方法論記事

リンパ管内皮細胞のフローサイトのマウス肝臓の消化

DOI：

10.3791/58621

⸱

2019年1月7日

 ,  , 
1Division of Gastroenterology and Hepatology, Department of Medicine, University of Colorado Anschutz Medical Campus, School of Medicine, 2Department of Immunology and Microbiology, University of Colorado Anschutz Medical Campus

この記事について

サマリー

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

このプロトコルの目的は、説明されているマーカーを用いた肝臓内リンパ管の内皮細胞集団を識別するためにです。コラゲナーゼ IV と DNase と組み合わせてフローサイトメトリー、リンパ管内皮細胞の明瞭な人口を識別するために、組織の穏やかなミンチを駆使しています。

要約

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

肝臓内ポータル トライアド内リンパ管に発見されてし、記述されている機能はリンパ節、肝臓から間質液を削除する細胞残渣および抗原を調査することができます。リンパ血管が炎症や肝臓内の免疫細胞の機能に関与する方法を理解することに非常に興味を持っております。しかし、ほとんどはリンパ血管内皮細胞 (LECs) 肝臓や肝臓の評価に使用することができます特定のマーカーからの分離のための消化力のプロトコルを確立する公開されているセルごとに LECs。したがって、消化や肝臓で LEC の人口を評価するために、肝臓の染色法を最適化されています。ここで概説している方法を LECs の肝臓からの単離、同定に役立つ LECs が肝の微小環境に応答する方法の私達の理解を強化して確信しております。

概要

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肝臓のリンパ管と LECs の役割はよくわかっていません。リンパ管肝1のポータル トライアド内にある病気の2の間に展開し、ほとんどは機能および肝臓内 LECs の表現型について理解されます。LECs3に主にあるマーカーの発見と恒常性と病気ニッチを異なる組織内でこれらの細胞の重要性は私達の理解の重要なギャップを埋めます。LECs は、T 細胞4,5,6,7,8、と直接相互作用によってリンパ節、転移性腫瘍周辺の公差を維持する上で主要な役割を持っています。9,10,11,12,13。 リンパ節で LECs は、渡り鳥樹状細胞14,,1516との相互作用を介して防御免疫を促進できます。したがって、特定組織と相互作用が存在するかもしれない LECs に複数のロールがあります。ただし、非常に少しは LECs が組織の免疫細胞と対話する方法または LECs が異なる器官システムでどのように機能するかについて理解したがって、肝臓や他の臓器内のセルごとごとに LECs を評価 LECs プログラムの組織特異的免疫の進歩につながる可能性があります。肝臓で LECs に焦点を当てて文献の多くはマーカーと形態17の 1 つまたは 2 つ使用して LECs を可視化する顕微鏡を使用して、ほとんどはフローサイトメトリー、しかし 1 つの調査を使用してセルごとに LECs を具体的に評価に行われています。肝類洞内皮細胞 (LSECs) と LECs18の違いを評価しました。フローサイトメトリーによる肝臓のレック集団を分析できることで、LEC の表現型の詳細な研究通常恒常性や病気の時にことができます。

フローサイトメトリーによる LECs を評価するには、複数の表面マーカーが必要です。通常、LECs は、プロスペロー関連ホメオ ボックス 1 の式 (Prox-1)、リンパ管の内皮細胞のヒアルロン酸受容体 1 (LYVE1) または顕微鏡を用いた血管内皮細胞増殖因子受容体 3 (VEGFR3) によって視覚化されます。しかし、肝臓では、これらのマーカーの発現は LECs を制限されません。肝で肝開発、再生、および傷害19時近接 1 を広く表現し、LYVE1 と VEGFR3 は肝類洞内皮細胞18によって表されます。リンパ節で LECs は、分化 (CD) のクラスターとしてフローサイトメトリーを使用して識別されます CD45、CD31 +、ポドプラニン + (PDPN)16。しかし、このアプローチは CD45-CD31 陽性細胞は、血管内皮細胞をキャプチャし、肝臓の血管内皮細胞の優勢な人口が LSECs ので、肝臓で LECs を分離するも最小限。したがって、他のマーカーは、豊富な LSEC 人口からまれな LEC の人口を区別するために必要です。CD16/32 (成熟した LSECs18によって表される)、CD146 (一般的な血管内皮細胞マーカーは主に肝類洞内皮細胞20リンパでない式には少し肝洞様毛細血管内で表現内皮細胞21) 候補マーカーします。

