方法論記事

Biocytin 回復と塗りつぶされた海馬 ca 2 介在ニューロンの 3 D 再構成

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DOI：

10.3791/58592

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2018年11月20日

 ,  , 
1Department of Pharmacology, University College London

* These authors contributed equally

この記事について

サマリー

ここで説明したプロトコルを記述する蛍光分析、biocytin 回復と海馬 ca 2 介在神経細胞内の電気生理学的記録in vitro での許可神経以下の質の高い復元特性と調査されるべき最終的に細かい神経解剖学。

要約

どのようにプロセスを皮質ネットワーク活動情報基礎と臨床の科学的な質問の数が多いに重要です。ここで説明したプロトコルでは、この回路の基本的なビルディング ブロックを識別します。皮質領域の詳細な研究は最終的に回路部品と他の科学者脳の取得を理解するために必要なプロセス、情報と何がうまくいかない病気、生理中に格納を提供します。形態学的データは広く情報処理を探るモデル ネットワークの構築で計算神経科学者によって使用されます。ここで説明したプロトコルについて説明しますどのように海馬の ca 2 領域に記録された biocytin で満たされた細胞の回復し、3 D で再構築します。さらに、プロトコルは、カルシウム結合蛋白質またはペプチッド記録された介在ニューロンでコンテンツのデモをについて説明します。

概要

皮質および海馬神経の分類5,6の1,2,3,4, その間の関係の地図をサブタイプなどの複雑な構造は、します。,7,8,9,10,11この回路が認知機能12,13,14,15をサポートする方法もなお強烈な研究と継続的な議論の主題が。たとえば、詳細と回路の複雑性を理解して、多くのさまざまな研究から得られたデータを調整するを定義し、コンポーネントを記述することができるため非常に便利だが、それはどのように議論のための問題のまま多くの異なったニューロンの存在、あるいはそれが特定のクラスに属するすべてのニューロンを定義することが可能かどうか。計算ツールを構築でき、複雑さの度合いと回路をテストされている開発16,17,18, が、これらの努力の中心は細胞の詳細な研究の必要性それらの間の接続のプロパティ。使用して既に収集されて大量ラットの大脳皮質の局所神経回路についてのプロトコルがここで説明した10,19,20,21,22.「配線図」は完成には程遠い、明確なパターンやルールが浮上しています。、異なるいくつかの詳細がこれらのルールは、2 つの哺乳類種 (ラットおよび猫)、そしていくつかの新皮質領域、一般的な人間の大脳新皮質に同様に適用できる可能性のある基本的なビルディング ブロックの開発が可能.ここで説明する手法が研究されていない前に、詳細にプロトコルを使用している領域での接続に関与するシナプス前及びシナプス後ニューロンを識別することによって皮質の機能地図の私達の理解を拡張する使用は大人の脳組織の優秀な組織の温存と顕著な染色の回復ができます。細胞内の電気生理学的記録 (鋭い電極と一対の録音) を充填、biocytin と組み合わせることでこの方法で収集された ca 2 の局所回路でこのサブフィールドにおける神経膜特性データ蛍光抗体法、組織プロシージャおよび非常に詳細な神経再建、隣接 CA 地域23,24,25との直接比較を許可します。

長年にわたり細胞と高品質の適切な分類と両方の樹状突起と軸索のアーバー、ことができるデータの正確な復元を許可する詳細な神経解剖学を取得するこの資料に記載されている技術を開発しました。鋭い電極を使用してペアのレコーディングから収集した電気生理学的データに関連付けられます。組織のプロトコルは、神経細胞の微細構造を保持し、樹状突起 (含む棘) と軸索のアーバーの優秀な回復を取得する最適化されています。たとえば、まず固定液に浸漬し、第二に四酸化オスミウムで固定後の二重固定法の原理は、光顕26の良いコントラストを与えます。少量のグルタルアルデヒドとピクリン酸のソリューションは、固定液抗体浸透を強化し、以前研究27で推奨されている細胞の微細構造を保持するに追加されます。従来の洗剤ではなく、ショ糖、低温保護と組み合わせて凍結融解法を用いた脳スライスの透過はまた記録された細胞の詳細な形態学的分析のためのティッシュの最適な保全を提供します。さらに、特に非常に微細構造の可視化が過酸化水素 (H2O2) と水素化ホウ素ナトリウム (NaBH4) 孵化と、背景の汚損を減らすことによって向上します。西洋ワサビペルオキシダーゼ (HRP) に塩化ニッケル (NiCl2) を追加する黒色色素反応生成物を得る反応はまた、コントラストを向上させます。

次のプロトコルでは、優れた組織の温存と体外細胞内記録次の非常に詳細な神経 3 D 再構成を確認するための手順について説明します。スライス標本の説明を使用してペアの細胞内の録音の鋭い電極と私たちの研究室で使用される組織学的手順は、以前に報告された28をされています。450-500 μ m の厚さのスライスに biocytin 満ちている細胞内のセルに適用されますが、プロトコル、全体セルの録音に続く同じプロトコルを使用される可能性があります。ただし、薄いスライスの使用は、細胞の少ない完全な復元になります。

