このプロトコルは、フィジーベースのユーザーフレンドリーな方法論と、個々の細胞および湾曲した上皮組織におけるアクトミオシンの挙動を確実に分析する方法を説明する簡単な指示を提供する。チュートリアルに従うためにプログラミングスキルは必要ありません。すべてのステップは、フィジーと関連するプラグインのグラフィカルユーザーインターフェイスを使用して半インタラクティブな方法で実行されます。
方法論記事
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このプロトコルは、フィジーベースのユーザーフレンドリーな方法論と、個々の細胞および湾曲した上皮組織におけるアクトミオシンの挙動を確実に分析する方法を説明する簡単な指示を提供する。チュートリアルに従うためにプログラミングスキルは必要ありません。すべてのステップは、フィジーと関連するプラグインのグラフィカルユーザーインターフェイスを使用して半インタラクティブな方法で実行されます。
ショウジョウバエ未熟卵は卵室と呼ばれ、その構造は、発達中に円形から楕円体の形に形態的変化を受ける原始的な器官に似ています。この発達過程は、ウージェネシスと呼ばれ、次のフライ世代を確保するために機能的な成熟卵を生成するために重要です。これらの理由から、卵室は動物の臓器の発達を理解するための理想的で関連性の高いモデルとして役立っています。
いくつかのインビトロ培養プロトコルが開発されているが、これらのプロトコルにはいくつかの欠点がある。一つは、それらを固定し、分析された卵室の円周表面の画像取得面を増加させるために、画像化された卵室に人工的な圧力を加える様々なカバーの適用を含む。このようなアプローチは、長い軸を中心に卵室を回転させる力を生み出す薄いアクロミオシン機械の挙動に悪影響を及ぼす可能性があります。
したがって、この限界を克服するために、我々は卵室の周囲に沿ってアクトミオシン機械を確実に分析するために、メディアで自由にショウジョウバエの卵室を培養する。プロトコルの最初の部分では、局所的な細胞スケール(最大15セル)で限られた集録平面でアトミオシン機械を分析する方法を詳細に説明するマニュアルを提供します。プロトコルの第2部では、卵室の円周表面の定義された薄い層の簡単な抽出を可能にする新しいフィジーベースのプラグインをユーザーに提供します。次のプロトコルは、組織スケール(>50細胞)でアクトミオシンシグナルを分析する方法を説明します。最後に、これらのアプローチの限界を局所的な細胞と組織の両方のスケールで特定し、将来の開発の可能性と可能な応用について議論します。
ライフサイエンス分野における新しいイメージング技術やソフトウェア技術の継続的な発展は、生命の基本原理を理解する上で大きなインパクトを与えています。主な課題の1つは、様々な組織におけるライブイメージングと組み合わせた発達プロセスの信頼性の高い可視化です。組織は臓器や身体の一部であり、そのため、大部分はイメージングに容易にアクセスできません。そこで、生体内の生体内の生体内状況を十分に反映する生物学的事象を可視化するために、解剖と体外培養を可能にするプロトコルが開発されている。
過去数十年にわたり、ショウジョウバエの卵室の培養とライブイメージング、原始臓器に似たアシナー様構造は、原始臓器開発の基本原理の理解に大きく貢献してきました1,2,3.現在、利用可能ないくつかの培養プロトコルがあり、その使用法は、取得時間、画像化される細胞タイプ、およびそのアクセシビリティ(例えば、内生殖細胞系対外体線)4に依存する。
これらすべての培養プロトコルの共通の特徴は、液体媒体で高い収縮活性を示す分析された卵室の固定化の必要性である。卵室の収縮活性は、主に接続された卵室5、6、7の長い文字列をカバーする筋肉シートによって引き起こされる。したがって、若い卵室の適切な固定化を達成するために、様々なアプローチが開発され、カバースリップ6、8、9または柔軟な毛布4で卵室を覆うことを含む、 10または低融点アガロース3、11にそれらを埋め込む。これらのアプローチは、卵室の円周面の微妙な平坦化によるより大きな視覚面のイメージングも可能にするため、人気があります。
しかし、最近では、若い卵室(ステージ1-8)が前頭軸6の周りを回転し、この組織運動がこれらの若い卵室の周囲の表面に近い微細なアトミオシンネットワークによって動力を与えられることが示されている。12.したがって、この組織の微妙な平坦化によって引き起こされる細胞表面の人工的な変化は、力を発生させるアミュミオシン機械の挙動に悪影響を及ぼす可能性がある。対抗点は、卵室組織が平坦化されない場合、卵室の周面におけるタンパク質の顕微鏡イメージングは、集録面のサイズの減少によってさらに制限される。
