ここでは、新しい蛍光染色ポリアクリルアミドゲルの総蛋白質の検出の技術をまとめた詳細なプロトコルについて述べる。プロトコルを利用して Ag+を検出する銀イオン固有蛍光ターンオン プローブ-タンパク質複合体、伝統的な発色銀汚れの特定の制限を排除します。
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この記事について
サマリー
要約
銀染色は、ポリアクリルアミドゲル ナトリウム dodecyl 硫酸塩-ポリアクリルアミドゲル電気泳動 (SDS-PAGE) を次の蛋白質バンドの視覚化に広く用いられる比色法です。古典的な銀汚れ汚損、不良タンパク質の回収、低再現性、定量化、および質量分析法 (MS) と限られた互換性のダイナミック レンジの狭い線形高の背景など、いくつかの欠点があります。今、 TPE 4TA、Ag+蛍光発生プローブの使用と、蛍光銀染色ポリアクリルアミドゲルで総たんぱく可視化法を開発しました。この新しい汚れは、伝統的な銀汚れで面倒な銀削減ステップを回避できます。また、蛍光銀染色は良い再現性、感度、およびタンパク質検出後、有用かつ実用的な蛋白質ゲル染色で線形の数量を示します。
概要
多くの染色法がされている蛋白質ゲルの電気泳動、たとえば Coomassie 鮮やかな青、銀染色、蛍光など色の染料を使用して視覚化するために使用または放射性1,2,を表示3,4. 簡易かつ安価な試薬を必要とする蛋白質の検出のための最も敏感なテクニックの一つである銀製の汚損します。2 つの主要な家族に分類できます: 銀製硝酸塩、アンモニア銀染色染色5,6。アルカリのアンモニア銀法で銀ジアミン複合体はアンモニア、水酸化ナトリウムの生産、酸性ホルムアルデヒド溶液を用いた開発中に金属銀に減少します。汚れは、基本的な蛋白質に効率的に対応できる酸性および中性蛋白質のためパフォーマンスの低下を示していますは、さらに、古典的なグリシンやタウリン電気泳動システムに限定。比較では、硝酸銀の汚れは蛋白質に銀イオンの高い生体親和性を悪用する、主なスルフヒとカルボキシル基側鎖からグループ化しより効率的に酸性タンパク質を染色する傾向がある7。ブラウン-ダーク色を視覚化するを構築金属の銀粒子に銀イオンを抑える銀イオン結合後、現像液 (通常金属炭酸塩溶液におけるホルムアルデヒドおよびナトリウム チオ硫酸製) が適用される、タンパク質のバンド。
銀染色は 1970 年代8の開発以来その汎用性と高感度の知られているがメソッド頻繁にトリッキーないわ。銀染色方法はステップの時間制限があるし、低再現性を示します。銀染色の色は、通常ない均一でコントロールするは難しいが、削減の手順に依存しているので銀染色定量的方法ではありません、したがって、ゲルの比較研究とタンパク質定量9には推奨されません。感度の最適化方法は、アルデヒド10を染色より均一をまた提供することができますを利用できます。ただし、アルデヒドによるタンパク質の架橋によりさらに下流解析を犠牲になります。高速プロトコルは主を組み合わせるか、再現性と染色5の均一性を損なうこと、時間を短縮するには手順を短きます。その結果、多数の銀染色染色、特定の要件に合わせて最適化された各蛋白質ゲル内の亜種があります。たとえば、シンプルさ、感度、またはペプチドの回収率下流の分析。これらの属性は、互いに影響をあります、1 つのプロトコルのすべての要件を満たすは難しいことができます。
この作品は、新しい蛍光銀染色法電気泳動法でタンパク質検出用を紹介します。この方法で銀含浸タンパク質11を視覚化すると銀イオン、 TPE 4TA (図 1)、蛍光プローブを使用します。TPE 4TA凝集誘起発光 (AIE) 原則として設計されています。水溶液に溶解したとき、非発光ですが銀イオンの存在下で高発光性です。開発ステップ蛍光発色における伝統的な銀汚れに置き換える、蛍光銀法により総蛋白減少の背景を持つ堅牢な染色します。
さらに、蛍光の銀製の汚れはタンパク質の定量化は, 広く使用される可視ルビー汚れに匹敵する、伝統的な銀汚れで達成可能でない良い動的線形範囲を示した。紫外線ランプで一般的に使用されるゲルのドキュメント システムで視覚化されるゲル (励起波長: 302/365 nm チャンネル; 排出量: ~ 490-530 nm) 多くの生物のラボで。
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プロトコル
1. ゲルの調製
注: デモ SDS ページ12後まもなく染色ゲルを準備する標準プロトコルに従います。簡単に言えば、次の手順は、サンプルの準備を記述する、ゲルの電気泳動。
