方法論記事

ゼブラフィッシュ胚モデルにおける生体内可視化と生体材料の生体解析黄色ブドウ球菌感染症

DOI：

10.3791/58523

⸱

2019年1月7日

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Medical Microbiology, Amsterdam UMC, 2Technical Medical Center, Department of Biomaterials Science and Technology, University of Twente, 3Department of Biomedical Engineering, W.J. Kolff Institute, University Medical Center Groningen, University of Groningen, 4Institute of Biology, Leiden University

この記事について

サマリー

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

本研究では、生体内可視化と蛍光顕微鏡を基バイオマテリアル関連感染の生体内解析のためのゼブラフィッシュ胚モデルについて説明します。このモデルは、生体内での生体関連感染症を研究するためマウス モデルなど哺乳類の動物モデルを補完する有望なシステムです。

要約

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

生体材料関連感染 (BAI) は、バイオマテリアル ・医療デバイスの障害の主要な原因です。黄色ブドウ球菌は、白の主要な病原体のひとつです。現在実験 BAI 哺乳類動物モデル マウス モデルは、コストと時間がかかり、したがってハイスループット解析には適していないようです。したがって、体内の白を調査するための補完的なシステムとして新しい動物モデルが望まれます。本研究では、生体内可視化と蛍光顕微鏡による生体材料の存在下で細菌感染症の生体内解析のためのゼブラフィッシュ胚モデルの開発を目指しました。また、誘発マクロファージの応答を調べた。このため、我々 は蛍光蛋白質を表現する黄色ブドウ球菌や、マクロファージの蛍光蛋白質を表現するトランスジェニックゼブラフィッシュ胚を使用して細菌単独で、または一緒に微粒子を筋肉に注入する手順を考案胚の組織。時間をかけてライブ胚における細菌感染症の進行を監視するため蛍光細菌の顕微鏡による得点のシンプルだが信頼性の高い方法を考案しました。顕微鏡得点から結果は細菌の以上 20 コロニー形成単位 (CFU) を持つすべての胚が細菌の肯定的な蛍光シグナルを得られました。感染に対する生体材料の潜在的な影響を研究するには、我々 は胚のモデル材料として 10 μ m のポリスチレン微小球 (10PS) と黄色ブドウ球菌の CFU の数字を決定しました。また、時間の経過とともに黄色ブドウ球菌感染症 PS10との蛍光強度を定量化するのに ObjectJ プロジェクト ファイル ImageJ で「ゼブラフィッシュ Immunotest」を使用。両方の方法からの結果は、微粒子、生体材料の存在下で増加感染感受性を示すことがなく胚よりも微粒子で感染した胚で黄色ブドウ球菌の高い数字を示した。したがって、本研究は、ここで開発された手法により研究して白にゼブラフィッシュ胚の可能性を示しています。

概要

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ますますにさまざまな医療機器 (「生体材料」と呼ばれる) 現代医学で復元または人体パーツ1を置換するされます。ただし、生体材料の注入は患者を手術でインプラントの主要な合併症である生体関連感染 (白) と呼ばれる感染症素因となります。黄色ブドウ球菌、表皮ブドウ球菌、2 最も一般的な細菌種の白2,3,4,5,6を担当。細菌のバイオ フィルム形成に影響を受けやすい表面生体フォームを注入しました。また、細菌クリアランスの減少効果を引き起こしている注入のバイオマテリアルによる局所免疫応答を錯乱させる可能性があります。細菌に感染した初期のクリアランスは、主に強く挿入されての存在下で殺菌能力の低下や生体材料7を注入した好中球の浸潤によって実行されます。さらに、マクロファージ組織を浸潤した好中球の初期流入残りの細菌を貪食、効果的にことはできません後それらを殺す細胞内、狂った免疫シグナリングの組み合わせの存在の結果であるため生体と細菌8。したがって、生体材料の存在が細菌9,10、11,12,13およびバイオ フィルム形成の植え付けられた細胞の生存を促進します。生体4,14。その結果、白が失敗につながるし、注入材料の交換を必要と追加コスト2,15に増加罹患率と死亡率と長期入院の原因します。