したがって、Prasad et al.9と Celeste Berg 4,10のラボからプロトコルを組み合わせ、さらに改変して、開発された方法でカバースリップ/フレキシブル ブランケット/アガローズが使用されないようにしました。ショウジョウバエの卵室は、メディアで自由に培養され、ここで提示されるプロトコルは、反転顕微鏡のみを適用します。プロトコルには 2 つの部分があります。最初の部分は、卵室内の局所細胞スケール(最大15細胞)でのアトミオシンシグナルの分析に焦点を当てています。第2部では、卵室の自由な培養によって引き起こされる小さな集積面に関連する制限を克服することに焦点を当てます。この点に関して、我々は、円周組織表面の定義された層を選択的に抽出し、展開する半インタラクティブなグラフィカルユーザーインターフェイスを用いた新しいフィジーベースの計算方法を開発した。これに続いて、組織スケール(>50細胞)でアクトミオシンを分析する方法を説明するプロトコルが続きます。曲げられた上皮組織の定義された薄い層の選択的抽出は、古典的なZスタック投影(図1)を用いて容易に不可能であったので、この使いやすい方法は、包括的に理解するための重要な前提条件として機能する。ショウジョウバエ卵室の組織スケールにおける薄い(<1 μm)アミュニ発網の挙動。
さらに、プロトコルを容易にするために、我々は蛍光タグ付き非筋肉従来のミオシンII行動の例のタイムラプスムービー(TTLM)とサンプルファイルを提供する(補足ファイル3を参照)。ミオシンIIは、運動タンパク質であり、アクトミオシン機械の活性収縮部を表す。ミオシンIIを画像化するために、MRLC::GFPと呼ばれるミオシンIIの改変された調節性軽鎖を含むショウジョウバエトランスジェニックラインを使用しています(詳細は材料の表を参照)12,13.細胞膜を可視化するために、プロトコルは市販の染料に基づいています(材料の表を参照)。このプロトコルは、小さな細胞内MRLC::GFP信号12の分析だけでなく、Life-Act::GFP12、14で観察されたものなど、±300 μMの周りの類似サイズの細胞粒子の分析にも適しています。
これらのプロトコルは両方ともインビトロ培養ショウジョウバ卵室を用いて提示されるが、培養培養培養媒体の最適化および可用性に応じて他の組織を用いてアトミオシンシグナルの獲得を行うこともできる。対応する市販染料を有する蛍光タグ付きタンパク質または、例えばmRNAマイクロインジェクションを用いて一過性遺伝子発現プロファイルを得る。同様に、周囲の表面から薄い層を抽出するためのフィジーベースのプロトコルは、より一般的に楕円体および器官様組織に適用することができる。
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注:以下のプロトコルは、局所細胞およびショウジョウバエ卵室の組織スケールでアトミオシンを分析する方法についての指示を提供する。ローカルスケールのアプローチはユーザーが卵室あたり最大15細胞の詳細なアクトミオシンの行動を分析することを可能にし、高速イメージングおよび反転共焦点顕微鏡を使用して短期間(5-10分)のTLMの獲得を要求する。対照的に、組織スケールは50〜100細胞のアクトミオシン情報をユーザーに提供し、低速イメージングと反転紡糸ディスク顕微鏡を使用して長期間(≥30分)TLMの取得を必要とします(図2および参照)表 1の各スケールで推奨されるパラメーター)アトミオシン信号を分析するスケールの決定は、完全にユーザーの科学的な質問に依存します。付随するテスト TLN は、この決定を行うのに役立つはずです。
1. ローカルセルラースケール(LCS)
注:インビトロ培養ショウジョウバエ卵室で解剖および画像を解剖するには、補足ファイル1に記載のプロトコルに従ってください。取得した TTLM を分析するには、次のプロトコルに進みます。TTLM の付随するテスト ファイルへのリンクは、補足ファイル 3で提供されます。
2. 組織スケール
注:インビトロ培養ショウジョウバエ卵室で解剖および画像を解剖するには、補足ファイル2のプロトコルに従ってください。取得した TTLM を分析するには、次のプロトコルを続行します。TTLM の付随するテスト ファイルは、補足ファイル 3に配置されます。
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このプロトコルは、科学者が上皮組織におけるアトミオシンネットワークの挙動を調査することを可能にする。これは、局所細胞スケール(少数の細胞)におけるアトミオシン行動の詳細な分析が組織スケール(多くの細胞)で同様の分析と組み合わされた場合にのみ可能である。しかし、上皮組織はしばしば湾曲しており、これらの組織の薄い層の抽出は以前は容易に不可能であったが、ショウジョウバエの卵室に示すように(図1)。ここで示すプロトコルは、これらのスケールの両方でアトミオシンの動作を分析する方法を説明する簡単な指示をユーザーに提供します (図2)。
このプロトコルの最初の部分は、Surface managerプラグインを使用したアクトミオシンパルスの分析に関する指示に...
