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方法論記事

蛍光光度法による精子膜評価技術

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DOI:

10.3791/58622

⸱

2018年11月28日

 , 
1Animal Sperm Research Center, Department of Animal Sciences, Robert H. Smith Faculty of Agriculture, Food and Environment, Hebrew University of Jerusalem, 2Department of Animal Sciences, Robert H. Smith Faculty of Agriculture, Food and Environment, Hebrew University of Jerusalem

この記事について

サマリー

精子膜の完全性、精子の受精能力に関連付けられている携帯電話の機能を評価する方法論を紹介します。精子の膜の蛍光光度法による評価のための 3 つの技術について述べる: 高度な精子専用フローサイトメトリー、蛍光顕微鏡、特定の蛍光プローブの同時染色します。方法論を組み合わせることの紹介も。

要約

精子の質を記述する標準的な spermiograms 主、射精量、濃度、運動と進歩的な運動と精子形態の生存率など、生理学的および視覚的パラメーターに基づいています。しかし、これらの評価なしは精液の品質を予測するのに十分です。精子の生存率及び受精可能性の維持は、膜の完全性および細胞内の機能に依存することを考えるこれらのパラメーターの評価は、精子受精能力のより良い予測を可能にするかもしれない。ここでは、蛍光顕微鏡やフローのフローサイトメトリー解析と組み合わせて特定の蛍光プローブを用いた精子の質を評価する 3 つの可能な方法をについて説明します。解析評価 4', 6-diamidino-2-phenylindole を使用して細胞膜の整合性 (DAPI) とヨウ化 propidium (PI)、イソチオ シアン酸共役フルオレスセインを使用して整合性を先膜エンドウ凝集素 (FITC PSA) と5, 5', を使用してミトコンドリア膜の完全性 6、6'-テトラ-クロロ-1, 1', 3, 3'-tetraethylbenzimidazolyl carbocyanine ヨウ化 (JC-1)。また、これらの方法の組み合わせを提示します。例えば、アネキシン V の使用は PI 蛍光色素によりアポトーシスを評価およびアポトーシス精子 (アポトーシス インデックス) の割合を計算すると組み合わせます。精子膜の検討に基づいて、これらの方法論は精子の質を評価するために非常に有用と考えます。

概要

整合性と精子の膜の機能は、精子の生存率と潜在的な受精を示す要因の一部です。細胞膜は、細胞浸透圧平衡1維持、細胞内と細胞外のコンパートメント間の障壁として機能します。プラズマ膜の完全性への損傷を誘発するストレスが恒常性を損なう、生存率及び受精能力削減および細胞死を増やします。例えば、凍結保存は温度変化と浸透圧ストレス2の結果としてその原形質膜への損傷をによる精子の生存率を低減します。我々 は以前報告公開農薬アトラジン、その主要代謝物 diaminochlorotriazine カビ毒アフラトキシン B1 など食品由来汚染物質の低濃度に雄牛の精液精子生存率1,3 を減少させること.これは、破損した細胞膜と細胞の DNA に結合する PI との組み合わせで DAPI で二本鎖 DNA を標識によって決定されました。

精子先体反応 (AR) は、外側の精子膜と先酵素4、5の解放に終って覆う膜の融合を含まれます。これらは、透明帯の浸透とさらに6卵と精子の結合の重要なイベントです。したがって、先膜の完全性の評価は、精液性状と男性の生殖能力7,8,9評価に有用なパラメーターを構成します。いくつかの蛍光灯のテクニックは、精子の整合性、FITC PNA または FITC PSA8,10の検証に適しています。FITC PSA 染色1,3パターンを使用して私たちの以前の研究で、(i) の正確な定義をそのまま精子提供、(ii) 精子膜を破損しているし、(iii) 精子先体反応します。現在のレポートでは、精子専用フローサイトメトリーを使用して精子の状態を評価し、蛍光顕微鏡を使用して、結果を比較します。

