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方法論記事

成体マウスの遺伝子組換えアデノ随伴ウイルスの直接髄腔内注入

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DOI：

10.3791/58565

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2019年2月15日

 ,  ,  ,  , 
1Department of Neurology, Second Hospital of Hebei Medical University, 2No.2 Middle School of Shijiazhuang, 3Department of Biochemistry and Molecular Pharmacology, University of Massachusetts Medical School, 4Key Laboratory of Hebei Neurology

* These authors contributed equally

この記事について

サマリー

小動物に効率的なアデノ随伴ウイルス配信しているし、中央に伝達効率を予測するスコアリング システムを確立するウイルス ソリューションで 1% リドカイン塩酸塩を使用して直接髄腔内注入法を紹介します。リドカインによる一時的な弱さの程度によると神経系。

要約

アデノ随伴ウイルス (AAV) の髄腔内 (IT) 注入は、中枢神経系中枢神経系遺伝子治療の安全、非侵襲性、優れた伝達効果のおかげでかなりの関心を集めています。前の調査は管理で、それによって神経変性疾患における AAV 配信遺伝子療法の治療の有効性を実証しています。ただし、高率で小動物の IT 管理の技術的な制限により予期しない失敗が報告されています。ここでは、我々 は注射液に 1% リドカイン塩酸塩を加えることによって小動物での腰椎穿刺の成功の程度を示す得点システムを確立しました。さらに注入過渡の弱さの程度が AAV の伝達効率を予測できることを示します。したがって、この IT 注入法は、中枢神経系の幅広い領域を苦しめる中枢神経系疾患のマウスモデルでの治療試験を最適化するために使用できます。

概要

AAV はいくつかの副作用と中枢神経系の情報伝達における長期的かつ広範な遺伝子発現を仲介することができます、したがって筋萎縮性側索硬化症 (ALS)、ハンチントンを含む中枢神経系疾患を治療する遺伝子治療のための最も有望な車の 1 つになりました病気 (HD)、アルツハイマー病 (AD)、ライソゾーム病 (LSD)、ゴーシェ病 (GD)、神経セロイドリポフスチン症 (NCL)1。現在、100 以上の AAV の血清型は人間や動物から分離されています。これらのうち、少なくとも 12 は、臨床で使用されている、最もよくを含む臨床試験使用遺伝子ベクターなど AAV1、2、4、5、6、8、9、rAAVrh.8、および rAAVrh.101,2,3,4、 5,6。

中枢神経系のさまざまな病気は、様々 な中枢神経系の影響を受ける地域や細胞の種類により異なる AAV 配信戦略を必要とします。中枢神経系領域およびセル AAV が変換できる型は血清型によって異なります配信方法だけでなく。たとえば、rAAVrh10 は、ニューロンとグリア細胞髄腔内注入4,7で配信されたときそれが導入に対し、主に全身の静脈内投与 (IV)、配信時はアストロ サイトを変換する示されています。実質内注入は、注射部位の近くにローカル伝達の結果さらに、広範な中枢神経系伝達8 結果として脳から脳脊髄液 (CSF) 注入またはくも膜下腔内注射に対し.研究も示している神経変性疾患における AAV 配信遺伝子療法の治療上の効力によって管理9,10,11。ALS など中枢神経系の広範な領域に影響する疾患、全身配信メソッド4,10と比較して、低い線量と病気に悩まされ、ほとんどの区域をカバーする CSF への髄腔内注入を示されています。最近の研究では、その腰椎穿刺は、ALS は、椎弓切除術、髄腔内カテーテル4に関連付けられている潜在的な傷害を避けるためのマウスモデルの AAV を注入する使用ことができますが示されています。

実験直接腰椎穿刺は、配信エージェント、特に麻酔薬、鎮痛および 188512,13の麻酔で、脊髄に初めて使われました。本報告では、腰椎穿刺、評価してインジェクションの品質を監視する注入剤でアミド由来のローカルの麻酔 1% リドカイン塩酸塩の助けを借りて成体マウスの IT 注入法を示しています。成功した注射は、失敗した注射がこの現象を示さなかったに対しリドカインによる一時的なまひ状態によって示されました。注入効率を予測する 5 つの等級の 1 つとして一時的な弱さのレベルを分類しました。最後に、麻痺の等級によって rAAVrh10 伝達レベルを予測できることを示す.したがって、このくも膜下腔の AAV の配信方法は、中枢神経系疾患の治療実験 AAV を介した遺伝子導入を強化する使用できます。