したがって、我々 は分離とフローサイトメトリー用上記のマーカー、CD45、CD31、CD146、CD16/32、および PDPN を利用した肝臓内 LECs を可視化法を最適化されています。IV コラゲナーゼの使用、DNase 1 と単一細胞懸濁液に肝臓消化機械的分離について述べる。非実質細胞 (NPC) と細胞残屑を除去するために分離の iodixanol の密度勾配の使用についても述べる。最後に、複数のマーカーを使用して、我々 は優勢なマーカーとしての PDPN と肝臓から LECs を識別するために最適な流れ cytometry ゲーティング戦略を決定します。

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プロトコル

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ここで説明するすべての方法は、制度的動物ケアおよび使用委員会 (IACUC) コロラド大学アンシュッツ メディカル キャンパスのによって承認されています。

1 材料の準備

  1. DNase の 5 mg/mL の溶液を作るリン酸緩衝生理食塩水 (PBS) で。
  2. IV コラゲナーゼの 5,000 U/mL をクリックしての EHAA メディアに追加することによって消化の混合物を作る。
  3. 使用する前に 30 分の 37 ° C で分解混合物を温めます。
  4. 4.8% ウシ血清アルブミン (BSA) を追加することによって、分離バッファーを作るし、2 mM エチレンジアミン四酢酸 (EDTA) にハンクス平衡塩類溶液 (HBSS)。
  5. 塩化アンモニウム 100 mM、10 mM KHCO3、および 0.1 mM EDTA を蒸留 H2O を追加することによって赤血球 (RBC) 換散バッファーを作る

2. マウス肝臓からの単一細胞懸濁液の準備

  1. CO2と頚部転位マウスを安楽死させます。
  2. その毛皮をウェットを 70% エタノールでマウスをスプレーします。ピン マウスの解剖板に足。
  3. 解剖はさみを使って、肌皮膚 (約 1 mm) だけをカットするように注意しながら、肛門の上約 1 cm をカットします。歯の鉗子で体から皮膚を引っ張るし、皮膚と腹膜の間ハサミを挿入します。腹膜から皮膚を分離し、その後、首の切開から皮膚をカットするはさみを開きます。
  4. 各腕の下と各脚の上の 1 つのピンをしている郭清ボードに皮膚を固定します。腹膜嚢を引き上げ、首に向かって上向きにカットします。肝臓の葉をつかむし、胸骨のすぐ下をカットします。
    注: 免疫組織染色 (IHC) の肝臓のいずれかを使用する場合は、注意をすべき。
  5. 肝臓の周りカットしマウスから肝臓を削除、クリックしての EHAA メディアの 4 mL に置きます。
  6. メスを使用して、〜 1 mm の肝径部分をカットします。
  7. 消化液 500 μ L と DNase の 500 μ L を追加私は肝臓に (2 mg/mL)。
  8. 37 ° C で 30 分の肝臓を孵化させなさい15 分後に 5 mL のピペットを使用して液体を混ぜます。
  9. インキュベーションの 30 分後に 50 mL の円錐管に 100 μ m ストレーナー消化サンプルを転送します。
  10. 1 mL シリンジのプランジャーをフィルターを介して残りの部分を軽く押します。
  11. 5 mL の分離バッファーを持つフィルターを洗って、1 mL シリンジからプランジャーの背面にストレーナーを通して組織をゆっくりと。フィルターは分離バッファーの 25 の mL と洗浄されるまで、この手順を繰り返します。
  12. 400 x gで細胞を遠心分離機の 5 分は慎重に上清を離れて吸い出しなさい。
  13. RBC 換散バッファーの 4 mL にペレットを再懸濁します。セル 5 分間室温で孵化させなさい。
  14. 400 x gで 5 分間遠心分離バッファーの 10 ml セルを洗浄します。
  15. 完全に肝臓の数を決定する検定のセルをカウントします。
  16. 20 %iodixanol の 5 mL の細胞を再懸濁します、1 ml の PBS の層のそれら。
  17. 300 x gブレーキなしの 15 分で細胞を遠心します。
  18. PBS と、iodixanol のレイヤーを削除、新しい 50 mL の円錐管に 100 μ m フィルターを介してそれらを配置します。
  19. 400 x gで 5 分間遠心分離バッファーの 10 ml セルを洗浄します。
  20. 上澄みを廃棄し、2% ウシ胎児血清 (FBS) を 500 μ L の PBS で細胞を再懸濁します。

