コナガからのリアノジン受容体の N 末端ドメインの結晶構造

サマリー

この記事で私たちはコナガ (コナガ) からリアノジン受容体の N 末端ドメインの蛋白質の発現、精製、結晶化、構造決定のプロトコルを説明します。

要約

強力かつ効率的な農薬の昆虫リアノジン受容体 (RyRs) をターゲットとして開発されている農業害虫コントロールの領域に大きな関心。日付、著者殺虫 RyRs が製品化されている害虫を対象、20 億ドルの年間売り上げ高を生成します。RyR を対象とした殺虫剤の作用のモードの理解は昆虫 RyR に関する構造情報の不足によって制限されます。これは順番の害虫に殺虫剤抵抗性の発達の理解を制限します。コナガ (DBM) は、著者の殺虫剤に抵抗性を示すことも報告されている世界、アブラナ科作物を破壊する壊滅的な害虫です。したがって、それは DBM RyR、特に伝統的な著者の結合部位とは異なる地域をターゲットをターゲット新しい殺虫剤を開発する非常に実用的な重要なのです。構造的に特徴付ける DBM から RyR の N 末端ドメイン プロトコルを紹介します。X 線結晶構造の解像度で分子の交換によって解決された Å、2.84 のベータ トレフォイル折りたたみモチーフと並ぶ α ヘリックスを示しています。このプロトコルは一般的に式、浄化および他のドメインまたは蛋白質の構造解析の合わせることができます。

概要

リアノジン受容体 (RyRs) は、特定のイオン チャンネルは、筋細胞の筋小胞体 (SR) 膜を渡る Ca^{2 +}イオンの透過を仲介します。したがって、彼らはプロセスを結合励起収縮に重要な役割を果たします。その機能の形で RyR 分子質量とホモ四量体としてアセンブル > 2 MDa、各サブユニットから成る 〜 5000 アミノ酸残基と。哺乳類では、3 つのアイソ フォーム: RyR1 - 骨格筋型、RyR2-心筋型および RyR3-普遍的組織¹で表されます。

昆虫は、筋肉や神経組織²で表現される RyR の 1 種類のみです。昆虫 RyR は約 47% のシーケンス id を持つ哺乳類 RyR2 に似て³。RyR 鱗翅目や鞘翅目のターゲット著者殺虫剤を開発し、バイエル (フルベンジアミド)、デュポン (chlorantraniliprole)、シンジェンタ (cyantraniliprole) のような主要な企業によって販売されています。比較的最近の発売以来、著者殺虫剤は殺虫剤の急成長しているクラスの一つなっています。現在、これらの 3 つの殺虫剤は年間の売り上げ高は、2009 年 (Agranova) 以来 50% 以上の成長率で 20 億米ドルを越えています。

プロトコル

1. 遺伝子クローニング、タンパク質の発現と精製

1. PCR の興味の蛋白質に対応する DNA を増幅 (DBM RyR、Genbank の残留 1 205 なし準拠。AFW97408) と結紮独立クローン (LIC)²⁵ペット 28 a HMT ベクターにクローン。このベクトルには、ヒスチジンの札には、MBP タグには N 末端の TEV プロテアーゼ切断部位が含まれています¹⁵ 。
   1. LIC LIC 互換 5' 拡張子を持つターゲット遺伝子の増幅用プライマーを設計します。
      LIC プライマーを転送します。
      5 ' 3' TACTTCCAATCCAATGCAATGGCGGAAGCGGAAGGGG
      逆 LIC 入門:
      5 ' 3' TTATCCACTTCCAATGTTATTATATGCCGGTCCCGTACGGC
   2. 反応コンポーネント (50 μ L) を組み合わせて: テンプレート DNA (100 ng/μ L)、前方のプライマー (10 μ M)、逆プライマー (10 μ M)、0.5 μ L の DNA ポリメラーゼ (NEB) 10 倍反応の 5 μ L の 1 μ L の 1 μ L の 1 μ L バッファー、dNTP (25 mM) の 1 μ L、RNase の 40.5 μ L 無料 ddH₂