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卵室の解剖と培養のための重要なステップとトラブルシューティング
あまりにも多くのハエが小さなバイアルに置かれると、ハエの食べ物は幼虫と大人のハエがハエの食べ物に閉じ込められるので、2~3日後に泥だらけになる可能性があります。このような場合は、これらのハエの残りの部分を新鮮な食品と新しいバイアルに反転し、その数を小さくします。特に、食べ物に詰まった女性を除外します。
シュナイダーミックス(SM)は事前に調製する必要があり、〜14日間4°Cで保存することができます。古いミックスは、卵室の表面を損傷する可能性のある結晶が含まれている可能性があることに注意してください。常に新鮮なインスリンとSMを混合し、室温に達するのに十分な時間を許可します。これは、微小管の成長および細胞骨格の平面的な位置合わせに悪影響を及ぼす可能性のある冷たい衝撃から卵室を保護する(発達中のショウジョウバエ翼19に見られるように)。
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著者は何も開示していない。
著者らは、セレステ・ベルク研究所4から採用されたアプローチを使用して、卵室のインビトロライフイメージングに関する彼女のアドバイスを共有してくれたミリアム・オスターフィールドに非常に感謝しています。我々はまた、細胞セグメンテーションを可能にするフィジーのスクリプトのためにセバスチャン・トシに感謝します。
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| 名前 | 会社 | カタログ番号 | コメント |
|---|---|---|---|
| シュナイダーミディアム | ギブコ | 21720-024 | [+]-グルタミン |
| ペニシリン/ストレプトマイシン | ギブコ | 15140-122 | [+] 10.000 単位/mL ペニシリン [+] 10.000 µg/mL ストレプトマイシン |
| ウシ胎児血清 | シグマ | F135 | 熱不活化 |
| インスリン溶液 ヒト | シグマ | I9278 | |
| 50 mL ファルコンチューブ | エッペンドルフ | 滅菌 | |
| Millex-GV フィルター | ミリポア | SLGV033NS | 33 mm |
| ガラス底 マイクロウェル皿 | MatTek Corporation | P35G-1.5-14-C | 35 mm シャーレ、14 mm マイクロウェル、No. 1.5 カバーガラス |
| 鉗子 | A. Dumont &Fils | #55 | |
| CellMask Deep Red (cell membrane dye) | Invitrogen | C10046 | |
| FM4-64 (cell membrane dye) | ThermoFisher/Invitrogen | T13320 | |
| Depression dissection slide | Fisher Scientific | 12-560B | |
| Microscopic equipment | |||
| Steromicroscope | 例:Zeiss | Stemi SV 6 | |
| 倒立共焦点顕微鏡 | 例:ツァイス/オリンパス | ||
| ) スピニングディスク顕微鏡 | 例:ツァイス/アンドール | ||
| 顕微鏡ガラス/カバーガラス | (例:Thermo Scientific/Menzel Glas | ||
| Cactus tool> | |||
| Wironitニードルホルダー | ハンマッハ | 9160020 | |
| サボテンの背骨 | Echinocactus grusonii/barrel cactus | ||
| Drosophila 原稿で使用されている株 | |||
| AX3/AX3; sqh-MRLC::GFP/sqh-MRLC::GFP | 詳細については、Rauzi et al.: Planar polarized actomyosin contractile flows control epithelial junction remodelingを参照してください。ネイチャー2010、Vol.468、1110-1115ページ。 | ||
| AX3/AX3; sqh-MRLC::GFP; fat258D/fat2103C | 、Viktorinova et al.を参照してください:上皮回転は、アクトミオシンの平面対称性の破れに先行し、細胞の変形から上皮組織を保護します。PLoS Genetics 2017, Vol. 13, Issue 11, pg. e1007107. |
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