プロトコル

本研究で使用されるすべてのプロシージャは動物の科学的なプロシージャ法 1986 に関してイギリスのホーム オフィスの規則に従って行われました。

1. カルシウム結合蛋白質または介在ニューロンと電気生理学的記録、Biocytin 充填 Biocytin 可視化のタンパク質含有率の定量

注: 電気生理学的記録の最後に、biocytin 充填セルを含むスライスは組織学的手続き前一晩固定されます。プロシージャの残りの部分は、組織の損傷を防ぐために別の日に行われている場合、固定液は次の朝、0.1 M のリン酸バッファーの 1 つの変更で置き換えられます。(4% パラホルムアルデヒド、0.2% 飽和ピクリン酸液、0.025% グルタルアルデヒド溶液に 0.1 M のリン酸バッファー (PB)) の固定の解決は、最良の結果のための録音の日に新鮮なで行う必要があります。

  1. 電気生理学的記録の最後に、慎重に、絵筆で記録されたセルが含まれているスライスをピックアップし、人工脳脊髄液 (アプライド) を含む鍋にそれを置きます。
    メモ: スライスの準備および鋭い電極を用いた細胞内の録音のために使用されるプロトコルの詳細をされている28の前述します。
  2. 発煙のフードで慎重に絵筆を持つ脳スライスをピックアップし、上質なフィルター紙の小片の上にそれをロールバックします。スライスの上に湿らせたろ紙の別の部分に置き、固定液と 4 ° C で一晩冷蔵庫の中にストアの 5-10 mL を含む小さなプラスチック製のポットでろ紙の 2 つの部分を置き
  3. 蒸留水のゼラチン溶液を準備します。ホット プレート上のビーカーに 20 mL の蒸留水を配置し、60 ° C に熱する水に徐々 に 2.4 g のゼラチンを加え、溶解まで待ち、組織の損傷を防ぐために使用前に 35-40 ° C に冷却します。
  4. 固定液を 0.1 M PB の 2 mL に置き換えます。ペトリ皿のスライスを置き、メス刃を持つ任意の余分な組織を切り取る。シャーレ (直径 9 cm、高さ 1.4 cm) にトリミングされたティッシュを置き、ひだや折り目のないフラットし乾燥ペイント ブラシを使用して余分なバッファーを削除するそれがあることを確保します。
  5. 温かいゼラチン液と組織をカバーし、迅速にソリューションを冷却する冷凍ブロック上にペトリ皿を置きます。
  6. 角落ち着きランプを使用すると、コントラストを提供するために、料理の側に目を通すし、ゼラチンを開始を設定するまで細かいペイント ブラシからの光の圧力を使用してフラット、スライスを維持します。
    注: 組織がまとまらない場合は、ゼラチンを溶かし再ことができます。ほんの数秒の表面近くにランプの電球を移動することによって優しく表面層を溶融することによって立体化、絵筆の除去によるゼラチンの表面上の任意の欠陥を削除可能性があります。
  7. 設定ゼラチンの料理を冷蔵庫に移動し、30-60 分のための 4 ° c のまま。
  8. ヒューム フードの小さなブロックをカット (~ 1 × 1 cm) 小さいヘラを使ってブロックを持ち上げ、慎重に、4 ° C で少なくとも 30 分のスライスを修正するために使用、同じですが、新鮮な固定液にゼラチン包埋のメス刃を使用して料理を含む、.
  9. 3 回を 5 mL の 0.1 M PB ゼラチン ブロックを洗って、乾かして紙ティッシュとスティック ブロック側の (すなわち、上部組織) を vibratome には、瞬間接着剤を使用してくださいチャックの部分を使用してください。
  10. フィルター紙の部分で余分な接着剤を外し、ダイヤモンドの形を残し、ブロックの角を切断するメス刃を使用します。
  11. セクションは、vibratome を使用して 50 μ m の厚みでスライス、10% ショ糖を含むガラス瓶で各セクションを慎重に配置。
  12. 慎重にバイアルからセクションをピックアップし、シャーレの蓋にフラットに配置。解剖顕微鏡と新鮮なメスの刃を使用して、セクションの周りからゼラチンを削除し、セクションを新鮮な 10% ショ糖溶液 2 mL バイアルに戻します
    注: 脱水ステップ (ステップ 1.37) の間に組織の収縮を減らすためにこの段階で可能な限り多くのゼラチンを削除することが重要です。
  13. 低温保護それら 10% ショ糖溶液、20% スクロース-6% グリセリン溶液に 20 分で 10 分間 2 回、最終的に 30% ショ糖-12% グリセリン溶液で 30 分インキュベートし室温で 0.1 M の鉛ベースのスクロース グリセリン溶液中のセクションに 2 回一定の攪拌。
  14. 絵筆を使用してスズ箔の小さな四角形にフラットをセクションに配置します。セクションから余分な液体を外し、慎重に小包にスズ箔を折る。
  15. 30 の表面に触れることがなく液体窒素の表面近くに小包を保持する s し、約 30 s. 繰り返しの凍結融解の別の 2 回を完全に解凍するセクションができます。
  16. ペイント ブラシのすべてのセクションを削除し、含む過剰蔗糖を洗浄する一定の攪拌下で 0.1 M の PB の 2 mL バイアルに配置します。
  17. パスツール ピペットで PB を取り外して 30 分洗浄 2 mL に 0.1 M PB 部の 1% 水溶液 H2O2の 2 mL でセクションを孵化させなさい 3 x 5 分。