結果

浄化

DBM RyR の N 末端ドメインは、hexahistidine タグ、MBP タグ TEV プロテアーゼ切断部位との融合蛋白質として表現されました。我々 は、結晶化の目的に適した高純度のタンパク質を得るために 5 つのステップ浄化戦略を追った。最初は、融合タンパク質は、Ni NTA 列 (HisTrap HP) によって細胞ライセートの可溶性画分から精製した.次に、融合タンパク質は TEV プロテアーゼ胸の谷間を受けたし、Ni NTA 列続いてアミロース樹脂カラムによる hexahistidine MBP 鋳型を除去しました。さらに、蛋白質は、陰イオン交換カラム (Q セファローズ HP) によって精製された、最終的にゲルろ過カラム (Superdex 200 26/600) によって。2YT メディアを使用して 1 L 細菌文化からの浄化された蛋白質の最終的な収量 〜 4 mg であった。浄化された蛋白質は SDS ページの ~ 21 kDa (.......

ディスカッション

本稿では recombinantly エクスプレス、浄化、結晶化、DBM RyR NTD の構造を決定する手順をについて説明します。結晶化の重要な要件は、高溶解性、純度、均一性タンパク質を得ることです。プロトコル、hexahistidine タグとより高い倍純度を取得する浄化に利用できるどちらの MBP タグが含まれているペット 28 a HMT ベクターを使用にしました。さらに、MBP タグがターゲット蛋白質の溶解度で補助されます。我々 は高純度、結晶化に適していたタンパク質が得られた 5 つの連続した手順によりタンパク質を精製しました。リキッドハンド リング システムを使用して結晶化スクリーニングを行った。手動ドロップ設定伝統的なスクリーニングに比較すると、自動化されたシステムは、サンプルの量が非常に少ないを使用して、時間とエネルギーを節約します。また、液体ハンドリングの精度の再現性を強化します。結晶された回折社内審査、データ収集のための放射光と、高い強度を持つ x 線と以下の発散降伏高品質データ。分子交換類似構造のテンプレート データベースで使用可能な最初の選択肢であった。MAD、悲しい、ミール等を含む実験的段階.......

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
pET-28a-HMTベクター			この修飾されたpETベクターには、ヘキサヒスチジンタグ、MBP融合タンパク質、およびN末端のTEVプロテアーゼ切断部位が含まれています(Lobo and Van Petegem, 2009)
E. coli BL21 (DE3) strain	Novagen	69450-3CN
HisTrapHP column (5 mL)	GE Healthcare	45-000-325
Amylose resin column	New England Biolabs	E8021S
Q セファロース高性能コラム	GE Healthcare	17-1154-01
Amicon 濃縮器 (10 kDa MWCO)	Millipore	UFC901008
Superdex 200 26/600 ゲルろ過カラム	GE Healthcare	28-9893-36
自動リキッドハンドリングロボットシステム	アートロビンスインスツルメンツ	グリフォン
96 ウェル クリスタルクイック	グライナー バイオワン	82050-494
ユニパック	分子寸法	MD7-601
マウント クライオループ - 20ミクロン	ハンプトンリサーチ	HR4-955
クライオワンド	分子寸法	MD7-411
パックデュワーローディングツール	分子寸法	MD7-607
ナノドロップ	Thermo Scientific	NanoDrop One
Crystal インキュベーター	分子寸法	MD5-605
X線回折装置	リガク	FRX
PCRマシン	エッペンドルフ	Nexus GX2
プラスミドミニプレップキット	Qiagen	27104
ゲル抽出キット	Qiagen	28704
SspI 制限エンドヌクレアーゼ	NEB	R0132S
T4 DNA ポリメラーゼ	ノバゲン	2868713
カナマイシン	サイエンティフィック ケミカル	25389940
IPTG	Genview	367931
HEPES	Genview	7365459
&β;-メルカプトエタノール	Genview	60242
遠心分離機	Thermo Scientific	Sorvall LYNX 6000
Sonnicator	Scientz	II-D
タンパク質精製システム	GE Healthcare	Akta Pure
Light 顕微鏡	Nikon	SMZ745
IzIt 結晶色素	Hampton Research	HR4-710
電気泳動ユニット	Bio-Rad	1658005EDU
シェーカーインキュベーター	Zhicheng	ZWYR-D2401
インデックスクリスタルスクリーン	ハンプトンリサーチ	HR2-144
構造クリスタルスクリーン	分子寸法	MD1-01ProPlex
クリスタルスクリーン	分子寸法	MD1-38
PACTプレミアクリスタルスクリーン	分子寸法	MD1-29
JCSGプラスクリスタルスクリーン	分子寸法	MD1-37