3 D ダイナミック文化システムの多層間葉系幹細胞シートの構築

Summary

この資料では、プロパティが有利な幹細胞幹細胞の多層シートを構築するため効率的かつ実行可能な方法を提供します。

Abstract

幹細胞療法は有望なを示す将来負傷した臓器や組織を再生・細胞シート技術は低細胞保存とターゲット ゾーン内で貧しい人々 の生存を改善するために開発されました。ただし、体外施工中に幹細胞の活性を維持して細胞シート内細胞量の増加のためのソリューションが急務します。ここでは、このプロトコルは有利な幹細胞の生物活性と最適な操作性と多層の細胞シートを構築する手法を提案します。細胞シート足場として₂ (PLA₂) decellularization メソッド ホスホリパーゼによって脱ブタの心膜 (DPP) を用意し、ラット骨髄間葉系幹細胞 (BMSCs) が分離されシード細胞として展開されます。一時的な多層細胞シート構造は、RAD16 を使用して作成されます-私ペプチド ハイドロゲルです。最後に、三次元 (3 D) の構造を安定させるために動的な灌流システムと細胞シートを培養し、48 時間培養の in vitro細胞シートを得ることができた。このプロトコルは、多層の細胞シートを構築するための効率的かつ実行可能な方法を提供し、細胞シートが将来的に有利な幹細胞療法製品として開発される可能性があります。

Introduction

幹細胞療法は多くの病気の効果的な治療法として報告されています。ただし、低細胞保存とターゲット ゾーン内で貧しい人々 の生存伝統的な幹細胞の注入の後の重要な問題に残る。この問題を解決するためには、組織工学科学者は、細胞シート技術を開発しました。そのままの細胞外マトリックスを持つ単層細胞シートまず温度応答文化料理¹を使用して調製し、, そのフォロー アップ研究幹細胞の保存と、梗塞内生存の重要な改善を報告しました。エリア^2,3。方法のうちは、多層の細胞シートを構築する細胞の生存率と細胞シート治療効果^3,4を改善するための効果的な戦略として報告されています。以来、科学者は細胞量、幹細胞プロパティ、および細胞シートの機械的性質を高めるために別の細胞シート工法の開発に働いています。これまでのところ、細胞シートの特定の種類を構築し、心筋梗塞の⁵、軟骨損傷⁶治療の研究、皮膚傷⁷。

移植前に幹細胞の生物活性を示した負傷した組織再生に新たな影響を及ぼす、異なる細胞シートの構築戦略は、幹細胞の異なる効果を持ちます。一方、コンフルエントの細胞シートはのみ高密度の幹細胞で構成され、重なり単層細胞シート⁸または磁気ティッシュ エンジニア リング技術⁹を使用して、自然な細胞外マトリックスを取得できます。その一方で、研究者は、十分な機械的強度を提供し、細胞成長^10、11,12、低細胞播種密度栄養を確保するための許可をサポートする異なる足場を開発しました。供給。ただし、これらのアプローチにもかかわらず多層細胞シート構造内で低効率の高い栄養供給は体外工事主要な関心事を残ります。したがって、効率的かつ実行可能な細胞シート施工システムは緊急に必要です。

このプロトコルでは、multilayeredmesenchymal 幹細胞 (MSC) の細胞シートを準備する手順について説明します。この工法では、細胞シートの機械的強度は、DPP によって提供されます。この足場を基に、3 D の細胞構造を素早く構築できます RAD16 で-私ペプチド ハイドロゲルと動的な灌流システム、3 D の細胞シート構造の安定化し、十分な栄養を提供するために、多層の細胞シートを文化に使用セルの供給。このシステムを使用すると、多層 BMSC シート準備ができましたし、ラット心筋梗塞モデル¹³の最適な治療効果を展示します。