3. 肝臓から単一細胞のフローサイトメトリーによる解析

  1. 検定とトリパン ブルー色素排除を使用して実行可能なセルを測定する顕微鏡を使用してセルをカウントします。トリパン ブルーの 10 μ L に 10 μ L のセルを追加したり、すぐに診断に入れますや生きている細胞を顕微鏡で (青ではない)。その後、あたりの細胞数を計算します。
  2. 96 ウェル プレートの単一ウェルに残りの実質細胞の約 500 万の約数。
  3. 400 x gで 5 分で細胞を遠心します。
  4. 上澄みを廃棄し、2 %90 μ L の PBS で細胞を再懸濁します FBS。
  5. PDPN (1: 200) 2.4G2 やアンチスパイウェア-CD16/32 (レバレッジ) x 10 の 10 μ L で希釈した反 CD31 (レバレッジ)、アンチ CD146 (1: 200) 抗 CD45 (レバレッジ) を追加します。
    注:抗 CD16/32 標識抗体を使用した場合、Fc ブロック (2.4G2) が使用されていません。
  6. 正と負のゲートを設定する必要があるには、各色のアイソタイプ コントロール抗体 (FMO) しみマイナス蛍光があります。
  7. ライブと死んだ細胞を決定するには、生存率マーカー (例えば、ゴースト赤 780) で染色します。4 ° C、30 分で細胞を孵化させなさい。
  8. 2 %100 μ L の PBS のセルを洗浄して政府短期証券。
  9. 細胞の小さな因数を使って流れの cytometer のレーザーと補正の設定を調整します。それぞれの個々 の蛍光体、抗体なしで 1 つへの抗体と細胞を染色します。
    注:によって使用されている流れの cytometer で補償行列は、スペクトル重複除去に備えます。
  10. Cytometer プローブ上にサンプル チューブを置き、収集、すべてのイベントを記録します。

4. データ解析

  1. 側方散乱と前方散乱エリアを見て、「ライブ」の細胞生存率と粒度サイズ マーカー色素に基づくゲート。
  2. 次に、CD45 鮮やかなバイオレット 510 と CD31 PerCp Cy5.5、アイソタイプ コントロールと FMO を使って正と負の集団を決定する CD45-CD31 陽性細胞のゲートを使用します。
  3. 最後に、PDPN APC や CD16/32 FITC CD146 v450 を使用して、CD146-PDPN + または CD16/32 を取る-PDPN + 細胞は、再びアイソタイプ コントロールと FMO を使用して正と負の集団を決定します。これらの細胞は、LECs です。

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結果

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研究は、肝臓のリンパ管を分析は主に周波数と肝臓のリンパ管の直径を量的に免疫組織化学を使用しています。ただし、セルごとに LECs の評価または複数のマーカー、サイトカイン、ケモカイン、または転写因子の発現のためには、このメソッドはできません。したがって、我々 は尋ねたかどうか肝 LECs 肝臓から分離することができるし、フローサイトメトリーを使用して評価。Liberase DL (コラゲナーゼ私-II-と-dispase) と DNase 1 針14,16リンパ節組織の機械的分離と組み合わせてを使用してリンパ節 LECs を分離する前の作業を行った。したがって、肝組織に同じの消化力のプロトコルが使用された、または IV コラゲナーゼと DNase 1 を用いて肝22から免疫細胞分離のため、前に説明したとする密度勾配分離 (iodixanol) ステップと消化を続けて肝細胞を削除し、(

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ディスカッション

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免疫恒常性と調節で LECs の全体的な重要性は、最近光25に来てください。発表されたリンパの文献の多くは皮膚やリンパ節に焦点を当ててください。しかし、リンパ管は26体で発見され、したがって、異なる臓器の重要性の理解が必要です。セルごとに異なる表面マーカー、サイトカイン、ケモカイン、および転写因子などの細胞内タンパク質の同時発現を理解する肝で LECs を研究できる方法を紹介します。このメソッドは、表現型および肝臓で LECs の機能を評価し、健康と病気の間に今後の研究の役に立つでしょう。

肝臓で LECs の同定のためのハードルの 1 つは、他の細胞型と比較して比較的低い周波数です。肝細胞は、肝臓と流れの cytometer で肝臓を実行しているより少ない時間を必要とし、したがってより良い生存率を提供する前に、密度勾配 (iodixanol) を使用してこれらの細胞を削除の約 80% を構成します。LYVE1 + LSECs から肝臓の LYVE1 + LECs の人口を区別するために...