アンチ白戦略数の増加は、先進2,16,17をされています。適切な動物モデルにおけるこれらの戦略の有効性の in vivo 評価は不可欠です。しかし、伝統的な白モデル実験動物 (例えば、マウス モデル) は通常高価な時間のかかる、したがって複数の戦略18の高スループットのテストには適していません。宿主細胞や細菌の発光/蛍光ラベリングに基づく光ファイバー型バイオ イメージング技術の最近の進歩、BAI の進行およびホスト病原体/ホスト材料の相互作用単一小動物での連続モニタリングできるようにします。マウス18,19,20,21などしかし、この手法は、比較的複雑で、まだ始まったばかりで、白18の定量分析のためいくつかの問題を対処しなければなりません。例えば、細菌の植民地化を視覚化する挑戦の高線量が必要です。さらに、光散乱、動物もあります哺乳類のテストの組織における発光/蛍光信号の吸着対処18,19,21。したがって、時間をかけて生体内可視化と定量的な解析を可能にする、コスト効率の高い新しい動物モデル、BAI 体内を研究するための貴重な補完的なシステムであります。

ゼブラフィッシュ (胚) は、抗酸菌22、23緑膿菌、などいくつかの菌種の宿主-病原体相互作用と感染症を解剖するため生体内での多機能なツールとして使用されています。大腸菌ブドウ球菌腸球菌フェカリス252426,27。Zebrafish の胚には、光透過性、比較的低いメンテナンス コストと高い哺乳類28,29に類似する免疫システムの所有物など多くの利点があります。これは微小循環の可視化と感染症の進行と関連付けられたホスト応答28,29の分析のための高い経済、生活モデル生物 zebrafish の胚になります。(,マクロファージや好中球など) の免疫細胞の種類と生体内で、遺伝子導入ゼブラフィッシュ線細胞挙動の可視化を許可し、蛍光タグ細胞内構造をもされている28 を開発しました。、29。さらに、ゼブラフィッシュの高い繁殖率、自動ロボット注入、自動蛍光定量、RNA シーケンス解析27,高スループット テスト システムの開発の可能性30。

本研究では蛍光イメージング技術を用いた生体関連感染のゼブラフィッシュ胚の開発を目指しました。このため、生体微粒子の存在下でゼブラフィッシュ胚の筋組織に細菌 (黄色ブドウ球菌) を注入する手順を行った。黄色ブドウ球菌RN4220 表現する mCherry 蛍光タンパク質 (S の黄色ブドウ球菌- mCherry)、別黄色ブドウ球菌株10,31の他の場所で説明されているように建設されたを使用しました。トランスジェニックゼブラフィッシュ ライン (mpeg1: UA/楓) 楓、マクロファージ32青蛍光ポリスチレン微小球に緑色蛍光タンパク質を用いて表現します。以前の研究では、生体材料の注入を模倣するゼブラフィッシュ胚微粒子の筋肉内注射が可能な33を示しました。蛍光強度を数値化する「ObjectJ」(ImageJ のプラグイン) 内で運営されている「ゼブラフィッシュ Immunotest」プロジェクト ファイルを用いて BAI の進行と時間をかけて単一胚に関連する細胞浸潤を定量的に解析、存在する細菌や微粒子33の注射部位周辺に浸潤したマクロファージ。さらに、我々 はコロニー形成の数字を決定した単位 (CFU) 胚における微粒子の有無における細菌の潜在的な感染症に及ぼす生体材料を研究します。本研究は、ここで開発した方法、ゼブラフィッシュ胚は体内の生体材料関連感染症を研究するため、有望な新規脊椎動物のモデルを示しています。

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プロトコル

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このプロトコルでは大人のゼブラフィッシュのメンテナンスは、動物愛護委員会によって承認された動物愛護法令です。2010/63/EU 指令によると胚の実験を行った。