Protocol

すべての幹細胞および動物実験プロシージャがケアと実験動物の使用のため全国のガイドの倫理的なガイドラインに従って実施、済南大学動物ケアおよび使用委員会 (中国・広州) によって承認します。

1. PLA₂ Decellularization と DPP 足場の準備方法¹⁴

注: は、PLA₂ decellularization 法の模式図を図 1 aを参照してください。

1. 200 U/mL PLA₂溶液 100 mL を準備します。198 mL 炭酸緩衝液に 0.5 g デオキシ コール酸ナトリウムと PLA₂ 2 mL を追加します。このソリューションは、その準備の後 24 h 内で使用する必要があります。
2. 食肉処理場から新鮮なブタの心膜 (FPP) を取得し、1 時間以内に検査室に返します。
   注: FPP は、輸送中に 4 ° C で保存する必要があります。手順 1.2 1.10 は、サーモスタット制御の水浴の連続振動で行われなければなりません。
3. 徹底的に洗って 200 ml の 10 ° Cfor 10 分で 500 mL ビーカーに 1% ペニシリン-ストレプトマイシンを含むリン酸緩衝液 (PBS) の FPP は、この手順の 2 倍を繰り返します。
4. FPP を 2 つのレイヤーに分割し、鉗子、はさみと脂肪組織を削除します。
   注意: 50 mL の PBS を追加することによりウェット FPP 20 分中脂肪の除去。
5. はさみで 10 × 10 cm²個セットに、FPP を形状します。10 分を繰り返します 2 倍の 10 ° C で 500 mL ビーカーに 1% ペニシリン-ストレプトマイシンを含む炭酸塩緩衝液 (CBS) の 200 mL の FPP を洗います。
6. 純粋な水に、FPP を転送し、12 h 10 ° C で浸します。
7. 200 U/mL PLA₂と 6 h 37 ° C で 0.5% (w/v) ナトリウム デオキシ コール酸溶液を含む CBS の 50 mL で 10 × 10 cm²の試料を浸します。
8. このステップ 2 x 10 の ° c で 10 分間繰り返し 1% ペニシリン-ストレプトマイシンを含む CBS でサンプルを洗ってください。
9. 200 U/mL PLA₂と 37 ° c 2 h 0.5% (w/v) ナトリウム デオキシ コール酸溶液を含む CBS の 50 mL で各サンプルを浸します。
10. サンプルで洗う 2 h. 繰り返し 10 ° C で 1% ペニシリン-ストレプトマイシンを含む CBS 10 x に対してこの手順を少なくとも。平板のサンプルを置き、恒温オーブン 55 ° C で一定重量まで乾燥
    注: サンプルは、完全に乾燥する必要があります。繰り返すし、DPP サンプル 10 分毎の重量を量る 3 x または重量まで変更されなく。
11. 10.5 mm 径の円に、トレフィンで各 DPP サンプルを形状します。滅菌密封された袋の各 DPP をパックします。
12. Γ 線照射 (25 kGy) DPP サンプルを滅菌します。使用前に 4 ° C で DPP サンプルを格納されます。
    注意: すべてのサンプルが 4 ° C で最大 6 ヶ月間保存することができます。

2 セルの準備シート工事

1. オートクレーブの 30 分、1.5 mL 遠心チューブ、鉗子を含む歯の鉗子、はさみ、黒基地 (組織キャリア成分) と白テンション リング (組織キャリア成分) すべての楽器と 121 ° c 組織キャリア成分。
2. 無菌 10% ショ糖溶液の 20 mL を準備します。ショ糖の 2 g の重量し、超純水の 18 mL のショ糖を分解します。オートクレーブ 121 ° C、30 分または 0.22 μ m のフィルターとフィルター ソリューションで 10% ショ糖液。
3. オートクレーブ、ガスを含む、30 分の 121 ° C で動的な灌流システム デバイス交換結合管灌流培養容器、500 mL 瓶装置。
4. オートクレーブ器と組織のキャリア成分を準備します。培養皿で組織のキャリアの黒いベース部分を置きます。
5. 乾燥 DPP 足場をピックアップし、黒ベースの中心にそれを置きます。DPP 足場に白いテンション リングを置いて、組織のキャリアでそれを修正します。
   注意: 必ず足場は組織のキャリアに完全固定、黒ベースと白のテンション リング間のギャップはありません。そうでない場合は、別の組織のキャリアと足場を再度修正します。
6. 水分補給のための DPP の足場に培養液 100 μ L を追加します。
   注: 組織のキャリアでも足場が固定されていない場合、培養培地は培養皿を潜入します。
7. 37 ° C の定温器に足場を入れて、15 分間浸すことができます。