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プロトコル

FVB/ニュージャージー州マウス キー河北内科研究室の動物施設で飼育されました。すべてのマウスの実験によって第 2 病院の河北医科大学倫理委員会の承認され、科学省と中華人民共和国の技術によって公布された実験動物管理の規制に従って実施中国。

1. 20% リドカイン塩酸原液の調製

  1. リドカイン塩酸塩の 2 グラムの重量を量る。5-6 mL の滅菌水の渦をそっと追加します。音量を 10 mL の滅菌水での合計。
  2. 1.2 0.2 ミクロンのフィルターを通して原液をフィルターします。因数原液、1 mL あたり 1.5 mL 遠心チューブとシール フィルムでシールします。4 ° C でのストア

2. 覚醒マウスで直接髄腔内 AAV 配信

  1. 70% エタノールで滅菌ガーゼを使用する作業領域をワイプし、表 1で述べたように必要な用品を準備します。
  2. 滅菌 200 μ L 遠心チューブに rAAVrh10 原液 (5 x 10 の12ゲノム コピー/mL) の 95 μ L を追加することで複雑な AAVrh.10/1% リドカイン塩酸塩の 100 μ L を準備し、20% リドカイン塩酸原液の 5 μ L を追加します。上下にピペッティングでよく混ぜます。その後、氷 (4 ° C) の上ウイルス ソリューションを保存します。
    注: 8 μ L/マウス4が使用されます。
  3. AAV ソリューションと注入用の注射器の準備
    1. ハミルトン 27 G 針とシリンジし、注射器の体積のスケールで針の斜めのヒントを合わせて 25 μ L を組み立てます。
    2. 注射器にウイルス ソリューションの 4 x 1010ゲノム コピー 8 μ L を軽く引きます。空気の泡を削除することを確認します。
  4. マウスを準備
    注:    男性または女性/ニュージャージー州 FVB マウス (30-70 日古い) はこの研究で使用されました。IT の注入は、フードで作動しました。
    1. 70% エタノールでフード内の作業領域を消毒します。ボンネットの腹臥位で bedpiece に目がさめているマウス (男性または女性、30-70 日齢、13-20 グラムの重量を置きます。マウスを落ち着かせ、かまれることを避けるために滅菌ガーゼで上半身をカバーします。
    2. 適切に、しっかりと、反対側の 1 つの側と人差し指/中間指の親指でその骨盤ガードルを掴んで動物を修正します。親指と人差し指をピンと張った二国間の骨盤ガードルの間肌を保ちます。手のひらで動物の上半身に優しくを保持します。
    3. 二国間の骨盤ガードルの背中の毛を剃るし、ヨウ化ベースのスクラブと、70% エタノールで皮膚の表面を消毒します。
  5. 髄腔内注入12
    1. 親指、またはもう一方の手の人差し指で両側の骨盤ガードル間中央線に沿って椎間腔を感じるし、L5 L6 椎間腔を示す指の爪でインデントを押します (注射部位を見つけます)。
    2. 少し、優しく、尾の根元を回転させる脊柱の正中線を示す。(2.3.1 のステップに記載) 注入の前に動物の頭に向かって針かさを調整します。
    3. 動物がしっかりと固定されて、脊柱の正中線に沿って針を配置していることを確認します。
    4. ゆっくりと垂直に針を挿入 (または少し 70 ~ 80 ° の傾斜) インデントし中央の矢状面における注射器の交差点で。それは、骨を接続するときゆっくり約 30 ° までの角度を減らし、椎間腔に針を入れます。
      注:明らかに突然尾フリックは硬膜内空間に成功したエントリの兆候です。椎間腔に入ると針、針の先端をしっかりとクランプ感じるでしょう。本研究で使用される 27 G 針はマウス、ラットではなく IT 配信に適しています。
    5. (2.2 のステップに記載) ベクトル溶液を注入します。タイマーを開始し、終えた後 1 μ L/4 s 針約 1 分保持の速度ベクトル ソリューションの 8 μ L を注入配信。漏れを避けるために緩やかな回転で針を撤回します。
    6. 注入品質4を評価する配信後すぐにマウスの一時的な弱さ手足をスコアします。
      注:標準の4通りです。スコア 0: 脱力感。スコア 1: 歩行異常; なく後肢の弱さを小2 のスコア: 明白な歩行異常; と後肢の弱さを中程度3 のスコア:; 後肢の麻痺を完了4 のスコア: 後肢の麻痺、呼吸、息切れ、前部肢; の適度な弱さを完了5 のスコア: すべての 4 つの手足の麻痺と明らかに息切れを完了します。
    7. 麻痺からの回復のためケージにマウスを移動します。
  6. クリーンアップ
    1. 1 mL 滅菌水で注射器をフラッシュします。実験室の供給を並べ替え、オートクレーブ滅菌のすべての非使い捨ての材料を収集します。70% エタノールでベンチをクリーンアップします。