1.「細菌のみ」と細菌微粒子懸濁液の準備

注:MCherry 蛍光蛋白質 (黄色ブドウ球菌mCherry) 表現する黄色ブドウ球菌RN4220 ひずみが使用されます。黄色ブドウ球菌RN4220 株は病原性調節遺伝子アグラ(アクセサリー遺伝子制御因子 A)34で変異、したがってゼブラフィッシュ胚における比較的低病原性があります。他の s.黄色ブドウ球菌菌株または白の他の菌種を使用ことができます。

  1. 菌黄色ブドウ球菌RN4220 10 μ G/ml クロラムフェニ コールを添加したトリプシン大豆寒天培養皿から 4 に 5 植民地を取るし、10 mL のトリプシン大豆スープ 10 μ G/ml を添加したに半ば対数増殖期の細菌文化クロラムフェニ コール振動下の 37 ° C で。
    1. 培養中希釈滅菌リン酸緩衝生理食塩水 (PBS) 620 で光学濃度 (OD) 測定キュベット (1 cm の幅) で 900 μ L の細菌懸濁液を 100 μ l 添加 nm (外径620)。外径620 0.4-0.8 に達するまで細菌の文化.
      注:0.1 の外径620は一般的に 3.0 x 10 に対応7 CFU/mL黄色ブドウ球菌。半ば対数増殖期の細菌の接種材料の外径620は 0.4 から 0.8 の間です。他種の細菌の菌を培養するための別の期間は必要かもしれない。
  2. 3,500 x gで 10 分間で細菌を遠心し、1 mL の滅菌 PBS でペレットの細菌を再中断します。その後滅菌 PBS 2 時間で細菌を洗浄し、最後に再停止 1.1 mL の PBS で 4% (w/v) ポリビニルピロリドン40 (PVP40) 溶液中の細菌。
  3. 渦この細菌懸濁液と外径620測定キュベットで滅菌 PBS の 900 μ L に懸濁液 100 μ L 希薄。PVP40ソリューション細菌懸濁液の濃度を調整します。これは「細菌のみ」のサスペンションです。
  4. 細菌懸濁液と混合する生体材料を自由に選択できます。本研究では市販のポリスチレン (PS) 微小 (青い蛍光、10 μ m) が使用されます。細菌微粒子懸濁液を生成するには、1,000 × g室温で 1 分の微小球を遠心分離機、上澄みを廃棄し、再 (PVP40溶液) の「細菌のみ」サスペンションのマイクロスフィアを中断します。
  5. 微粒子の不在の存在下で細菌のおよそ平等な用量を注入するために細菌微粒子懸濁液の濃度は (なし「細菌のみ」懸濁液の濃度の 3 分の 2 をする必要があります。微小球)。これは 0.5 PVP40溶液量と細菌微粒子懸濁液を希釈することによって達成されます。ボルテックスによって懸濁液を混ぜます。注記のうち、この比 (2/3) が評価された黄色ブドウ球菌のため。それは、 s、適していますが注入するかどうかこの比率も他の細菌種他 (10 μ m) よりもサイズや形状 (微粒子) よりも生体材料の適用のチェックをお勧め。
  6. 以下として 10 倍のシリアル希薄の定量的培養による「細菌のみ」と細菌微粒子懸濁液の濃度を確認してください: 転送 100 μ l、96 ウェル プレートとの 10 μ L の因数を転送することによって連続希薄懸濁液の滅菌 PBS の 90 μ L に懸濁液。アガロース プレートに原液と希釈懸濁液の 10 μ L 因数を重複をプレート、37 ° C でプレートを一晩インキュベート、コロニーをカウント、細菌 (コロニー形成単位数を計算します。CFU)。