  18. パスツール ピペットで 0.1 M の PB を削除し、0.1 M PB で 1% 水素化ホウ素ナトリウム (NaBH4) を追加します。
    注: は、NaBH4ソリューションを放つ水素ガスとして、バイアルをキャップしません。
  19. パスツール ピペットと水素化ホウ素ナトリウムを取除き、洗浄のセクションで徹底的に 0.1 M の PB の 2 mL 5 x 5 分。
  20. 0.1 M の PB を 30 分の 0.1 M PB に 10% ヤギ血清 (NGS) に置き換えます。
  21. ヤギ血清を取り外して、マウスのモノクローナル抗体と ABC ソリューションで作り上げたウサギ ポリクローナル抗体の混合物の 4 ° C で一晩セクションを孵化させなさい。
    注: 以前の研究で使用される一次抗体のリストが Botcherらで表 1に表示されます。(2014)29。
  22. 蛍光標識二次抗体 (材料表) の混合物で暗闇の中で 2 h のセクションを孵化させなさい。
  23. メディアをマウントし、coverslip でカバー スライド セクションをマウントします。
  24. 40 倍の倍率 (図 1 bb) で蛍光ラベルの画像を取る。
  25. 蛍光イメージング後、PBS を含むガラス シャーレにスライドを置き、coverslip を慎重に取り外します。パスツール ピペットから PBS の穏やかなパルスを使用してスライドをセクションを洗います。PBS を含むきれいなガラス瓶にセクションを配置します。
  26. アビジン HRP 反応を実行するには、まず HRP 反応生成物を増幅する少なくとも 2 時間 ABC の各セクションをインキュベートします。
  27. 3, 5 ジアミノベンジジン (軽打) ソリューションを準備するには、5 mL の蒸留水に 1 つのタブレットを追加します。
  28. PBS で 10 分の 3 回のセクションを洗って、Tris バッファー 2 倍で 10 分間と最後の洗浄後 Tris バッファーを削除します。
  29. 8% NiCl2液の一滴を DAB ソリューションに追加を素早く、ピペットのソリューションにミックスしてすぐにセクションをこの溶液 1 mL を追加します。15 分間軽打/NiCl2ソリューションのセクションを孵化させなさい。
  30. DAB ソリューションに 1% H2O2の 10 μ L を追加します。約 1、2 分間一定の動揺の下で暗闇の中で進み、解剖顕微鏡で塗りつぶされたセルのラベルを監視への反応を許可します。
  31. DAB/NiCl2/H2O2ソリューションを削除することによって反作用を停止し、5 分間 2 回 Tris バッファーのセクションを洗ってください。
  32. ヒューム フードのシャーレに濾紙の小さな円を配置し、0.1 M pb 水を差します。ガラスから一度に 1 つずつバイアル、絵筆を使って、それらが、紙に慎重にフラットに配置のセクションを持ち上げます。
  33. ろ紙で湿らせた別の円のセクションをカバーし、優しく表面をティッシュ ペーパーに触れることによって余分なバッファーを削除します。
  34. 一番上の紙に 8-9 0.1 M PB で 1% オスミウム四酸化二滴を適用、カバー皿、少なくとも 30 分間、1 h 以上の発煙のフードを保持します。
  35. ペトリ皿を開き、一番上のフィルター紙を持ち上げます。セクションを慎重に持ち上げて、絵筆で一度に 1 つずつはガラス瓶でそれらを配置し、2 回蒸溜水でそれらをすすいでください。
  36. 四酸化オスミウム廃棄物を適切に破棄します。すべて使い捨ての機器を洗浄し、適切な容器に入れます。
  37. スライド ガラスと coverslip にフラットを各セクション セクションに配置します。ペトリ皿にスライドを転送、場所と 50% アルコールでカバーでそれを保持する coverslip 空バイアルにかぶせます。15 分後スライドをソリューションから削除し、スライドからのセクションを削除します。場所セクションをスライドの前後 15 分 70% アルコールにスライドを配置は、95% そして 100% アルコール溶液と同じ処理を繰り返します。
  38. 次の脱水ステップ セクションをヒューム フードのシェーカーに 100% アルコールを含んでいるガラスの瓶に転送します。酸化プロピレン (C3H6O) とアルコール溶液を交換し、5 分 3 回洗浄します。次の最後の洗浄バイアルに酸化プロピレンの 〜 2 mL を維持し、樹脂 (1:1) を追加します。樹脂を溶解することを確認し、30 分間一定の動揺の下でセクションを保ちます。
  39. 木の棒を使用してエポキシ樹脂を含むアルミニウム プランシェットの各セクションを置き、一晩インキュベートします。
    注: セクションの損傷のリスクを避けるために 24 時間以上の樹脂の部分を残してはいけない。
  40. 約 10 分のホット プレート上プランシェットをそれぞれピックアップ場所の木の棒でセクション、きれいなスライドの上に置きます。各セクションの向きの解剖顕微鏡を使用して一貫性を維持します。観察をセクションに置きます。治すための 56 ° C で 48 時間オーブンにスライドを配置します。