3. 着工準備中のセルの細胞シート

メモ: このプロトコルは、100 mm ディッシュを使用して細胞培養.多層セル構造の構造の模式図を図 1 bを参照してください。

1. BMSCs¹³を分離します。
   注: このメソッドは多層 MSC 細胞シートを構築するために設計されています。ラット BMSCs はこのプロトコルで使用されます。BMSCs 全体骨髄付着性メソッドを使用して分離、BMSCs 拡大培養細胞の十分な量を取得します。
   1. オートクレーブ 121 ° C で鉗子、歯の鉗子、はさみなど、30 分間の楽器。2 mL 注射器とボーマン培 (ダルベッコ改変イーグルの 1% ペニシリン-ストレプトマイシンや 1% グルタミン 10% 牛胎児血清中 [DMEM]) を準備します。
   2. 頚椎脱臼で 3 週齢雄 Sprague-dawley (SD) ラットを安楽死させます。5 分間で 75% アルコール溶液の 100 mL で動物を浸します。
   3. ビーカーの動物を取るし、操作テーブルの上になりやすい配置です。はさみ鉗子と動物の背中の皮膚を切開します。太ももの大腿骨を公開する皮膚や筋肉組織を分離します。
   4. 太ももの大腿骨を隔離し、30 mL の PBS 50 mL 遠心管中でそれを置きます。1 つの管に 2 つの太ももの大腿骨を配置します。渦遠心管組織を徹底的に洗浄します。2 x この手順を繰り返します。
   5. に対する大腿骨の両端をハサミでカットし、骨髄腔を公開します。
   6. BMSC 培養液 2 mL を注射器で吸引します。骨髄腔に針を挿入、骨髄培養液を洗い流します。100 mm ディッシュ用 1 つにすべての 2 つの太ももの大腿骨をフラッシュします。
   7. 各 100 mm 培養皿の培養皿で培養液 2 mL を追加します。37 ° C の定温器に 72 時間静置培養培養皿を置きます。
   8. インキュベーターから培養皿を取り出してください。6 ml の新鮮な培養液の上清を交換してください。
   9. 顕微鏡下でプライマリ BMSCs を観察します。次に、すべての 5-7 d、BMSCs の通路します。
2. インキュベーター外細胞を取る。顕微鏡で細胞を観察し、細胞シート工法の適切なセルを選択します。BMSCs 80%-90% の合流点に達すると、シードのセルとセルを選択できます。
3. 培養培地を培養皿から削除します。2 ml の温かい PBS のセルは水洗い。すべての PBS を培養皿から外し、遺体を確かに液体。皿に 0.25% トリプシン (または別の分離ソリューション) の 2 mL を追加し、3 分の 37 ° C で孵化させなさい。
4. 2 mL の培養液を追加することによってトリプシンの効果を停止し、水洗いしてお皿からセル。新しい 15 mL 遠心チューブに細胞懸濁液を転送します。Centrifugate 225 x gで 5 分で細胞。
5. 上澄みを除去します。3 ml の 10% (w/v) ショ糖液の細胞を再懸濁します。
   メモ: 10% (w/v) ショ糖液は、次の手順で均一なセル ヒドロゲル混合物を得るために細胞を洗浄する使用されます。
6. 細胞懸濁液の 10 μ L を吸引し、診断のセル数をカウントします。次のステップに必要な量を計算します。1 つの細胞シート 300 万 BMSCs が使用されます。
7. 300 万セルを抽出し、新しい 15 mL 遠心管にそれらを転送します。225 x gで 5 分で細胞を遠心します。
8. 上澄みを除去します。1 ml の 10% (w/v) ショ糖液の細胞を再懸濁します。1.5 mL 遠心チューブに細胞懸濁液を転送します。
   注: 1.5 mL 遠心管を使用する携帯ハイドロゲルの混合物を準備するため有益です。
9. 5 分は完全に上澄みを除去し、セル堆積物を得るために 260 xgで細胞を遠心分離機します。

