大脳皮質の局所電界電位と自由行動ラットから侵害受容のレーザー刺激への応答で Electrocorticograms の同時録音

Summary

我々 は自由行動ラットから侵害受容のレーザー刺激への応答で下角と局所電界電位を同時に記録する技術を開発しました。この手法は、侵害受容情報の脳内処理の検討を容易にするメゾスコ ピックおよびマクロスコ ピック レベルで electrocortical 信号の直接関係を確立できます。

Abstract

Electrocortical 誘発侵害受容の自由神経終末をアクティブに選択的にレーザー熱によるは、痛覚情報の皮質の処理を調査する多くの動物と人間の研究で活躍しています。これらのレーザー誘発脳電位 (LEPs) は、時間ロック レーザー刺激の発症には、いくつかの一時的な応答で構成されます。しかし、LEP 応答の機能特性、まだ主として知られている (すなわち、皮質脳波 [ECoG]、頭皮の皮質の表面で神経活動を記録できる同時にサンプリング技術の不足のため脳波 [頭皮脳波])、(すなわち、ローカル フィールド ポテンシャル [LFP]) の脳内。この問題を解決するには、提案はここで自由に移動するラットを用いた動物のプロトコルこのプロトコルは 3 つの主要な手順で構成されます: (1) 動物の準備、手術、受容のレーザー刺激、(3) データ解析と特徴抽出に対応 ECoG と LFP の (2) の同時記録。具体的には、3 D プリントの保護シェルの助けを借りて、ラットの頭蓋骨に埋め込まれた ECoG と LFP の両方の電極が安全に一緒に開催。動物は自然の静けさにいたとき、データ収集中パルス レーザーは商工会議所の下の隙間からネズミの前足に渡されました。継続的なホワイト ノイズ レーザ超音波聴覚システムの活性化を避けるために演奏されました。結果として、侵害受容応答のみを選択的に記録しました。高い信号対雑音比とレプスがあったことを示す結果を得た (例えば、バンドパス フィルター、エポック抽出、基線補正) 刺激による脳の反応を抽出する標準的な分析手順を使用して、ECoG と LFP 電極から同時に記録されます。この方法論 ECoG、先進党活動の同時記録を可能とすることにより侵害受容情報処理の調査を促進するメゾスコ ピックおよびマクロスコ ピック レベルで electrocortical 信号のブリッジを提供します。脳内。

Introduction

脳波は、電位と脳のニューロンの数千人の同期の活動によって生成される振動の脳活動を記録する手法です。多くの基礎研究や臨床応用^1,2で広く使用されます。例えば、脳波の反応高強度レーザー熱パルス (すなわちLep) 受容感覚入力^3,4、5の末梢および中枢処理を調査するために広く採用されています。ヒトでは、Lep は主に 3 つの明瞭なたわみの構成: somatotopically 組織と一次体性感覚野 (S1)⁶活性を反映する可能性が高いは初期のコンポーネント (N1) と中心部が後期成分 (N2 と P2)分散および二次体性感覚皮質、皮質、前帯状皮質^7,8の活動を反映する可能性が高い。以前研究^9,10、我々 は直接、脳の表面につけた電極からラット レプス、ECoG (頭蓋内脳波の種類) を使用してサンプリングを実証、またから成っている 3 つの明瞭なたわみ (すなわち、somatotopically 編成 N1 と集中分散 N2 と P2)。極性、順序、およびラット LEP 成分のトポグラフィ人間レプス¹¹に似ています。ただし、頭皮脳波と硬膜下血 ECoG 録音¹²の限定の空間分解能により脳波の不正確な性質だけでなく、ソース解析テクニック¹³、LEP コンポーネントに対する神経活動の詳細な貢献多くは議論です。たとえば、それは明白でない場合、S1 がレーザー刺激⁶によって誘発される電位 (N1) の初めの部分に貢献する程度。

脳定位固定装置とマイクロ ドライブ^14,の支援によりマイクロワイヤー アレイを用いた巨視的レベル、直接頭蓋内録音で記録技術と異なる¹⁵神経活動 (例えばLFPs を測定できます。) 特定の地域の。LFPs は主にローカルの神経集団¹⁶の抑制や興奮性シナプス後電位の総和を反映しています。LFP サンプリング神経活動は数百 μ m の記録電極の周りの内で発生する神経プロセスを反映して、以来この録音技術がメゾスコ ピック レベルで脳内処理情報を調べるに使用されています。しかし、それがのみ脳活動の正確なローカルの変更に焦点を当て、複数の領域からの信号を統合する方法の質問に答えることはできません (例えば、複数の脳領域で LEP コンポーネントを統合する方法)。