ミトコンドリアは、多機能の細胞小器官で、他のもの、ATP 合成、活性酸素種の生産、カルシウム シグナル伝達とアポトーシスの関与です。生理学的な機能不全、男性と女性の不妊を含む変更されたミトコンドリア機能11に関連付けられます。精子のミトコンドリアは、midpiece に配置され、精子運動12で重要な役割を果たします。高のミトコンドリア膜電位 (ΔΨm) は通常の運動性と高い受精能力13に関連付けられてそれをよく受け入れられています。対照的に、低 ΔΨm は活性酸素種の高いレベルに関連付けられてし、受精率14を削減します。それにもかかわらず、様々 な環境物質、例えば内分泌かく乱物質を細胞ストレスを誘発でき、ΔΨm、過分極1,3フリーラジカルと最終的には、生産の増加の一時的な増加につながるアポトーシス15。蛍光プローブ 5, 5', 6, 6'-テトラ-クロロ-1, 1', 3, 3'-tetraethylbenzimidazolyl carbocyanine ヨウ化 (JC-1) により、たとえば、精子 ΔΨm1,3食中毒の毒素の影響を調べること。

生理学的および形態学的パラメーターに基づく標準の spermiograms は精液の品質を予測するのに十分ではありません。正確な方法は、精子の質を確保するため必要があります。ここで、精子の膜の評価に基づく精子の質を決定する 2 つの可能な方法を提供: 特定の蛍光プローブと蛍光顕微鏡、私たち研究1,3に記載されている同時 4 人染色最近既に他のユーザーによって使用されている当研究室において利用される高度な精子専用フローサイトメトリー、16,17,18。

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プロトコル

動物福祉のため 1994 イスラエル ガイドラインに従ってすべての実験を行った。牛の精子が人工授精と繁殖のための商業のイスラエルの会社によって提供されました。本研究では 11 の雄牛の射精を行った。

1. 精子サンプル準備

注:手順は、ロス研究室のプロトコル1,3に基づいています。

  1. 室温で 15 mL チューブに牛精液の約 1-6 mL を取得します。
  2. 精液の各 1 ml、6 mL の prewarmed (37 ° C) で NKM バッファー (110 mM NaCl、KCl、5 mM 20 mM モップ [3 N morphilino propanesulfonic 酸; pH 7.4]) を追加し、クリアまで上清は 600 x gで 8 分 1-2 回の遠心。
    注:場合は精子の濃度または最初のボリュームが非常に高い、最初の洗浄で 2 つの管に分割です。
  3. すぐに削除しクリアの上澄みを廃棄し、ペレットの上清を約 1 cm を残してください。
  4. 精子が泳ぐし、精子を 37 ° C で泳ぐことを許可するように 20-30 分を待っての表面積を増やすに 30 ° の角度で管を慎重に傾く
    注:濁度を見ることができます。
  5. 慎重にマイクロ ピペットを使用して、新しい 1.5 mL チューブに運動精子を含む上清の上部 1 mL を削除します。
  6. 37 ° C で使用するまで精子を維持します。
  7. ノイバウアー検定を使用して精子の数を推定します。
    注:別カウント商工会議所を代わりに、使用できますが、カウントが違います。
    1. 精子の動きを防ぐためには、10 mL の 15 mL チューブの二重蒸留水 (DDW) (1: 100 希釈) 運動性の精子の 100 μ L を希釈、軽く混ぜます。
    2. 検定と coverslip のそれぞれの側に 10 μ L のサンプルをロードします。不正確な精子数がありますので、チャンバー内の気泡を避けるためにことを確認します。
    3. 20 X 目的化合物顕微鏡下で観察します。
      注:診断上におけるグリッドを含む 9 の大きな正方形、各 1 mm2と、coverglass 0.1 mm の部屋の床の上にかかっています。したがって、中央のカウント領域にボリュームは 0.1 mm3または 0.1 μ L です。中央部、検定を含む 25 の中の正方形でそれぞれの中の正方形、単一行と小さな正方形 16。
    4. 4 中型角広場、中央広場で見つかった細胞の総数を数えます。高精度、2 つの部屋 (ノイバウアー検定の両側) をカウントし、細胞濃度を計算する平均を使用します。
    5. (カウント領域あたりのセル数を取得) する 5、(希釈サンプルの 1 ミリリットルあたりのセル数を取得) に 10,000 を得られる平均の数値を乗算することによって精子の数を計算します。希釈倍率 (1: 100) 得られた数を乗算します。
      注:たとえば、2 つの部屋の中央のカウント領域内 25 の中の正方形の 5 カウント精子の数の平均値は 150 ([152 + 148]/2)。したがって、商工会議所あたり (または 0.1 μ L あたり) の精子の平均数は 150 x 5 = 750 です。希釈サンプル (7,500,000) の 1 mL あたりのセル数を取得して、元の精液サンプルの mL あたり 75 × 107セルを取得する 100 (希釈倍率) を乗算する 10,000 で 750 を乗算します。