4 作成、BMSCs と、RAD16-私ペプチド ヒドロゲル混合物

注: は、多層の細胞構造の構造の模式図を図 1 bを参照してください。

1. 1.5 mL 遠心チューブに 10% (w/v) ショ糖溶液 20 μ L を追加します。軽く、BMSCs 再懸濁します、均一な懸濁液を得る。
   注: は、再懸濁の中に任意の気泡を生成しません。
2. RAD16 の 20 μ L を追加-私懸濁液の上部にペプチド ハイドロゲルです。軽くかき混ぜ、RAD16-私にピペット チップ ペプチドと細胞懸濁液。ときに細胞懸濁液とゲルが一緒に混合される、混合物を数回の優しくピペットします。
3. 組織のキャリアから DPP 足場を取り出し、そっとピペット チップで培養液を吸引します。
   注: は、DPP の足場が完全に携帯ハイドロゲルの混合物を追加する前にステータス復元されるを確認します。
4. 混合物を吸引し、均等に DPP 足場にそれを追加します。
   注: 混合物の総量は約なる 40-50 μ L。足場の外側に、中心から一度に混合物 10 μ L を追加することをお勧めします。
5. 組織のキャリアの下部に培養液 1 mL を追加します。5 分の 37 ° C の定温器で細胞シートを置きます。
6. インキュベーターから細胞シートを取り出してください。優しく培養皿で培養液 4 mL を追加し、細胞シートを浸します。静置培養の 2 h の 37 ° C の定温器で細胞シートを置きます。

5 します動的培養系を用いた 3次元多層細胞シートの体外培養。

注: 3 D の動的システムの概略図を図 1を参照してください。

1. 蠕動性ポンプ、ガス交換装置、500 mL の瓶、灌流培養コンテナー結合管など動的な灌流システムを準備します。図 2に示すように、動的な灌流システムを組み立てます。
2. 滅菌瓶に 200 mL の培養液を追加します。商工会議所文化容器に細胞シートを挿入します。
   注: は、細胞シートの上面の方向に注意を払います。
3. 組織コンテナー内培養液 3 mL を加えるし、コンテナーを閉じます。インキュベーターに動的な灌流システムを入れ、ポンプを起動します。48 h の血流の動的システムの細胞シート 8 mL/分文化で蠕動運動型ポンプの流量を設定します。

6. 多層 MSC 細胞シートの取得

1. オートクレーブ 121 ° c 30 分、歯の鉗子、鉗子、1.5 mL 遠心管を含む組織キャリア成分器具。
2. コンテナーに培養液の供給を停止するガラス瓶から入力ダクトを引き出します。
   メモ: は、文化容器が空のときに蠕動性ポンプを停止します。
3. 文化容器から細胞シートを取り出し、培養皿にそれを置きます。
4. 組織のキャリアを固定し、黒ベースから白テンション リングを分離する別の歯の鉗子を使用して 1 つの鉗子を使用します。最後に、多層 BMSCs 細胞シートを取得します。
5. 短い保全の各細胞シートは 1.5 mL 遠心チューブに鉗子で転送できます。遠心管の内壁をアタッチする DPP 足場と細胞シートを広める必要がありますアウト遠心管中の可能な限り。
6. 優しく細胞シートを浸漬する遠心管内培養液 1 mL を追加します。遠心チューブのキャップを閉じ、4 ° C で細胞シートを保管
   注: 細胞シートを移植したり分析したりできる、できるだけ早く。4 時間の内で細胞シートを使用することをお勧めします。