- 4-12% ビス トリス タンパク質ゲル (1 mm、15 ウェル) と SDS ページの実行 2-(n-morpholino) 満ちてミニ ゲル槽を用いた ethanesulfonic 酸 (MES) バッファー。
- 蒸留水、リチウム dodecyl 硫酸塩 (LDS) バッファー、サンプル低減剤の混合試料を希釈します。
- 通常の在庫量 (5 μ L) と (8192 x 2 x から 13 希釈液) 株式の二重の希薄はその後のシリーズに続いてダブル ストック (10 μ L) の量と第 1 レーンをロードします。
- 30 分間 200 V の定電圧でゲルを実行します。
2. ゲルの固定
- 電気泳動後 50 rpm 4 ° C で室温 2 x (30 分ごと)、または一晩で軌道シェーカーで 40 %ethanol/10% 酢酸 100 mL の溶液でジェルを水没します。
- ゲル 3 x 10 分ずつ清潔な容器に超純水で洗います。洗浄のステップが重要です。蛍光開発ステップで定着液から酸が適切に削除されていない場合過剰なTPE 4TAは酸によってできるようになり、ゲルで強力なバック グラウンド蛍光に 。
3 作成、アグノ3ソリューションとゲルの鍍銀
- アグノ3ソリューション (0.0001%) を作成するには含浸、アグノ3 0.1% アグノ3ストック溶液を調製する純水 10 mL の 0.01 g をまず、解散します。次に、実用的なソリューションを作るために超純水水 100 mL に 0.1% アグノ3ストック溶液 100 μ L を追加します。
メモ: アグノ3ソリューションは、使用する前に暗闇の中で保存する必要があります。 - 1 h のためのソリューションに取り組んで密封されたガラス容器の 50 回転軌道シェーカー銀の 100 ml ゲルを含浸します。ヒューム フード、アルミ箔を光から保護の下で鍍銀を実行するが重要です。
- 2 x 60 の清潔な容器に超純水水 (約 100 mL) のゲルを洗う s。
4. 蛍光ゲルの開発
- 染料原液 (0.1 mM) を準備するには、50 ml の超純水のTPE 4TA色素の 3.0 mg を追加します。数分間ソリューションを超音波照射し、色素を溶解するためにいくつかの NaOH 溶液 (たとえば 1 M) を追加します。
- 蛍光色素分子が完全に解散したことを確保するため 365 nm の紫外線ランプの下で解決策を確認してください。弱いまたは発光のソリューションは、完全な分解を示すだけ。
注: TPE 4TAだった色素合成次プロトコルが最近謝らによって報告されました。10 TPE 4TAソリューションは非常に安定していると数ヶ月の暗闇の中で保つことができます。 - 蛍光現像液 (10 μ M) の 100 mL を準備するには、90 mL の純水にTPE 4TA原液 10 mL を追加します。PH メーターを使用して液の pH を確認し、7-9 は、水酸化ナトリウム溶液 (1 μ M) を使用して調整します。
- 蛍光現像液 100 mL で清潔で密閉容器にゲルを転送します。ゲルはソリューションに完全に浸漬されていることを確認します。容器を密封します光からカバーし、一晩室温で 50 回転軌道シェーカーで振る。また、潜伏ステップは、AIE 現像液で染色し、その後、室温でそれを残して 80 ° C に予熱して約 ~ 2 h も短縮できます。
5. 染め色とイメージング
- 清潔な容器にゲルを転送し、30 分間 10% エタノール 100 ml すすぐ。
注: ゲルを洗浄する水だけを使用できます。しかし、染め色に 10% のエタノールを使用する時間効率的です。これは時間から 30 分に染め色のプロセスを削減するのに役立ちます。 - 5 分間超純水でジェルを洗い流してください。
- 365 nm チャネルまたは 302 nm チャンネルでゲルをイメージすると、ゲルのマニュアル機をします。
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結果
蛍光銀染色で染色蛋白質バンドは、365 nm の紫外線ランプの下で強烈な緑の蛍光性を表わします。すべて 14 タンパク質のバンド (10-200 kDa)、上下からから、染色可視ルビー色素 (図 2)1014 の赤いものによく相関、明確に表示でした。