2. 育成、収穫、およびゼブラフィッシュ胚のメンテナンス

  1. 下記の変更を一般的な手順説明以前35,36ゼブラフィッシュ胚の繁殖、収穫、およびメンテナンスのために従ってください。野生型 Tupfel 長いひれ (TL) ゼブラフィッシュまたは選択した形質転換線のゼブラフィッシュの家族をクロス (ここでは、mpeg 1 形式: 楓) に点灯した後に卵を生産する成人女性を誘導するために追加のネットでタンクに、作り出された卵から大人を分離します。
  2. 次の日胚を収集し、実行可能ではない透明ではないものを破棄します。シャーレ (直径 100 mm) あたりの約 60 胚をおいて E3 中37と 28 ° C の孵化死者と異常な胚を外し、E3 媒体を毎日更新します。

3. 注射針の準備

  1. マイクロ ピペットの引き手の計測器を使用して注射用ガラス マイクロキャピ ラリー針を準備します。次の設定を使用: 熱: 772、プル: 100、ヴェル: 200、時間: 40、ガス: 75。
  2. 針が光学顕微鏡を用いた眼でスケール バー外径約 20 μ m (10 μ m 微粒子) のための位置にピンセットで針の先端を破る。胚の生存を危険にさらす彼らは非常に大きな開口部のサイズと針を避けてください。
    注:開口部は、サイズと注入する生体材料の形状に応じて拡大または縮小する選択可能性があります。文学、胚の生存の38の大幅な減少を引き起こす約 50 μ m の開口部をもつ針を用いた注射を報告されています。

4. ゼブラフィッシュ胚に「細菌のみ」または細菌微粒子懸濁液の注入

  1. アガロース溶液 (1-1.5% (wt) デミ水) を熱電子レンジを使用し、100 mm のペトリ皿に注ぐ。注射を促進する適切な位置に胚を配置するための agarose のインデントを作成するシャーレにアガロース溶液の上にプラスチック金型テンプレートを配置します。室温でインキュベートし、アガロース溶液が凝固したときに金型を削除します。
  2. 3 d 後受精で 0.02% (w/v) 3-アミノ安息香酸にそれらを anaesthetize (Tricaine) を含む 100 mm のペトリ皿に胚を配置します。5 分後に E3 培 0.02% (w/v) Tricaine かぶせてアガロース ・ プレートに胚を転送および注入のための 1 つの方向に合わせます。Mpeg1 の: 楓形質転換線は最初 E3 媒体含む 0.02% (w/v) tricaine 胚を anaesthetize。ステレオ蛍光顕微鏡を用いた緑の蛍光蛋白質を表現する胚を選択します。
  3. 「細菌のみ」または細菌微粒子懸濁液 microloader ピペット チップを使用しての約 10 μ l で針をロードします。マイクロ インジェクター接続マイクロマニピュレーターに針をマウントします。インジェクター使用ここで (材料の表を参照)、使用して次の設定 2-3 nL の注射用: 圧力: 300-350、背圧: 0、時間: 2 ms。
    注:マイクロ インジェクターの設定は、使用されるインジェクターに依存します。インジェクターの設定は、他の形状やサイズによる生体材料の混合菌注射用に調整する必要があります。
    1. 「細菌のみ」の懸濁液および細菌微粒子懸濁液の注入の同一の開口の針を使用します。針が壊れたか、詰まっている場合、は、常に新しいさらに注射針の変更します。
  4. (図 1)、光学顕微鏡下で胚の筋に針と胚の体の 45-60 ° の角度で針を挿入します。優しく前後移動することによって、組織内の針の位置を調整します。マイクロ インジェクターに接続された足ペダルを用いた胚を注入します。
  5. 蛍光菌の注入後、ステレオ蛍光顕微鏡下で成功した感染症のため胚をスコアします。得点の胚負 (ない目に見える蛍光細菌またはない、目に見える蛍光マイクロスフィア) を破棄します。48 ウェル プレートで E3 媒体で個別に胚を維持します。媒体を毎日更新します。