それは ECoG と自由行動ラットから皮質 LFPs の同時記録が皮質の情報処理マクロの両方の調査を促進することは注目に値するとメゾスコ ピック レベル。さらに、この方法論は、定義済みの脳部位の神経活動が、レプスに貢献の程度を調査する絶好の機会を提供します。確かに、いくつかの以前の研究は、スパイク、皮質 LFP 間コヒーレンスを評価している、ECoG 信号を^17,18と脳波電極に隣接する先進党^19,20に貢献することを示した、刺激による脳の反応の形成。ただし、既存の技術は、電極の衝突による破壊を防止する保護シェルの欠乏のための麻酔下の動物の脳の反応を記録する通常されます。つまり、自由行動ラット メゾスコ ピック (皮質 LFP) と巨視的 (脳波、ECoG) レベルで electrocortical 信号のブリッジを構築できる技術はまだ欠けています。

この問題に対処するため、我々 は自由行動ラットから同時に複数の脳領域で、皮質と皮質の LFPs を記録できる技術を開発しました。この手法は、侵害受容情報の脳内処理の調査を進めメゾスコ ピックおよびマクロスコ ピック レベルで electrocortical 信号の直接関係を確立できます。

Protocol

(400-450 g の重量を量る) 雄 Sprague-dawley ラットは実験で使用されました。外科的および実験手順はすべてケアと国立衛生研究所の実験動物の使用のためガイドに従った。手順は、心理学研究所、中国科学院の研究倫理委員会で承認されました。

1. 電極注入

1. 商工会議所 5% イソフルランと手術前に 1 L/分の空気流量でラットを麻酔します。
2. 脳定位固定装置を使用して、麻酔マスクに鼻とネズミの頭を修正します。イソフルラン経由で手術中に麻酔の深さを維持するために 0.5 L/分の空気流量と 2% の濃度で麻酔マスクを管理します。つま先ピンチに応答するラットが失敗したときに手術のトレランスが実現されることに注意してください。
3. 角膜の乾燥を防ぐため目に眼軟膏を適用します。
4. 標準的なシェーバーを用いたラット頭皮の上部を剃る。
5. ヨウ素を削除する医療 iodophor 消毒ソリューションと 75% アルコールを使用して頭皮を殺菌します。
6. リドカイン (2%) をローカルの鎮痛のため頭皮に注入します。呼吸器の分泌亢進を抑制するアトロピン (0.2 mL i. p.) を管理します。
7. メスを使用して頭皮に約 2-3 cm の正中切開を行います。カットし正中線に沿って頭皮の部分を削除し、頭蓋骨を公開します。必要な場合、出血を止めるため、electrocoagulator を使用します。
8. (前の位置に応じて配置) 定義済みの定位座標に基づいて ECoG 電極の場所 (それぞれ 2 と 4 mm、ラムダから尾の方を配置) 正中線に参照と地上の電極の位置をマークします。
9. ドリル穴 (直径: 0.5 mm) ECoG ねじ用電気頭蓋ドリルのマークのついたサイトで頭蓋骨の硬膜を破壊することがなく使用します。
10. ステンレス鋼ねじをドライブ (外径: 0.6 mm)、絶縁被覆銅線、基になる硬膜を貫通せず約 1 mm の深さの穴に接続します。これらのネジは、実験中に ECoG、参照、および接地電極として機能します。
11. 頭蓋の保護シェルをベースに取り付けます。歯科アクリルを用いた頭蓋に隣接するネジでベースを固定します。対象となる深度線注入に使用する意図は領域を保護するためにその後削除される医療の綿を使用します。
    注: 保護シェルは 3 つの部分から成っている 3 D 印刷ポリのカスタム設計製品: ベース、壁、およびキャップ。壁はファラデーケージとして構築する銅のテーパーによって覆われています。
12. 定義済みの定位座標に基づいて深さワイヤ電極の位置をマークします。
13. 小さな穴をドリル (直径: 0.2 mm) ワイヤー移植へのマーク付きのサイトの周りの頭蓋骨、硬膜を公開する骨弁を慎重に取り外します。通常塩水を使用して、開頭手術を頻繁に洗ってください。図 1では、深さのワイヤ電極の注入前にセットアップについて説明します。
14. 針を使用して、持ち上げ、軟膜、血管、および新皮質の表面を傷つけることがなく硬膜をカットします。
15. 低い深さは新皮質の表面に電極を配線し、その後、ゆっくりとターゲットの深さに脳を貫通します。よく皮質復元用電極下に移動を停止します。本研究ではワイヤーの先端の深さは皮質表面の下で 0.5 mm です。
16. 以降の実験操作の深さワイヤ電極を移動できることを確認するワックスとパラフィン油の混合物で開頭術を封印します。
17. 頭蓋の歯科アクリルを用いた電極装置を修正します。
18. コネクタ モジュールに対応するチャネルに ECoG ネジに接続するそれぞれの銅線を溶接します。異なるチャネル間の潜在的な接触を避けるために粘土を使用して溶接スポットをカバーしてください。
19. 保護シェルの壁をベースに組み立てるし、対応するチャネルを参照と地上の電極を溶接します。
20. 汚染を防止するテープを使用して保護シェルにキャップを修正します。
21. ペニシリンとラットの挿入 (60,000 U、i. p.) 術後の感染症を防ぐために手術直後後。
22. 単一の家で、温度および湿度コントロール ラット ケージ食物と一緒に、手術後 12 h 昼/夜サイクルの維持など水 LEP 実験する前に、少なくとも 1 週間の自由。
    注: 皮質と皮質 LFP、装置を同時に記録するには、使用されましたここでタングステン細線アレイに接続されているいくつかのマイクロ ドライブに含まれているコネクタ モジュールにリンクされている電極の 2 つのタイプで組み立てられました。ゴールドのピンは、EIB の金属の小さな穴にワイヤを押してコネクタ モジュールのタングステン ワイヤを電極のインタ フェース ボード (EIB) に接続する使用されました。EIB の 2 つの金属穴を被覆銅線をはんだ付けし、各銅線のオープン エンドは ECoG ネジに接続されている対応する銅線に半田付けします。加工の詳細がされている²¹は別記します。