2. テクニック 1: 複数蛍光を用いた精子膜の同時評価プローブします。

注:精子膜 (プラズマ、先とミトコンドリア) Celeghini ら10、いくつかの変更と前述のように評価されました。450-490 nm の励起とトリプル フィルターを用いた 515 565 nm 発光とデジタル カメラと組み合わせて Epifluorescent 顕微鏡が使用されました。

  1. 貯蔵液を準備します。
    1. リン酸緩衝生理食塩水 (PBS) の 50 mL の DAPI の 5 mg を溶解して DAPI 原液 0.1 mg/mL を準備します。50 μ L の因数を準備し、-20 ° C で保存使用する前に 1:10 (実用的なソリューション; 10 μ G/ml) に PBS で原液を希釈します。
    2. 1 mL の PBS の FITC-PSA の 1 mg を溶解して FITC-PSA 原液を 1 mg/mL を準備します。50 μ L の因数を準備し、-20 ° C で保存使用する前に 1:10 (実用的なソリューション; 100 μ g/mL) で PBS で原液を希釈します。
    3. JC 1 ジメチルスルホキシド (DMSO) 1 mL に 1 mg を溶解して 1 mg/mL JC 1 原液を準備します。10 μ L の因数を準備し、-20 ° C で保存使用する前に 1:10 (実用的なソリューション; 0.1 mg/mL) に DMSO を原液を希釈します。
    4. PI の原液を準備するには、400 μ L の PBS (2.5 mg/mL を与える) で円周率の 10 mg を溶解します。店で + 4 ° C1:20 (実用的なソリューション; 0.125 mg/mL) で PBS で 1 ストックを希釈します。在庫ソリューションとして +4 ° C で保存します。
      注意: PI は、潜在的な変異原物質注意して処理する必要があります。染料は、安全かつ適用される規定に従って処分する必要があります。
  2. (ステップ 1.5) の運動性の精子の 133 μ L を新しい 1.5 mL チューブ (25 x 106精子/mL) に転送します。
    注:サンプル濃度が高い場合、必要な濃度を達成するために NKM バッファーで希釈してサンプルを泳ぐのサンプル濃度が低い場合 1,000 x gで 5 分でを水泳の後得られた上清を遠心分離機、上澄みの 0.5 mL を削除し、再度精子をカウントします。
  3. DAPI (作業ソリューション) の 17 μ L を追加し、37 ° C で 10 分間インキュベート
  4. 1,000 x gで 5 分で遠心し、上清を捨てます。
  5. ペレット、NKM バッファーの 100 μ L を追加します。
  6. FITC-PSA の 50 μ L、JC 1 の 2 μ L と PI (ソリューションの作業) の 3 μ L を追加し、37 ° C で 10 分間インキュベート
  7. 1,000 x gで 5 分遠心し、上清を除去します。
  8. ペレットに NKM バッファーの 40 μ L を追加し、ピペッティングで再懸濁します。
  9. スライド ガラス、塗抹標本、coverslip に 10 μ L のサンプルを転送します。
  10. トリプル フィルター、デジタル ・ カメラで装備と落射蛍光顕微鏡 (使用 40 × 対物) によるすぐに視覚化し、フィルターごとに個別に画像をキャプチャします。
    注:可視化フィルターの順序に意味はありません。
    1. 358 nm 励起と 461 放出 DAPI チャネルの下で視覚化する nm。
    2. 450-490 nm の励起と 515-565 nm 発光緑モノマーの FITC チャンネル下を視覚化します。
    3. 488 nm で励起と放射 590 赤集計の PI チャネルの下で視覚化する nm。
    4. JC 1 の下で視覚化 559 nm で 574-627 nm; の範囲で発光の励起と赤の集計JC 1 緑モノマー 488 nm と 500-535 nm の範囲における放射で励起。
  11. カメラのソフトウェアの「マージ」オプションを使用して、JPG/JPEG 形式でフィルターから受け取った 3 つの画像をマージします。
  12. 「ペイント」ツールでマージされた画像を開き、ブラシ オプションを使用して、カウント精子をマークします。
  13. 各プローブの蛍光に基づく精子を分類します。
    1. スライドごとの少なくとも 200 の精子を一般的に評価 — すべてのセルは青色 (DAPI)。
    2. 生存率を評価する死んだ細胞をカウントすることによって表示される紫色の (PI 【 レッド 】 + 【 ブルー 】 DAPI) と (死んだ細胞/総カウント セル x 100) 死んだ細胞の割合を計算します。
    3. 蛍光染色 (FITC-PSA) のパターンを使用して精子の状態を評価します。(そのまま、破損または反応精子細胞/総カウント セル x 100) 別のパターンの割合を計算します。
      注:破損した先の膜のように完全に汚された、緑の精子キャップ。反応先膜を示します残留緑赤道または上部の汚損;そのまま先膜を含む細胞の先領域の任意の緑色染色が起きません。
    4. ΔΨm を評価するには、特徴的な赤いステンド グラス midpiece を表わす高 ΔΨm と精子と緑色に塗られた midpiece を表わす低 ΔΨm と精子。赤と緑の midpieces を個別と (赤/緑) の比率を計算する.