Results

多層幹細胞シート工法の模式図は、図 1に表示されます。PLA₂ decellularization 法による細胞シート培養足場を準備する最初のステップです。足場に基づき、一時 3 D セル構造は、RAD16 1 ペプチド ハイドロゲルと幹細胞を混合することによって構築されます。有利な幹細胞の生物活性と最適な強度、多層の細胞シートを取得するために動的な灌流システムで細胞シートを培養します。動的栄養供給のもとで幹細胞が増殖し、多層の細胞シート内のセル連絡先が許可され、~ 24-72、最終的な安定した多層細胞シート製品を得ることができる-時間栽培。

この場合、細胞シート培養足場 DPP は、PLA₂ decellularization メソッドによって作成されました。乾燥 DPP の外観はフラット、滑らかな、半透明 (

Discussion

この議定書は、多層 MSC シートを構築するための効率的な方法を報告します。この細胞シートは、最適な強度、高い細胞播種密度および有利な幹細胞活性を展示します。BMSCs を例として使用して、3 D の細胞の構造がすぐに RAD16 で構築されて-私ペプチド ハイドロゲルです。動的な灌流システムで培養されて後、多層 BMSC のシートは正常に取得し、BMSCs 高幹細胞マーカー発現を維持します。

プロトコルの重要なステップは、一時的な多層セル構造を構築します。RAD16-私は商業ハイドロゲル ペプチドを 1% のアミノ酸および 99% の水で構成されています。いくつかの研究は、このペプチド ハイドロゲルが自然の ECM 環境をまねることができる、幹細胞の増殖と生存^15,16,17のために有益に報告しました。この議定書で、300 万 MSC 懸濁液 (10% ショ糖溶液 20 μ L) は RAD16...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
ホスホリパーゼ A2	Sigma-Aldrich	P6534
デオキシコール酸ナトリウム	Sigma-Aldrich	D6750-100G
リン酸緩衝液	Gibco BRL	89033
ペニシリン ストレプトマイシン/アンホテリシン	Gibco BRL	15640055
バッファー 重炭酸塩	Sigma-Aldrich	C3041
テーブル濃縮器	Changzhou Aohua Instrument Co.
ダルベッコ モディファイド イーグル ミディアム (DMEM)	Corning Cellgro	10-014-CVR
南米産ウシ胎児血清	Gibco BRL	10270-106/P30-3302
L-グルタミン	Corning Cellgro	25-005-CI
0.25% トリプシン/2.21 mM EDTA	Corning Cellgro	25-053-CI
バイオセーフティキャビネット	エスコ、シンガポール	AC2-2S1
恒温インキュベーター	エスコ、シンガポール	CLS-170B-8
遠心分離管	コーニング	430790
EPチューブ	Axygen	31617934
遠心機	TOMOS	1-16R
ショ糖	シグマ-アルドリッチ	S9378-500G
プラマトリックス	BD	354250
動的灌流培養システム	Minucells and Minutissue	D-93077
蠕動ポンプ	Ismatec	IPC N8
ポンプ チューブ	Ismatec	Nr.1306
MINUSHEET 1300	レーゲンスブルク		のティッシュキャリアコンポーネント
MINUSHEET	レーゲンスブルク		ダイナミック灌流システム
MINUSHEET 0006	レーゲンスブルク		ガス交換装置
MINUSHEET 0002	レーゲンスブルク		500mL ガラス瓶
MINUSHEET 1301			灌流培養容器