5. 胚, 微視的得点と菌の定量培養の破砕

  1. まで定量培養の胚がランダムに選択されてその後毎日、注射後すぐに開始ステレオ蛍光顕微鏡を用いた蛍光菌の存在を顕微鏡すべての胚をスコアします。
  2. ランダムに注入直後後いくつか感染した胎児 (本研究では 5 に 6) を選択し、個別に滅菌のヒントを使用して独立した 2 mL チューブにそれらを転送します。メディアを取り出して、滅菌 PBS で軽く胚を一度洗って滅菌 pbs 100 μ L を追加します。
  3. 2-3 滅菌ジルコニア ビーズ (直径 2 mm) を各バイアルに追加し、ホモジナイザーを用いた胚をつぶす (材料表参照) 30 3,500 rpm で s 文化磨砕液の定量的手順 1.3 で説明しました。
    注:他のホモジナイザーは、異なる設定を必要があります。
  4. 注射後ステップ 5.3 によると定量培養のための日以降に複数の胚をランダムに選択します。

6 感染の進行と誘発される細胞の浸潤ゼブラフィッシュ胚の蛍光顕微鏡

  1. 胚は、4.2 の手順で説明されているように anaesthetize します。500 μ L の PBS-2% (wt) メチル セルロース溶液をピペット 0.02% (w/v) Tricaine E3 媒体を含んでいるペトリ皿に。メチル セルロース溶液内胚を置き、それらまっすぐと水平を保ちます。
    注:メチル セルロース溶液はその粘性のため一時的に画像の最適な向きで胚を固定化できる、「グルー」として使用されます。
  2. 画像個々 胚 [160 倍の倍率で同じ最適化設定 (,の強度、ゲイン、および露出の時間など) をフィルター明るいフィールド、mCherry、緑色蛍光タンパク質 (GFP)、UV 装備使用ステレオ蛍光顕微鏡.ように注射による組織の損傷は、明るいフィールドのフィルターを使用して、フォーカスは、焦点面を設定します。3 連続画像の記録は、5 μ m、10 μ m、ステップ ・ サイズで Z スタックの深さを設定します。
  3. 画像個々 胚投与後 2 日まで投与 5 時間後から 1 日 1 回。さらにイメージングと分析のため死胚 (ハートビートまたは一部劣化胚) を除外します。48 ウェル プレートで E3 媒体で個別に胚を維持します。媒体を毎日更新します。

7. 感染症進行とオブジェクト J プロジェクト ファイル「ゼブラフィッシュ-Immunotest」を使用して誘発される細胞浸潤の蛍光強度の定量的解析

  1. リンクから「ゼブラフィッシュ Immunotest」と詳細なマニュアルをダウンロード: < https://sils.fnwi.uva.nl/bcb/objectj/examples/zebrafish/MD/zebrafish-immunotest.htmL>、前研究33で説明されているようです。簡単に言えば、「ゼブラフィッシュ-Immunotest」フリーウェアのプログラム イメージ j. の下で動作解析用の画像を開く各の読み込まれたイメージに手動で胚の観察された組織の損傷に基づく注射部位をマークします。
    注:マーク サイトを「ゼブラフィッシュ Immunotest」が 50 μ m の距離内で蛍光ピークを検出するセンター ポイントとして使います。検出された蛍光ピークは、蛍光測定の標準化された領域 (100 μ m の直径) の中心として使用されます。
  2. 必要に応じて、すべての画像を自動的に複数のチャネル用蛍光測定を実行するオブジェクト J メニューで「計算」をクリックします。データをエクスポートし、適切な統計テストの方法で分析します。

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結果

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本研究は、生体材料関連感染を調査するため、新たな脊椎動物モデルとしてのゼブラフィッシュ胚の適用性を評価しました。マイクロインジェクション法は細菌種を注入させる感染症22,26,27,30,36ゼブラフィッシュ胚によく使用されています。図 1に示されている手順を使用すると、黄色ブドウ球菌の単独で、または一緒に 10 μ m PS 微小球 (10PS) に注入した本研究ではゼブラフィッシュ胚の筋組織。黄色ブドウ球菌の筋肉内注射は、胚 (図 2) で用量依存性感染症を引き起こした。...