3. すぐに使用できるキットとフローサイトメトリー精子膜テクニック #2: 評価

注:使える - フロー フローサイトメトリー キットを各ウェルに凍結乾燥螢光色素を含む膜の整合性、ミトコンドリアの膜電位と先膜の完全性の評価を行った。プロシージャは、いくつかの変更とメーカーによると行った。

  1. 膜性評価法
    1. 生存率と濃度のキット (PI と SYbr14) のパッケージから井戸の必要な数を取る、作業ベースと柔軟なふた付きカバーに転送 (光から保護する)。
    2. 199 μ L/ウェル フローサイトメトリーのバッファリングされたソリューションを追加します。
    3. 57 x 106/mL (ウェルあたり 57,000 細胞) で均質な精液の 1 μ L を追加し、ピペッティングによる均質化します。
    4. 黒ふた付きプレートをカバーします。
    5. 光から保護されている 37 ° C で 10 分間インキュベートします。
    6. 流れの cytometer を通じて設定 '生存' のサンプルを実行します。
  2. ミトコンドリアの膜電位
    1. ミトコンドリア活性キット (JC-1) のパッケージから井戸の適切な数を取る、作業ベースと柔軟なふた付きカバーに転送 (光から保護する)。
    2. ウェルあたりエタノールの 10 μ L を追加し、井戸の内で現在の粉を再懸濁しますにピペットします。
    3. ウェルあたり 190 μ L の PBS を追加し、ピペッティングにより均質化します。
    4. 57 x 106/mL (ウェルあたり 50,000 セル) で均質な精液の 0.75 μ L を追加し、ピペッティングにより均質化します。
    5. 黒ふた付きプレートをカバーします。
    6. 光から保護されている 37 ° C で 30 分間インキュベートします。
    7. 設定 ʽmitochondrial 活動の流れの cytometer を介してサンプルを実行 '。
  3. 先膜の完全性
    注:3 精子カテゴリ (そのまま精子、精子先体反応と破損した精子) の評価が可能で FITC-PSA 染色 (テクニック #1 を見る)。フローサイト ・生存精子整合性キット (PI と FITC-PNA) を使用すると、精子は、これらの 3 つのカテゴリーに分かれています。
    1. 生存率・精子の整合性キットのパッケージから井戸の必要な数を取る、作業ベースと柔軟なふた付きカバーに転送 (光から保護する)。
    2. 200 μ L/ウェル フローサイトメトリーのバッファリングされたソリューションに追加します。
    3. 57 x 106/mL (ウェルあたり 40,000 セル) で均質な精液の 0.7 μ L を追加し、ピペッティングによる均質化します。
    4. 黒ふた付きプレートをカバーします。
    5. 光から保護されている 37 ° C で 45 分間インキュベートします。
    6. 設定 ʽInCyte の流れの cytometer を介してサンプルを実行 '。