2. 3D 神経再建

注: Neurolucida ソフトウェアが使用されます。下記の手順は、特定のニューロン再構成システム (材料表) のみに適用されます。切削加工から得られるセクションは、顕微鏡を使用して再建する前に照合されます。

  1. スライドをステージに配置しステージ クリップで固定し、ニューロン再構築ソフトウェアを開きます。[取得] タブをクリックし、ライブ イメージを選択します。
  2. 油対物レンズ × 100 を使用して各セクションの厚さを測定します。上部と各セクションの末尾に z メーターの値を確認し、2 つの値の差として厚を計算します。
  3. 低倍率の目的を使って、細胞体を含むホームセクションに焦点を当てます。100 × 対物、細胞体に焦点を当てるで基準点をマークする中心をクリックします。
  4. [トレース] タブからシリアル セクション マネージャーを選択します。シリアル セクション マネージャー ] ウィンドウの新しいセクションの作成(+ アイコン) をクリックします。セクションの番号を入力します。Z 順序内の各セクションの名前し、手順 2.2 単位カットの厚みを入力します。
  5. 100 X の目的を使用して 3 D で相馬をトレースするには、トレース] タブから輪郭を選択し、細胞体の輪郭線を選択します。細胞体の一番上にフォーカスを移動するのにには、ジョイスティックを使用します。現在フォーカスのある部分の周囲をクリックしてポイントを配置します。右クリックして、この最初のアウトラインを終了する閉じる輪郭を選択します。細胞体の下部 (図 2) に到達するまでは、別の z 位置でこのプロセスを繰り返します。
    注: は、3 D の細胞体を可視化するトレース] タブで3 D の視覚化を選択します。
  6. 100 X の目的を使用して 2 D の細胞体をトレース、トレースタブ細胞体の中間に焦点を当てるのニューロンメニューから細胞体を選択します。細胞体の周囲をクリックしてポイントを配置します。細胞体を完了するには、右クリックし、細胞体の終了を選択します。
  7. 樹状のアーバーをトレースするには、ニューロンメニューで樹状突起や樹状突起を選択します。まず、樹状突起の直径に合わせてカーソルの直径を調整するマウスのスクロール ホイールを使用して各デンドライトの初期、短いセグメントをトレースします。ジョイスティックを使用してトレースの直径を調整するセクションとマウスのスクロール ホイールで移動する各樹状突起に沿ってトレースします。
  8. トレース ライブ顕微鏡画像との位置合わせを確認し、ジョイスティックを使用して移動した後に特に必要な場合を調整します。[トレース] タブでトレースの整列] を選択、トレースをクリックして、正しい場所をクリックします。
  9. ツリー内のノードに達すると、右クリックし、分岐ノードまたはTrifurcating ノードをドロップ ダウン メニューから選択します。
  10. 分岐の端に達しているときは、ニューロンメニューのドロップ ダウン メニューから終了を選択します。すなわち正しい終了の種類を選択します。、高終り、正常終了または l のow 終了セクション間の対応付けを容易にします。
  11. 現在のセクションのすべての樹状突起、追跡されて、喜び無料タブを選択し、完了したセクションの下または上にすぐに一致するセクションに移動したら、顕微鏡の倍率を減らします。
  12. 完成品のセクションに一致するセクションの樹状突起の間の一致するポイントを識別するために [移動] タブをクリックし、マッチ ポイントを選択します。一致するために必要なポイントの数を選択 (3 点以上が望ましい) し、 [ok]を押します。完全なブランチの終了をクリックし、[分岐] をクリックします。マッチ ポイントごとにこの手順を繰り返します。正確に一致することを確認する 100 倍の倍率でこのプロセスを繰り返します。
  13. エンディングを右クリックしてで直接前のセクションに一致する枝を追加します。分岐が完了したトレース支店と、先ほど説明したトレース並ぶときは、エンディングに追加を選択します。
  14. 各セクションのすべての樹状突起を追跡されている、一度ニューロンメニューから軸索を選択する同じプロセスを使用して軸索をトレースします。
  15. ホームセクションに再整列ライブ顕微鏡画像による再建、事前定義された輪郭/レイヤーの境界線/地域国境トレースタブから輪郭を選択し、輪郭に沿ってトレースするクリックを移動します。最後の開いた輪郭を選択します。すべての必要なレイヤーと領域のアウトラインをトレースします。
  16. [トレース] タブの3 D 視覚化を使用して 3 D で再建を視覚化します。
  17. 3 D 再構成 (ビデオ 1) のビデオを記録する 3 D 再構成、作成するムービーを開きます。保存先としてファイルを設定し、回転速度を必要に応じて。270 ° の回転を設定することをお勧めします。録音を開始、いくつかの秒の記録を選択自動回転]をクリックします。必要なときに録音を停止を選択します。ビデオ編集ソフト (材料表) でビデオを編集します。
  18. Tiff あるいは jpeg 形式のファイルにファイルをエクスポートするのには、ファイルを選択 |エクスポート |イメージとしてエクスポート トレース。Μ m/ピクセル比を選択し、フィットを選択します。背景色を選択し、ファイルを選択します。ファイルの名前、Tiff または JPEG を選択し、保存を押します。ベクトルファイルにファイルをエクスポートするには、ファイルを選択 |エクスポート |ベクター ファイルとしてエクスポート トレース。
  19. ニューロン再構成解析ソフトウェアを使用すると、形態計測学的解析を実行できます。
    1. 樹状突起を分析しデンドロ グラムを取得、Neurolucida エクスプ ローラーでファイルを開きます。分析を選択 |構造と (図 3) ドロップ ダウン メニューから選択のデンドロ。
    2. 3 D 再構成 (分岐の複雑さ、枝と細胞体、表面積のボリューム) の包括的な形態の分析を実行するには、ソフトウェアのファイルを開きます。[表示] タブで、すべて選択をクリックします。[分析] タブを選択します。構造と分岐構造解析を選択します。

