と相まって MAC LS 列を使用します。
    8. 磁石で LS 列を置き、染色バッファーの 1 つの mL を追加します。流れを破棄します。
    9. 列の PBMC の懸濁液を渡すし、新しい 15 mL チューブにパンの単球を含む、明確なフローを収集します。
    10. 5 mL をトップに染色バッファーを追加します。
    11. 硫酸を取るし、流れの cytometer による単球の分離の品質をチェックします。
    12. パン単球数を決定します。
        注:単球の人口だけが見られる(図 1 b)。
    13. 200 x gで 5 分でステップ 5.11.11 から単球の残りの部分を遠心します。
    14. 上清を捨てます。
    15. 5 mL のフロー バッファーで細胞ペレットを再懸濁します (M199 0.5 %bsa を含む)。
    16. 5.11.13 に 5.11.14 EDTA の痕跡を除去するために 2 回を繰り返します。
12. 単球の懸濁液は流れ、6 x 10⁶セル/ml (0.5 %bsa を用いた M199) をバッファーします。
13. 各募集の試金のための単球 200 μ L の因数を作る。
14. インキュベーターの 37 ° C で 20 分注入前に、まではろを維持します。
15. 各因数に抗 CD16 PE 抗体とヘキスト 33342 (最終 2 μ M) の 5 μ L を追加します。
16. 混合し、37 ° c 10 分間加温します。
17. 400 x g 30 で因数を遠心分離機 s。
18. 上澄みを廃棄し、フロー バッファーの 250 μ L でペレットを再懸濁します。
19. 共焦点顕微鏡のアクイジション ・ パラメーターを設定するためにスライドの 1 つの区域で単球懸濁液 30 μ L を追加します。
20. 37 ° C で 5.18 ステップから単球懸濁液の因数を維持します。
    注:この懸濁液は流れシステムで注入されます。

6. 流体システムの準備

1. 37 ° C で設定用セル インキュベーターは、します。
   注:流システムの図は、図 2にとおりです。
2. チューブ部 i: 組み立てルアーロック コネクタ オス シリコーン チューブ (8 cm 長く、3 mm 厚) の部分の 1 つの端を挿入し、ラインにルアー インジェクション セットにもう一方の端を接続します。シリコーン チューブ (40 cm、厚さ 3 mm) の部分に後者のルアーロック コネクタを接続 1 つ終わり。
   注:必要に応じて、ラインにルアー注入セットと最終的な空気泡除去のためチューブ シリコン 5 mL 注射器に接続されている 3 ウェイ タップを挿入できます。
3. チューブ ii を組み立てる: シリコーン チューブ (長さ 1 m、厚さ 3 mm) の長さの 1 つの端に 20 mL 注射器を接続します。ルアーロック コネクタ オス管のもう一方の端を挿入します。
4. 接続部 I および II 管をルアー コネクタ男性女性ルアー ロック カプラー (図 2 a) を挿入することによって部。
5. 37 ° C で暖められたフロー バッファー (M199 + 0.5 %bsa) を含む貯水池側のシリコン チューブを入れ
6. フロー バッファーとチューブに合わせて 20 mL シリンジのプランジャーを引きます。
7. ポンプの注射器に置き、固定します。
8. ポンプの設定でモードを撤回するではなく吹き込む) と流量を指定します。
9. 次の数式を使用して、使用する IBIDI スライドによると流量を決定します。
   
   注: スライド率は実験用 IBIDI スライドに依存しています。Μ-スライドの私^0.4この例では、スライドの要素で使用されているロックが 131.6。特定のスライドの要因、会社ウェブサイト¹⁴を参照してください。フロー バッファー粘度は 0.0072 dyn.s/cm²です。後毛細血管細静脈のせん断応力は約 0.5 の dyn/cm²です。
10. スライド (図 2 b) に接続します。
    1. 女性のルアーロック ロック カプラー周りのシリコン チューブをクランプ、カプラーから 2 つのルアーロック コネクタ男性を外します。
    2. 刺激血管内皮と培地での塗りつぶしを含むスライドの貯水池にそれらを接続します。このステップの間に空気の泡を避けるため。
    3. クランプ離陸し、接続が漏れていないことを確認します。
11. タイムラプス イメージングのための顕微鏡下でスライドしポンプを起動します。