    7. 蛍光強度に応じて 3 つのマーカー領域をゲーティングによる結果のヒストグラムを分析、残留精子 (R2) の部分を染色と細胞低蛍光そのまま、無染色の精子 (R1) を無視できる、低蛍光セルを表すと高い蛍光セル中断精子 (R3)。
      注:(R1、R2、R3) の 3 つの領域を作成するために楽器ユーザー ガイド 』 の「他のモジュールを使用して取得したファイルの分析」セクションを使用します。

4. テクニック 3: 蛍光プローブとフローサイトメトリーを用いた精子膜の評価

注:アネキシン V の使用は、PI 蛍光色素によりアポトーシスを評価およびアポトーシス精子 (アポトーシス インデックス) の割合を計算すると組み合わせます。

  1. アネキシン V 結合バッファー原液 (アネキシン V 結合バッファー 20 x 9.5 ml の滅菌蒸留水の貯蔵液の希釈 500 μ L) x 20 x 1 を準備します。
  2. 1.7 のセクションで説明されているようにノイバウアー検定を使用して精子の数を推定します。
  3. アネキシン V 結合バッファーと 300 x gで 10 分間遠心 x 1 の 1 mL で 106精子を洗浄します。
  4. 上清を完全に吸引します。
  5. アネキシン V 結合バッファー x 1 の 100 μ L にペレットを再懸濁します。
  6. FITC 標識アネキシン V の 10 μ L を追加します。
  7. よく混合し、室温で暗闇の中で 15 分間インキュベートします。
  8. 300 × g 10 分間で 1 mL あたり 10 の6セルおよび遠心分離機の x、アネキシン V の結合バッファー 1 を追加することによって精子を洗います。
  9. 上清を完全に吸引します。
  10. 1 x アネキシン V 結合バッファー 106合計セルごとの 500 μ L の細胞ペレットを再懸濁します。
  11. 流れの cytometer で分析の前にすぐに 1 μ g/mL PI を追加します。
  12. ʽInCyte on 流れの cytometer を介してサンプルを実行 '。

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結果

精子膜 (プラズマ、先とミトコンドリア)図 1番組同時蛍光光度法による評価は、PI、DAPI、FITC PSA と JC 1 を使用します。4 つの蛍光プローブの同時染色を用いた精子膜の評価により、たとえば、各カテゴリにおける精子の割合を評価-ライブ対死者;高対低 ΔΨm;そのまま対。精子を破損した — 各精子を同時に。

図 2は、膜評価蛍光プローブを用いた精子の結果を示します。少なくとも 80% の運動精子を含む精液だけは実験で使用されました。ブルあたり少なくとも 200 細胞を調べた。膜の完全性の面で精子サンプルの質の違いを評価することが可能だった。たとえば、雄牛号 7 の射精があった割合が比較的低い精子先体と高いミトコンドリア膜電位、牛第 1 の射精に比べて死んだ細胞の擬似で...