3. トラブルシューティング

  1. カメラの設定を変更します。最高の結果を得るには、露出時間を 100 ミリ秒未満に設定を得るためし、できるだけ 0 に近いとしてオフセットします。
  2. ニューロン再構成ソフトウェアによってトレースタブの3 D 視覚化で 3 D 細胞体としてのトレースの輪郭が自動的に表示されない場合トレース] タブでオブジェクトを選択を選択して、キーボードのCtrlキーを押しながら、すべての輪郭の描画をクリックして、右クリックし、ドロップ ダウン メニューの [セル本体を設定します。
  3. 各支店の z パラメーターを調整し (トレース] タブでオブジェクトを選択を) ツリーを選択、設定、右クリックしてのすべてのポイントの z 調整ドロップ ダウンします。変更 z 位置を選択し、シフト z 値を選択し、必要な値を入力します。
  4. トレース上に大規模な距離を移動する必要がある場合を '移動' タブで 'Go To' 使用して再建を再編成します。
  5. 復興過程における任意の時点で追加のノードを追加します。ノードを右クリックし、(オブジェクトの選択枝をクリックしてトレース] タブで) に配置する分岐を選択し、選択されているツリー ノードの挿入]を選択します。枝上の正しい位置をクリックします。
  6. 複雑なニューロンを再構築するとき一致する枝を個別にトレースし、後枝の識別が容易にそれらを接続します。個別に新しいセクションで分岐をトレースし、前のセクションに一致する枝にスプライシングされるを右クリックし、接続を選択する分岐の結末をホバリングし、エンディングをホバリングでこれらの枝を添付します。枝にスプライシングされるし] をクリックします。
  7. 場合は間違ってツリー型下分岐のトレースは、ツリーを選択、右クリックし木の種類の変更を選択し、適切なツリー型を選択します。
  8. ポイントの位置が正しくない、実行、 ctrl キーを押しながら Z、または最後のポイントを削除するトレースメニューの元に戻すボタンをクリックします。ただし、ジョイスティックを使用してポイントを削除しようとする前に、のセクション間で移動する場合、この手順は動作しません。この場合、分岐が終了したときは、ポイントを削除可能性があります。削除し、右クリックして選択ポイント ホバー支店 (プレスオブジェクトの選択およびブランチをクリック)、選択ポイントを削除します。
  9. 枝が z 平面で一致または 2) 機能を使用して側面を示すシリアル セクション マネージャーでを表示するかどうかがすぐにセクション 2 つの分岐が一致するかどうかいずれか 1) で使用する3 D 視覚化[トレース] タブを確認するよく分からない場合上記とグレーの現在のセクションの下。
  10. セクションを反転させる場合は、トレースタブでツールにXY スケールの調整を選択し、x 軸は-1 に変更を移動します。正しい Z 収縮を選択し、z 軸を-1 に変更します。その後、いつものように枝をトレースします。元の方向を持っていたセクションに移動するときにこれらの変更を逆にしてください。X 軸と z 軸を変更するがないラベルの終了ブランチを変更するので、注意スプライシング正しい語尾が使用されているとき。
  11. 断面の厚さとマウントされている板厚計測に大きな差がある場合、正しい Z 収縮を修正できます。[トレース] タブのツール、それからZ 収縮を修正を選択し、マウントの厚さで割ったカット厚さの 10 進表現として z 軸の収縮率を入力します。

結果

CA2 の海馬のニューロンは、次の電気生理学的記録 (数字 1Ac、広告および1Bc Bd) biocytin でいっぱいだった。スライスは、一晩録音に続く修正され、神経化学、神経細胞の形態的特性は、ここで説明したプロトコルに従う明らかにされました。

スライスまず一次抗体と、蛍光標識二次抗体の孵化によってカルシウム結合蛋白質または塗りつぶされた介在神経細胞のタンパク質含量を求めた。録音中に介在ニューロンの発火特性は、一次抗体の使用の選択によって決定されます。アビジン マルチカウンタオートマタが biocytin で満たされた介在を視覚化する使用され、抗マウスかに (FITC) とヤギ抗うさぎテキサス赤 (TR) が介在神経 (図 1 bb) を特徴付けるために使用されました。