2. データの収集

1. ラットを実験者²²に精通して取得することを確認する実験の前に 3 つ以上の連続した日のラットに少なくとも 1 日 x をくすぐる。
2. ラットは、録音環境にさせることを確認する実験の前に少なくとも 1 時間動作室のラットを配置します。
   注: 商工会議所は 30 cm の辺の長さを持つプラスチック キューブです。チャンバーの底 〜 8 ミリメートルの隙間に鉄格子で作られています。
3. ラットをギョッとさせると、電極モジュールの損傷を避けるために優しく、電極モジュールで記録パッチアンプ用アダプターを接続します。
4. レーザー発生器の設定、光ファイバーを接続および機器のオペレーターのマニュアルによるとレーザーのスポット サイズを調整します。トリガー発生器からデジタル出力を記録委員会のデジタル入力ポートに接続します。
   注: 繊維破壊を避けるために過度に光ファイバーをカールに注意してください。レコーディングの前にトリガー信号が表示され、レコーディング ソフトウェアが記録されていることを確認します。このプロトコルで放射熱刺激、赤外線ネオジム イットリウム アルミニウム ペロブスカイトによって生成されます (Nd: ヤップ) 1.34 μ m の波長を持つレーザー。レーザー スポット サイズの直径は約 5 mm に集光レンズで設定されます。He-ne レーザーは、実験の目的に応じて定義されている刺激の領域を指摘しました。また、パルス レーザーの刺激エネルギーは、実験的なデザインに従って決定されます。レーザーのパルス持続時間は 4 ms です。
5. 前足を受け取る受容レーザー刺激ラットの疼痛関連行動を継続的に記録する実験室の隅の下にカメラを設定します。位置および侵害受容行動は実験を通して完全に記録されますを確認するためにカメラの方向を調整します。
   注: 高速電荷結合素子 (CCD) カメラは強くお勧めします、発症時刻と侵害受容行動期間を正確に記録する録音システムのメイン基板に動作信号を提供することができます。通り動物の動きの^23,24に基づく定義済みの基準に従って各レーザー刺激後、疼痛関連行動を実験者によって評価されて: ない動き (スコア = 0)、頭を向ける (振動を含むまたは頭を昇降スコア = 1)、まったく悪びれる (すなわち、小さな急激な身体運動をけいれん; スコア = 2)、撤退 (すなわちレーザーの刺激から足退縮; スコア = 3)、舐めると全身の動き (スコア = 4)。
6. 商工会議所の上部にスピーカーを継続的なホワイト ノイズ (50 dB SPL)経由で提供します。
   注: 以前の研究^10、25のように、皮膚にレーザー刺激はラットの聴覚システムによって検出することができます超音波を生成します。このため、継続的なホワイト ノイズがレーザーで生成された超音波に応えて聴覚システムの活性化を避けるために実験を通して再生されます。この手順により、痛覚系の活性化に関連する脳の反応の選択的な記録です。
7. ECoG と機器のオペレーターのマニュアルによると記録システムを使用して深さのワイヤ電極から電気生理学的データを収集します。
   注: カメラとレーザー パルスの信号を同時に電気生理学的データを同時にサンプリングするトリガーの動作信号サンプリング レート (すべてのデータが増幅され、20,000 の Hz のサンプリング レートを使用してデジタル化) されます。すべてのデータは、時間同期化されます。
8. 商工会議所の下の隙間からネズミの前足の足底にレーザー パルスを提供します。
   注: ラットは 2 以上の自然の静けさはのみにレーザー刺激は配信 s 運動関連成果物の信号汚染を最小限に抑えるために、実験者の観測に基づきます。被って疲労または感作性を避けるためには、レーザービームのターゲットがずれている場合手動で各刺激後、刺激の間隔は 40 s. ECoG と LFP 信号記録できます数回各ラットよりも短くありません。ラットは実験室 1 h でそれぞれ録音セッションの前に置かれる必要があります。結局レコーディング セッション、ラットは麻酔が深く、冷たいリン酸緩衝生理食塩水で 4% パラホルムアルデヒドに続いて transcardially を潅流します。脳は頭蓋骨から削除され、電極の位置を識別するために断面します。