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ディスカッション

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生体材料関連感染 (BAI) は、深刻な病態です。バイ国際体内の病態の理解は、予防と白の治療を改善するために新しい洞察力を提供します。ただし、現在白モデル実験動物マウス モデルなどはコストのかかる、労働集約的であり、複雑な手技の訓練を受けた専門スタッフが必要があります。したがって、これらのモデルは、高いスループット分析のため適していません。本研究がゼブラフィッシュ胚は体内、補完する BAI を調査するため新たな脊椎動物モデルとして使用できるかどうかを評価したゼブラフィッシュ胚モデルの要件が複雑なので、コストは一般にマウスのモデルよりも低くなって哺乳類のモデル。

ゼブラフィッシュ胚の白モデルを設定、するためには、細菌や胚33さき微粒子の筋肉内注射法を用いた微小球の共同の注入のプロトコルを開発しました。この方法で細菌のほとんど、微小球近傍にある胚中、や人間/哺乳類における生体材料の注入直後後に行われる細菌生体材料の相互作用を模倣します。

ゼブラフィッシュ胚における微粒子の不在、存在下...

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開示事項

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著者が明らかに何もありません。

謝辞

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

本研究は財政的に生体材料 (BMM) プログラムのイビサ島プロジェクトによってサポートされ、共同オランダ経済省によって資金を供給します。著者はゼブラフィッシュの形質転換線を提供するためオーストラリア ・ モナシュ大学から教授グラハム Lieschke を感謝したい (mpeg1:Gal4/UAS:Kaede)。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
トリプシン性大豆寒天BD Difco236950AMC の培地調製ユニット
トリプシン性大豆ブロスBD Difco211825
Polyvinylpyrrolidone40ApplichemA2259.0250
10 & マイクロ;m径ポリスチレン微小球(青色蛍光)ライフテクノロジー/ThemoFisherF8829
ガラス製微小キャピラリー(外径1mm×内径0.78mm)ハーバード・イスラー・マイクロ
ピペット・プーラー・インストゥSutter Instrument IncFlaming p-97
光学顕微鏡 LM 20ライカMDG33 10450123
3-アミノ安息香酸(トリカイン)Sigma-AldrichE10521-50G
アガロースMPロシュ11388991001
ステレオ蛍光顕微鏡 LM80ライカMDG3610450126
マイクロローダーピペットチップエッペンドルフ5242956.003
マイクロマニピュレーター M3301 M10スタンド付きワールド精密機器00-42-101-0000
フェムトジェットエクスプレスマイクロインジェクターエッペンドルフ5248ZO100329
マイクロトルーブ 2 mL ppザーシュテット72.693.005
ジルコニアビーズBio-connect11079124ZX
MagNAライザーロシュ41416401
MSA-2プレート(マンニトール塩寒天-2)Biomerieux43671Chapmon 2中
メチルセルロース4000cpSigma-AldrichMO512-250G
クロラムフェニコールSigma-AldrichC0378
ジャイロトリシェーカー(細菌増殖用)ニューブランズウィックサイエンティフィG10
ゼブラフィッシュインキュベーターVWRインキュライン
キュベットブランド759015
遠心分離機ヘティッヒ-ゼントリフューゲンROTANTA460R
分光計PharmaciaバイオテクノロジーUltrospec®2000
鉗子Sigma-AldrichF6521-1EA
48 ウェルプレートGreiner bio-one677180
96 ウェルプレートGreiner bio-one655161
ペトリ皿ファルコン353003
ペトリ皿BiomerieuxNL-132
ImageJ該当なしなしリンク:
https://imagej.nih.gov/ij/download.html GraphPad 7.0Prism該当
ルメント ・ック 該当なし

参考文献

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