次の蛍光可視化 biocytin (図 1 ab) を明らかにする HRP プロトコルが使用されました。Ca 2 介在神経の細かい詳細な解剖学にいた 3 d ニューロン再構築ソフトウェア (図 2および図 3 a) を使用して描画されます。Ca 2 の記録、バスケット細胞の 3次元再構成のビデオは、ビデオに表示されます。樹状突起と軸索の両方のアーバーは 450-500 μ m のスライスの深さに限られていた場合、神経再建が完了として考慮されました。貧しい軸索アーバーの染色は、軸索起始部と非常に近位枝に限られていた上部または汚損、またはスライスの下に開いているエンディングで切り捨てられた枝の存在によって評価されました。図 4は、良いと悪い HRP 染色次 biocytin 視覚化の例を表します。

分岐の複雑さ、相馬表面積と表面積および樹状突起と軸索のアーバーのボリュームを示す 3 D 再構成 (図 3) の形態計測学的解析が行えます。

figure-results-1
図 1:バスケット細胞の 2 種類の神経の再建記録し海馬 ca 2 地域を埋め、細胞内の録音の後で得る電気生理学的データを相関生体外で。この図は、以前の研究23,24から変更されています。そんな地層オリエンス、SP 地層属三角骨、SR 地層結腸寄生虫、SLM 地層 Lacunosum Moleculare。(A) Aa: 図面管 (1000 倍) を使用して制限の樹状突起と軸索のアーバーと ca 2 バスケット細胞の再構築。樹状突起は黒で、軸索は赤で。Ab: ここで記述されているアビジン HRP プロトコル、次 biocytin いっぱいバスケット細胞のイメージ。Ac: 電圧応答に過分極と制限の樹状突起と軸索のアーバーと ca 2 バスケット細胞の電流注入を脱分極の代表的なトレース。Ad: アーバー バスケット細胞の接続を絞り込む ca 2 ピラミッドの例は、鋭い電極を使用して記録されます。複合興奮性シナプス後電位 (EPSP) 平均 3 つのスパイクの列車に応答中に見かけの簡単な鉄道うつ病を表示します。(B) Ba: 図面管 (1000 倍) を用いる広い樹状突起と軸索のアーバーと ca 2 バスケット細胞の 2D 復興。Ca 2 領域と水平になどと CA2 と CA3 領域の SP のすべてのレイヤーを放射状に拡張 (ブラック) でこのバスケット細胞の樹状ツリー。1 つの水平デンドライトまた CA1 領域に達した。(赤) で軸索は、地域 CA1、CA3 に拡張。Bb: biocytin いっぱい (マルチカウンタオートマタ染色) バスケット細胞だった PV 陽性 (FITC 染色) と CB, (テキサス赤染色)。紀元前: 電圧応答に過分極と広い樹状突起と軸索のアーバーと ca 2 バスケット細胞の電流注入を脱分極の代表的なトレース。Bd: 複合 EPSP 平均示す簡単な鉄道促進 3 つのスパイクの列車に応答中に。介在ニューロンの ca 2 に記録の他の種類の例としては、前研究25、30で見つけることが。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。 

figure-results-2
図 2:3 D の細胞体再構成します。(A) 細胞体の 3 D トレースします。細胞体を通して焦点を当ててしながら別の z 位置でトレース異なる輪郭の眺め。(B) 別の輪郭の 3 D ビュー。(C) 異なる角度で細胞体の 3 D ビュー。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。 

figure-results-3
図 3:3 D ニューロン再構築の形態学的解析。(A) ca 2 狭いアーバー バスケット細胞の 3次元再構成。各樹状突起分岐は色 (緑、青、赤、ピンク) で表され、軸索は、水色。(B) 樹枝状の枝の数と、相馬、相馬から 100 μ m 間隔で、同心の球内に含まれる各セグメントの長さを表すバスケット細胞のデンドロ。A. (C) (前研究23から適応) CA2 錐体細胞の形態計測学的解析事例の樹状突起のデンドロの色対応します。樹枝状の枝の数は、CA2 錐体細胞の細胞体からの距離に対してプロットしました。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。 

figure-results-4
図 4:(A) と貧しい良い (B) HRP 染色の例。(A) Biocytin 回復 ca 2 で非常によく満たされた介在を明らかにしました。細胞体 (CB) は暗く染色で、明確なアウトライン。樹状突起は、ビーズし、いくつかの棘 (赤い星で表される) を表示しました。(A) 軸索のアーバーは密と小さなボタンをプレゼントします。(B)、貧しい樹状突起と軸索の染色 2 CA2 錐体細胞の例です。CB の汚損がない明確な輪郭と薄いです。非常にいくつかの biocytin で満たされた枝の存在下で、その結果短期間の電気生理学的記録に、貧しい染色すること多くの場合関連付けられます。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。 

ビデオ 1:地層属三角骨、すべてのレイヤーおよび ca 2 地層属三角骨と隣接する地層オリエンスの軸索にまたがる樹状突起におけるそのソーマと制限の樹状アーバー (ca 2 狭いアーバー バスケット細胞とも呼ばれる) と ca 2 バスケット細胞の3 D 神経機能再建結腸寄生虫。非常にほとんどの枝は、近位の CA3 地層オリエンスと CA3 地層属三角骨に達しませんでした。このセルは、次の電気生理学的記録 biocytin に満ちていた、アビジン HRP ここで説明したプロトコルを次にセクションが処理されます。スライス、による樹状突起がそのままスライスの深さ内の軸索だけ回復されました。樹状突起は、濃いピンクと白の軸索です。レイヤーと領域の境界は、ビデオの先頭に追加されています。スベニア フォークでジョージア エコノミド 3 D ビデオによる三次元再構成。ビデオは、ステップ 2.17 で述べたようにニューロンの再構成ソフトウェアで記録され、ビデオ編集ソフトで編集します。ビデオへのリンク:30。このビデオをダウンロードするにはここをクリックしてください。