3 免疫組織化学染色ティッシュの準備

  1. 組織の採取
    1. 21 日 3% 抱水クロラール (0.1 mL/10 g) の投与後のマウスの腹腔内投与によって深く麻酔します。
    2. 20 ml の冷たい 0.01 M PBS (NaCl 147 mM の transcardially を灌流します。NaH2PO4 1.9 mM;K2HPO4 pH 7.4 8.1 mM) まず、し 4% 冷たいパラホルムアルデヒド (0.01 M PBS) のポンプ (10 mL/分 1 分、9 分、5 mL/分)。
      注意:パラホルムアルデヒドは発ガン性、有毒です。手袋を着用しながらの発煙のフードでのみ処理します。
  2. 脊髄や脳の解剖
    1. 発泡ボックス カバーの腹臥位で注射針で手足とそれぞれの動物の頭を修正し、ストリップ、ハサミで仙骨に頭から皮膚を削除します。
    2. 頭蓋骨の目の間をクリップ、頭蓋骨と小脳に水平線の真ん中のルートと一緒にカットして、両側に頭蓋骨を開きます。
    3. ピンセットで後頭骨を持ち上げ、眼科用のハサミで両側脊柱管を開きます。両側に肋骨を切断し、椎骨の上半分を慎重に削除します。
    4. ピンセットを使って脳をリフトし頭蓋底の神経を断絶し、全脳と脊髄を慎重に分析します。後 24 時間 4% パラホルムアルデヒドで組織を修正します。
  3. 組織スライスの準備
    1. Cryoprotect 脳と頚椎と腰椎の脊髄 30% ショ糖液に一晩 4 ° C で最適な切削温度 (OCT) 化合物にティッシュを埋め込むし、高速液体窒素で凍結します。
    2. クライオスタットを用いた 25 μ m で組織を切断し、使用のための 4 ° C で 0.01 M PBS で凍結切片を格納します。

4. 免疫組織化学

  1. 1% H2O2 、10 分間で浮遊セクションを前処理し、ブロッキング溶液 5% 血清と 1 h の PBS で 0.3% 非イオン性洗剤で 10 分間加温 PBS で洗浄します。
  2. 4 ° C で一晩対応する一次抗体とスライスを孵化させなさいPBST のセクションを洗う (0.2 %pbs でトゥイーン 20) (10 分ごと) ために 3 回の 30 分のため。
  3. 1 h. pbst; 洗浄 (10 分ごと) ために 3 回の 30 分の室温で対応するビオチン二次抗体とスライスを孵化させなさい。
  4. 親和性ビオチン ペルオキシダーゼ 40 分間複雑なセクションを孵化させなさいし、achromogenic エージェントで染色します。スライド セクションをマウントし、きちんと乾燥します。
  5. 5 分の無水エタノールとキシレン 10 分間スライドを浸漬し、メディアをマウントをスライドをシールします。最後に、100 倍、200 倍、400 x 倍率で電荷結合素子 (CCD) を搭載した顕微鏡のスライドをイメージします。