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ディスカッション

精子の受精の可能性は、その品質を反映した複数の要因に依存します。精子の高濃度と徐々 に高運動性の精子の割合が高い高品質の精液を考慮可能性があります。それにもかかわらず、このような評価、アカウントにとらない他の携帯電話と機能パラメーター。'卓上' マイクロキャピ ラリー流れの cytometer の使用はで先ほど他17本 (法 #3) 蛍光プローブを用いた様々 なの精子構造の評価に容易に適応することができます。たとえば、精子の先体の整合性は非常に成功した自然受精の発生の重要な先の状態の正確な評価を保証するためと。このような評価を蛍光染色 (FITC PSA、FITC PNA、すなわち、技術 #1、前述のよう) のパターンを使用して精子の状態の分類が簡単に実行できる1,3。特に、それはそのまま精子と精子の割合を決定する非常に重要な (すなわち、無染色の精子を展示) 破損した精子とのそれらを基準にしています。破損した精子で後者は、精子に敬意と膜の損傷精子先体小胞の膜を通して流れ込...

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開示事項

著者は、利害の対立がないことを宣言します。

謝辞

著者は、彼らの助けと協力、計測器のセットアップとトレーニングの支援の李娜 (IMV 技術、l ' aigle、フランス) さんの「シオン」人工授精と繁殖 (Hafetz、イスラエル共和国) のためのイスラエルの会社を感謝したいです。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
NaClSigmaS5886
KClSigmaP5405
MOPS [3-N-モルフィリノプロパンスルホン酸]SigmaM1254
PBSSigmaP5493
DMSOSigmaD2438
エタノール絶対シグマ64-17-5
血球計算盤ノイバウアードイツ血球計算盤
DAPI(4',6-ジアミジノ-2-フェニルインドール)シグマD9542蛍光プローブ
PI(ヨウ化プロピジウム)シグマP4170蛍光プローブ
FITC-PSA(フルオレセインイソチオシアネート共役Pisum sativum凝集素)シグマL0770蛍光プローブ
JC-1 (5,5',6,6'-tetra-chloro-1,1',3,3'-tetraethylbenzimidazolyl carbocyanine iodide)ENZOBiochem, New York, NY, USAENZ52304蛍光プローブ
Annexin V conjugated to FITCMACS, Miltenyi Biotec130-093-060蛍光プローブ
Annexin V binding buffer 20x stock solutionMACS, Miltenyi Biotec130-092-820buffer
Nikon Eclipse,TE-2000-uニコン、東京、日本倒立蛍光顕微鏡
Nis Elementsニコン、東京、日本ソフトウェア
ニコン DXM1200Fニコン、東京、日本デジタルカメラ
Guava EasyCyte PlusIMV Technologies, L'Aigle, Francemicrocapillary sperm flow
cytometer CytoSoftGuava Technologies Inc.、米国カリフォルニア州ヘイワード。IMV Technologiesソフトウェア
サイトメトリー用緩衝液IMV Technologies, L'Aigle, France023862buffer
Viability and concentration kitIMV Technologies, L'Aigle, France生存率評価用024708キット
ミトコンドリア活性キットIMV Technologies, L'Aigle, Franceミトコンドリア活性用024864キットassessment
Viability & acrosome integrity kitIMV Technologies, L'Aigle, France025293kit for acrosome integrity assessment
JMP-13SAS Institute Inc., 2004, ary, NC, USAsoftware
Bovine sperm"SION", Israeli company for artificial insemination and dreeding, Hafetz-Haim, Israel
が配布

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