使用するソリューション組成/手順
固定の解決4% パラホルムアルデヒド 0.2% 飽和ピクリン酸水溶液、0.025% グルタルアルデヒド溶液に 0.1 M のリン酸バッファー (PB)
0.1 M のリン酸バッファー pH 7.6900 mL の蒸留水に 1 M のリン酸バッファー在庫の 100 mL を追加します。
リン酸緩衝生理食塩水 (PBS) pH 7.4/7.50.1 M リン酸バッファー、KCl と 990 mL の蒸留水に NaCl の 8.76 g 0.2 g の 10 mL を追加します。
TRIS バッファー pH 7.5トリス塩酸と 50 mL の蒸留水でトリス基地 1.66 g 5.72 g を溶解します。蒸留水 1 L までを行います。
バッファー, グルタルアルデヒドおよびパラホルムアルデヒド固定液4% パラホルムアルデヒド 0.2% 飽和ピクリン酸水溶液、0.025% グルタルアルデヒド溶液に 0.1 M リン酸緩衝。
ABC ソリューションABC キットから使用する前に、少なくとも 30 分を可能にするソリューションです。2.5 mL の PBS に溶液の 1 滴とソリューション B の 1 滴を追加します。
Durcupan エポキシ樹脂20 ポットを作成する: コンポーネントは、コンポーネント B の 20 g、コンポーネント C の 0.6 g とコンポーネントの D-0.4 g 20 g
フィルター ペーパーの円プレートを覆うことによって流出からのバランスを保護します。慎重に上記の割合で tripour ビーカーに試薬の重量を量る。少なくとも 5 分の 2 つの木の棒を使用して積極的に攪拌によって徹底的にミックスします。混合物は均一な密度の濃い茶色になります。最大可能な限りできるだけ多くの空気の泡を削除する 10 分 ~ 50 ° C でオーブンにビーカーを置きます。注: 樹脂は、プラスチックの鉢に 5 mL 注射器を 10 分デカント以上のオーブンでビーカー樹脂を残して、それらを日付、使用の準備ができての-20 ° C のフリーザーで保存場合治すため開始されます。

表 1: ソリューションの表。 

ディスカッション

電気生理学的記録の in vitro (図 1 Ac、d 、紀元前 d) 併用組織化学的、免疫組織化学的手順詳細な形態、カルシウム結合タンパク質のコンテンツを有効にして明らかに大人の皮質介在ニューロンの id が記録されます。Ca 2 地域でこの手法は初めての局所神経回路の研究を許可し、CA1、CA3 でないが以前記載されていた介在のサブクラスを明らかに: 樹状突起・軸索の広いアーバー バスケット細胞 (図 1 b)解像細胞と SP SR 介在ニューロン。

ここで説明されているプロトコルは、神経細胞の微細構造を保持し、樹状突起 (含む棘) と軸索のアーバーの優秀な回復を取得する最適化されています。重要なステップなど光顕26のコントラストを高めるため二重固定法の使用抗体浸透を強化し、神経を保持する固定液に, グルタルアルデヒドおよびピクリン酸溶液添加微細構造の27。Osmication と樹脂埋め込み z 平面収縮28に削減、穏やかな凍結融解の透過は微細構造のより良い保全を提供します。また、H2O2と背景の汚損を抑える NaBH4セクションの孵化によって (たとえば小さなボタンと軸索の罰金) の微細構造の可視化が向上します。コントラストは、HRP 反応に NiCl2を追加して増やすことができます。

ここで詳細な病理組織学的のプロシージャでは、再現性と信頼性の面で優れた結果を提供しています。ただし、電気生理学的記録の期間は biocytin/蛍光染色、貧しい軸索染色に通常関連付けられている短い録音の品質を決定します。微細解剖学の biocytin 保存/保護プロトコル (全細胞パッチク対鋭い電極を用いた細胞内記録) を記録する選択も影響します。

感謝は、ここで説明した組織学的処理と 100 倍の倍率 (軸索の複雑さによっては 1-4 週間) で再構築するのにかかる時間の間に微細構造を維持する、このメソッドにより、困難に遭遇しながら、樹状突起と軸索直径の正確な表現です。ただし、これらはしばしば微細軸索分岐の明確に可視化を妨げ、以下の biocytin ラベルを明らかにする要求の厳しいプロトコルの使用は理解できます。洗剤、アビジン-HRP biocytin と抗体を明らかにするためのエントリを促進するために、厚いセクションで必要が、微細構造を混乱させることができます。神経科学者検索、復興の半自動の方法の常が、今、マニュアル再建を特に biocytin HRP 軸索ゴールド スタンダード31のままです。