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結果

マウスは 1% リドカイン塩酸塩を投与するとの様々 な質のためにそれの直後に一時的な弱さの程度が異なるの AAV 溶液注入示した。半定量の 5 段階採点システムを設けて、に従って私達はリドカイン誘導肢の弱さの程度が異なるとマウスの AAV の伝達パターンをテスト (スコア 0、n = 2; スコア 1、n = 1; スコア 4、n = 4; スコア 5、n = 3)。脊髄の EGFP 免疫マウスの no か少し得点 0 マウスの腰椎の脊髄に伝達、得点 1、マウスでやや強化された伝達、強力かつ広範な伝達を示した得点 4 または 5 (図 1A)。脊髄損傷の程度と密接に相関注射後一時的な手足の脱力 (図 1B) の様々 な程度を表示するこれらのマウスの染色と結論づけた GFP の弱点の深刻度を定量化我々伝達。

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ディスカッション

技術的には、目を覚ましマウスにおける IT 注入中にいくつかの重要な手順があります。まず、適切な操作全体を通じてマウスのジェスチャーと事務所のコントロールが正しく配信されるための前提条件。第二に、最も困難な点はない抵抗せずにあまりにも深く挿入または動物が負傷または針の先端を曲げの場合強い抵抗の下で強制的に挿入する必要がある、針の先端と椎間腔を感じです。第三に、リドカインによる一過性の麻痺は、注入品質の客観的指標を提供しますが、一貫性のある結果を達成するためにより多くの練習が必要です。

本報告では, IT 注射成功の程度の指標としては、遺伝子治療の有効性の予測因子としてのリドカインを提供しています、AAV の配信のため目がさめているマウスで直接髄腔内注入法を開発しました。実験直接腰椎穿刺鎮痛・麻酔で、脊髄にエージェント、特に麻酔を提供では、中枢神経系疾患の遺伝子治療で強く推奨されています。マウスのようなより小さい動物で IT 注入の難易度は、与えられた我々 は直接腰椎穿刺の 2 つのアプリケーションを組み合わせるし、局所麻酔薬 (リドカイン、使用されている診療所で広く注入品質の客観的...

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開示事項

著者が明らかに何もありません。

謝辞

この作品は、河北省の人材開発省と社会保障 (CY201605) からの助成金と河北省 (H2017206101) の自然科学財団からの助成金によって賄われていたし、広平 Gao の AAV をいただいた先生にはとても感謝しております本研究では。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
FVB/NJ マウスチャールズ リバー ラボラトリーズ 中国
リドカイン 塩酸塩 一水和物HEOWNS73-78-9
AAVウイルス ベクター コア マサチューセッツ大学医学部
25 & マイクロ;L ハミルトン シリンジ/27-30 G ニードルガスタイト1702
O.C.T compondさくら4583
H 2O 2SHUIHUAN PAI
ヤギ血清SolarbioS9070
Triton X-100LIFE SCIENCEST8200
Rabbit anti-GFPLife techG103621:333 希釈
2 番目の抗体 (ヤギ抗ウサギ)Jackson Immuno Research111-005-1441:1,000 希釈
ベクタステイン ABC 試薬Vector LabPK-6100
ImmPACT DAB ペルオキシダーゼ 基質キットVector LabSK-4105
VectorshieldH-1200による蛍光用封入剤
永達化学NaH
2PO4·2H2OYong Da Chemical
Na2HPO4·12H2OYong Da 化学
パラホルムアルデヒドYong Da 化学307699
接着顕微鏡 スライドCITOGLAS1708325 mm x 75 mm
SUPER-SLIP MICRO-GLAS電子顕微鏡 Siences72236-6024 mm x 60
mm 15 mL 遠心分離管CORNING430790
96 well細胞培養クラスターCoster3599
24 well 細胞培養クラスターCoster3524
70% エタノールWEN ZHI
GauzeWei AN051711128 cm x 10 cm x 12
cm 1 mL syringeHong Da
MicrotubesPlasmed
Micropipet エッペンドルフ
ペペットチップレイニン
センチリフュージエッペンドルフ5427R
レジェレーターハイアールBCD-539WT
フィルターMILLEX GPR4PA42342
ポンプLongerPumpBT-100-2J/YZ1515X
顕微鏡オリンパスBX53
冷凍ミクロトームLeicaCM1520
の遺伝子治療センターのコア 170401 DAPI NaCl

参考文献

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