7 共焦点顕微鏡による流動場下における単球採用のタイムラプス イメージング

1. 40 x 目的を使用して (材料の表を参照) 用。
2. 405 をアクティブに nm (青単球核)、488 nm (緑内皮細胞)、561 nm (赤 CD16 + サブセット) のレーザー。
3. アクイジション ・ パラメーターを設定するのには単球を含む商工会議所を使用します。
   注:非転生し、転生の両方の球を検出するためには、ピンホールとレーザ 405 nm の強さが高に設定されます。したがって、非転生の単球は少し根元の計画に表示されます。しか転生単球は内皮細胞下に新しい領域に対応する核周辺の無染色を提示します。
4. 顕微鏡下で取得するチャンバーを配置します。
5. マルチ ポジション共焦点イメージングのため 1 cm 半径内のビューの 3 つのフィールドを選択します。
6. 基底と内皮細胞の頂端側を定義します。
7. Z スタックを 10-12 μ m 範囲 (0.5 μ m ステップ) に設定します。1 分毎時間経過の取得を実行します。
8. イメージングの 3 分後にラインにルアー注入ポートを介して単球懸濁液 (6 x 10⁶セル/mL) の 200 μ L を注入します。
   注:急速に単球が付着、輪廻 (基底の計画に頂端からトランジット) を開始に頂面上に表示されます。
9. 少なくとも 30 分のイメージです。終わったら、画像を停止し、流れを止めます。スライドからそれらを切断するチューブをクランプします。
10. 10 分の 4 ° C で 4% パラホルムアルデヒドでスライドを固定します。
11. PBS でスライドを洗浄し、さらなる分析の必要な場合は 4 ° C でスライドを保存します。

8. ImageJ によるデータを分析します。

1. 各フィールドの合計付着性単球の数を数えます。Mm²あたりの細胞数を決定します。
2. 転生の単球が内皮細胞下に基底の計画に存在し、核の周り (グリーン チャンネル) でブラック ホールの存在によって識別されたをカウントします。
3. 付着性白血球の総数によって転生白血球の数を分割します。移住率は付着性単球の割合として表示されます。
4. 図では、ための樹状突起と基底の側面のこれらの内皮細胞コンパートメントのそれぞれで発生するイベントを説明するために同時に表示できます。

結果

Tnf α によって誘導される血管内皮活性化の状態の判断

炎症性サイトカイン tnf α の生物活性は、バッチと凍結融解サイクルの補充によって異なります。Tnf α の治療と血管内皮のライセンス認証の状態をチェックすることが重要です。これは、並列に注目している、icam-1 および VCAM 1^15,16,17の炎症の誘導の合流の螢光のいくつかのサンプルの汚損によって実行でした。Tnf α の治療は血管内皮細胞炎症性ストレスによって表示形態変化後血管内皮のライセンス認証の状態を確認する簡単でシンプルな方法。図 3に示すとおり、螢光を物質の細胞と比較して tnf α 存在下で 6 時間後細長い。比較は、tnf α と...