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開示事項

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著者が明らかに何もありません。

謝辞

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

著者は、このプロジェクトの金融支援のため消化管と肝臓生得免疫プログラムを感謝したいです。B.A.J.T. も R01 AI121209 によって資金を供給します。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
Clicks/EHAA mediaIrvine Scientific9195
Collagenase IVWorthington Biochemical CorporationLS004188
DNase IWorthington Biochemical corporationLS002145デオキシリボヌクレアーゼ 1
OptiPrepSigma AldrichD1556Density Gradient Medium
V450 anti mouse CD146(clone ME-9F1)BDbiosciences562232
FITC 抗マウス CD146 (クローン ME-9F1)Biolegend134706フルオレセインイソチオシアネート (FITC)
Pacific Blue 抗マウス CD31 (クローン 390)Biolegend102422
PerCp/Cy5.5 抗マウス CD31 (クローン 390)Biolegend102420ペリジニン-クロロフィルタンパク質-シアニン 5.5 (PerCP-Cy5.5)
APC 抗マウス PDPN (クローン 8.1.1)Biolegend127410アロフィコシアニン (APC), ポドプラニン (PDPN)
APC/Cy7 抗マウス CD45 (クローン 30-F11)Biolegend103116
Brilliant Violet 510 抗マウス CD45 (クローン 30-F11)Biolegend103138
FITC 抗マウス CD16/32 (クローン 93)Biolegend101306フルオレセインイソチオシアネート (FITC)
PerCp/Cy5.5 抗マウス CD16/32(クローン 93)Biolegend101324Peridinin-chlorophyll proteins-Cyanine 5.5 (PerCP-Cy5.5)
ghost red 780 viability dyeTONBO biosceinces3-0865-T100
APC syrian hamster IgG (clone SHG-1)Biolegened402102
PerCp/Cy5.5 rat IgG2a (clone RTK2758)Biolegend400531
FITC rat IgG2 (clone eBR2a)ebioscience1-4321-80
抗マウスLYVE1(クローン223322)R&D systemsFAB2125A
抗マウスサイトケラチン(クローンEPR17078)abcamab181598
抗マウスF4/80(クローンCl:A3-1)バイオ・ラッドMCA497
BSA (フラクションV)FischerBP1600-100ウシ血清アルブミン(BSA)
ヤギ血清Jackson Immunoresearch017-000-121
ロバジャクソン免疫研究017-000-121
EDTAVWRE177エチレンジアミン四酢酸 (EDTA) - RBC溶解バッファー用
塩化アンモニウムフィッシャーA687-500RBC溶解バッファー
重炭酸カリウムフィッシャーP184-500RBC溶解バッファー
メスフェザー2975#21
100 μFcトレーナーFischer22363549
2.4G2ATCCATCC HB-197FCブロック -ハイブリドーマ
から作られたリン酸緩衝生理食塩水(PBS)コーニング21-040-CV
ハンクス平衡塩溶液(HBSS)Gibco14185-052
シ胎児血清(FBS)アトランタの生物学的製剤S11550
96 ウェルプレートCorning3788
6 ウェルプレートCorning3506
50 mL 円錐形TrulineTR2004
15 mL 円錐形Falcon352196
1 mL ピペットチップUSA scientific1111-2721
200 µLピペットチップUSA scientific1110-1700
10 µL ピペットチップUSA scientific1111-3700
seriological 10 mL ピペットgreiner bio-one607107
セリロジカル 5 mL ピペットgreiner bio-one606107
セルインキュベーターフィッシャーHeracell 160i
BD FacsCanto II フローサイトメーターBD バイオサイエンス
臨床遠心分離機ベックマンコールターのモデルX-14R
血清用 用 ガンマ+細胞への非特異的結合を阻害する社内のm細胞ス / ウ

参考文献

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