非常に詳細な神経再建、軸索の研究とノード、有無、ミエリンのそしてより一般的に沿って正確な軸索直径の表現で完全な軸索のアーバーの図面変更の特に正確な図面その長さ、さらに別個の interneurone の型を正確に識別のための情報を提供します。上記手法は、神経電気生理学的特性、接続の特定の種類に関連付けられているし、詳細な短期可塑性に相関のデータを提供しますが多く介在神経細胞は、特定のクラスと正確に合わない場合があります、神経再建、配線図、ca 2 地域でできるように詳細に検討します。

計算モデルの罰金、詳細な構造が簡素化されました。ながら理解できるが、この結果、将来的に重要かもしれない情報の損失。シナプスの並列データの詳細な 3 D 再構成の分析は介在神経細胞分類の基準さらに添加を可能にします。データは、公開リポジトリに堆積して計算軸索直径と活動電位伝搬の髄鞘形成の散発的な変化の結果を探検するモデラーのために使用できます。

開示事項

著者が明らかに何もありません。

謝辞

この研究はノバルティス ファーマ (バーゼル) と授与教授アレックス ・ トムソン、バイオ テクノロジー ・生物科学研究会議 (BBSRC-BB/G008639/1)、日本生理学会、欧州連合の医学研究議会から資金を受けています。ホライズン 2020年枠組み計画研究・革新特定無償契約第 720270 の下で (人間の脳プロジェクト SGA1) と特定無償契約第 785907 の下で (人間の脳プロジェクト SGA2)。非常に感謝しております教授アレックス ・ トムソンに彼女の継続的な支援、資金調達、その他の皮質でプロトコルを設定するためこのプロジェクトのため。研究室のメンバーを回復プロトコルの最適化を助け、CA2 神経細胞を再構築による貢献は感謝し: j. Deuchars、h. Pawelzik、d. i. ヒューズ、a. p. バニスター、k. イーストレーク、H. トリッグ、N. A. Botcher。

材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
アビジン-7-アミノ-4-メチルクマリン-3-酢酸(アビジン-AMCA)抗体-20.8 mg / mL ベクターラボラトリーズA2008
シチン  ≥98% (TLC)ΣB4261
3,5 ジアミノベンジジン (DAB) 錠剤、5 mLシグマD4293
Durcupan エポキシ樹脂 AΣ44611
Durcupan エポキシ樹脂 BΣ44612
Durcupan エポキシ樹脂 CΣ44613
Durcupan エポキシ樹脂 DΣ44614
エタノール、純度 p.a.、絶対、≥99.8%シグマ32221
ゼラチンシグマ48723
グルタルアルデヒド溶液、グレードI、H2OシグマG5882
≥99% シグマG5516
ギ血清シグマG9023
ギ抗マウスフルオレセインイソチオシアネート(FITC)-14.3 mg / mLシグマF2653
ギ抗ウサギテキサスレッド(TR)-3.3 mg / mLInvitrogenT2767
酸化水素、30%溶液シグマH-1009
浸漬油、粘度1.250 cSt(点灯)シグマI0890
塩化ニッケル (NiCl2 . 6H2O)Sigma N5756
四酸化オスミウム、電子顕微鏡用、4%H2O Sigma75632
パラホルムアルデヒド、試薬グレード、結晶性 シグマP6148
ピクリン酸、水で湿らせた、≥98%シグマ197378
リン酸緩衝液 1 MシグマP3619
プロピレンオキシド (C3H6O), 99%Alfa Aesar 30765
テトラヒドロホウ酸ナトリウムVWR27885.134
ショ糖フィッシャー科学S / 8600 / 53
トリズマ塩酸塩、≥99.0%シグマT5941
トリズマベース、≥99.9%シグマT6066
ベクタシールド退色防止実装媒体、屈折率1.45 ベクターラボH-1000
ベクタステイン エリート ABC HRP キットベクターラボPK6100
使用機器 
ビブラートーム寒天 Scientific
C4A カップ入りアルミニウム プランシェット GA-MAとアソシエイツ株式会社
ライカDMR顕微鏡 Leica Microsystems
X-Cite 120PC Q  蛍光光源 エクセリタス・テクノロジーズ 
ライカ DFC450 デジタルマイクロスコープカメラ ライカマイクロシステムズ 
ラピドグラフ製図ペン0.18mm ロンドングラフィック
ラピドグラフペン先ロンドングラフィックセンター
ラピドグラフ製図ペン0.25mm ロンドン・グラフィックス・センター
0.25 mm ラピドグラフ・ペン先ロンドン・グラフィックス・センター
PCワークステーション、ステージ、カメラ、XYZステージ制御用ジョイスティックを含むニューロルーシーダ・システムマイクロブリフィールド(MBF) バイオサイエンス
ニューロルーシーダ・ソフトウェア・バージョン2017マイクロブリフィールド(MBF) バイオサイエンス
CorelDRAWグラフィックス・スイート X5Corel
動画編集ソフト Adobe Premiere Pro
ガラスバイアル 14 mLフィッシャーサイエンティフィック 
バイオグリセロールで25%、ヤヤヤ過センター0.18mm

参考文献

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Biocytin 回復と塗りつぶされた海馬 ca 2 介在ニューロンの 3 D 再構成
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