ディスカッション

単球サブポピュレーションが炎症血管内皮膜を通して生まれ変わる方法の研究を詳述した手法を報告する.議論の方法は、位相差顕微鏡検査、また、単球の流れ^3,11,19の下で採用を検討するものです代わりに共焦点顕微鏡を使用しました。タイムラプス イメージング用共焦点顕微鏡を使用しての主な利点の 1 つは、輪廻と単球の接着力が強力との間を明確に判別する能力です。位相差顕微鏡ベース方法は堅牢なも、転生の細胞と強く付着細胞との混同を避けるために専門知識が必要です。この場合、1 つは単球採用カスケードのこれらの 2 つの状態間の明確な違いを作るために分析のための厳格な基準を確立する必要があります。また、位相差顕微鏡で観察する世界の動向を確認するために、共焦点顕微鏡によるエンドポイント解析を行うことが重要ですも。したがって、単球の流れの下で採用を検討する共焦点顕微鏡の直接使用は、キャプチャされた単球の実際輪廻状態で明確な結果を提供します。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
組織培養フラスコ 75 cm2	TPP	90076	単離されたHUVECのルーチン培養
µ-スライドVI 0.4	IBIDI	80606
遠心分離チューブ 15 mL	TPP	191015
遠心分離チューブ 50 mL	TPP	191050
コラーゲンG	バイオクロム	L 7213	細胞培養のコーティング用フラスコゼ
ラチン	Sigma-Aldrich	1393	培養フラスコ
Dulbecco'のコーティング用リン酸緩衝生理食塩水(MgCl2およびCaCl2を含まない)	Sigma-Aldrich	D8537
Dulbecco'リン酸緩衝生理食塩水(MgCl2およびCaCl2)	Sigma-Aldrich	D8662
RPMI-1640 中型	Sigma-Aldrich	R8758
3方向ストップコック	BIO-RAD	7328103
ペニシリン10,000 μ/mL ストレプトマイシン10,000 μg/mL 菌類ゾーン 25 μ/mL	AMIMED	4-02F00-H
コラゲナーゼ 1 型	Worthington	LS004216
Medium 199 1x avec アール塩、L-グルタミン、25 mM Hepes	GIBCO	22340020
ウシ アルブミン画分 V	サーモフィッシャー	15260037
内皮細胞増殖サプリメント、150 mg	ミリポア	02-102
ヘパリンナトリウム	Sigma-Aldrich	H3149RT
ヒドロコルチゾン	Sigma-Aldrich	H6909
L-アスコルビン酸	Sigma-Aldrich	A 4544
EDTA二ナトリウム塩二水和物C10H14N2Na2O8 · 2H2O	APPLICHEM	A2937.0500
CD144(VE-Cadherin)、ヒト組換えクローン:REA199、FITC	Miltenyi Biotech	130-100-713	AB_2655150
CD31-PE抗体、ヒト組換えクローン:REA730、PE	Miltenyi Biotech	130-110-807	AB_2657280
抗ポドプラニン-APC、ヒト組換えクローン:REA446、APC	Miltenyi Biotech	130-107-016	AB_2653263
BD Accuri C6 Plus	BD Bioscience
µ-Slide I Luer	IBIDI	80176
CMFDA (5-クロロメチルフルオレセインジアセテート)	ThermoFisher	C2925
組換えヒトTNF&α;	Peprotech	300-01A
組換えヒト VEGFA	Peprotech	100-20
NE-1000 プログラマブル シリンジ ポンプ	KF テクノロジー	NE-1000
Ficoll Paque Plus	GE Healthcare	17-1440-02
抗ヒトCD14-PE、ヒト組換えクローン:REA599、PE	Miltenyi Biotech	130-110-519	AB_2655051
Pan Monocyte Isolation Kit、ヒト	Miltenyi Biotech	130-096-537
抗ヒトCD16-PE、ヒト組換えクローン:REA423、PE	Miltenyi Biotech	130-106-762	AB_2655403
LSカラム	Miltenyi Biotech	130-042-401
QuadroMACS セパレーター	Miltenyi Biotech	130-090-976
Hoechst 33342、三塩酸塩、三水和	ThermoFisher	H1399
シリコンチューブ	IBIDI	10841
エルボールアーコネクター	IBIDI	10802
メス ルアーロックカプラー	IBIDI	10823
ルアーロックコネクタ メス	IBIDI	10825
インライン ルアー注入ポート	IBIDI	10820
Ar1 共焦点顕微鏡	ニコン
40倍対物レンズ	ニコン	40x 0.6 CFI ELWD S 平面 蛍光 WD:3.6-2.8mm 補正 0-2mm
ImageJ ソフトウェア	NIH