量的蛋白質の検出に関するイメージング システムの自動化された手順を使用してゲル ゲルをイメージしました、画像を分析し、商用ソフトウェアを使用して比較しました。この蛍光の銀染色法は、高解像度を持って表示されます。いくつかのタンパク質のバンド蛍光銀染色の感度は蛍光可視ルビー汚れのそれよりわずかによいまた。特に、新しいメソッドが低分子の重量が付いている蛋白質の検出に特に有用であることを示す、~ 10 に 40 kDa 蛋白質バンドの蛍光銀染色法の性能が向上しました。またタンパク質定量 (
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ディスカッション
ここで紹介は新規蛍光銀製の汚損ポリアクリルアミドゲルの蛋白質のためのメソッド。この戦略は、従来の銀汚れと蛍光汚れを統合します。染色攻撃他の銀のように蛋白質に銀イオンの選択的バインド汚れが高感度蛍光シルバーを採用してプローブTPE 4TA銀のバインドされた蛋白質を点灯します。それにより従来の必要に応じて還元的視覚化のステップの任意のさらなる需要がなく高感度検出、蛍光プローブTPE 4TAはナノモル範囲11でかなり低濃度の銀イオンを感じることができる、のでシルバーの汚れ。これは実行するバリエーションを最小限に抑えます。一方、ホルムアルデヒド、グルタルアルデヒド、頻繁 MS 分析ペプチッド識別を妨げるなどの過酷な化学薬品の使用を避けます。また、 TPE 4TA AIE アクティブは、任意の自己クエンチング問題の無料、蛋白質バンドに密に蓄積された染料は、まとめて色素分子数に対して生成できます。これは、広いダイナミック レンジ (LDR) 蛋白質の検出と可視ルビー汚れと比較するとはるかに明るい染色の...
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開示事項
この蛍光銀染色の特許出願が提出されています。
謝辞
著者は、彼のサポートのため、修復医学教育研究、カロリンスカ研究所明カーウァイ ・ ラウ センターでパトリック ・ チャンを感謝したいです。S. x. はスウェーデン研究評議会 (グラント号 2017年-06344) からのサポートに感謝します。
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材料
| 名前 | 会社 | カタログ番号 | コメント |
|---|---|---|---|
LDS サンプルバッファー (4X) | Thermo Fisher Scientific | NP0007 | 試薬 |
4-12% Bis-Tris Protein Gels、1.0 mm、15 ウェル | Thermo Fisher Scientific | NP0323BOX | プレキャストゲル |
| サンプル還元剤 (10X) | Thermo Fisher Scientific | NP0004 | 試薬 |
| MES SDS Running Buffer (20X) | Thermo Fisher Scientific | NP0002 | 試薬 |
| ミニゲルタンク | サーモフィッシャーサイエンティフィック | A25977 | 機器 |
| 300W電源(230VAC) | サーモフィッシャーサイエンティフィック | PS0301 | 機器 |
| 未染色タンパク質ラダー | サーモフィッシャーサイエンティフィック | 26614 | サンプル |
| 硝酸銀 | Sigma-Aldrich | 31630-25G-R | 試薬 |
| エタノール | ブラッグと共同 | 42520J | 試薬 |
| 酢酸 | J.T. Baker | 103201A | 試薬 |
| Milli-Q 合成 A10 | MΩ.cm水 | ||
| ゲルドキュメンテーションシステム(C600モデル) | Azure biosystems-Equipment |
参考文献
- Chevalier, F. Highlights on the capacities of "Gel-based" proteomics. Proteome Science. 8 (1), (2010).
- Harris, L. R., Churchward, M. A., Butt, R. H., Coorssen, J. R. Assessing detection methods for gel-based proteomic analyses. Journal of Proteome Research. 6 (4), 1418-1425 (2007).
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