3. データ分析

1. 1 と 30 Hz の帯域通過フィルターを持つ連続データをフィルターします。
2. エポック 3 の解析ウィンドウを使用してデータ s、1 から 2 に前に s レーザー刺激の発症後 s。ベースライン補正を及ぼす刺激前の期間内の平均振幅を減算することによって行います。
3. 総人工物によって汚染された新紀元を手動で拒否します。
4. 各実験条件にレーザー刺激の発症に時間ロックが平均 LEP 波形を計算します。
5. ワイヤ電極と深さから記録された LEP 波形のウェーブレット変換コヒーレンス (WTC) を計算します。
   注意: WTC は、周波数と時間の関数として電極のペアのコヒーレンスを実行する手法です。2 つの信号間の WTC は、全体の時間-周波数スペクトルのコヒーレンス値を生成する利点は、任意の時間-周波数ポイントの計算できます。方法論の詳細がされている²⁶は別記します。

Results

代表的な実験 5 ラットから電気生理学的データが記録されました。20 回の各ラットの右の前足にレーザー刺激が届いた > 40 s 刺激間隔。ECoG ネジ両方の深さワイヤと深さ線反応が記録されたレーザー誘発脳に移植された両側の一次体性感覚野 (S1) と一次運動野 (M1)。

図 1にまとめたよう 2 (黒でマーク) が、深さのワイヤー電極 (4 つの地域のそれぞれの 5 のワイヤーの色でマーク) (前への参照で表される以下のポジションで定位座標に従って配置されました。mm;正の X および Y 軸の値は、それぞれ左右前方の場所を示す): 左 ECoG で X =-1.5 と Y = 1.75;右の ECoG で X = 1.5 と Y = 1.75;左 S1 で X =-4 と Y = 0.5。右 S1 に X = 4, Y = 0.5。左の M1 の X =-3 と Y = 3;右の...

Discussion

本研究と自由行動ラットから侵害受容のレーザー刺激による皮質 LFP 応答を同時に記録するための手法について説明しました。結果、ECoG と LFP の両方の信号のレーザー刺激の発症後 LEP の応答を明確に検出できます。皮質と皮質の LFP 信号の同時記録は、LEP コンポーネントにニューロン活動の貢献を理解の関係を調査する科学者を有効になります。

提案手法で重要な 5 つの手順を注意してください。まず、歯科のアクリルを使用して、基本の保護シェルを固定する前に、頭蓋骨の表面はきれい、乾燥していることを確認することが重要です。この手順により、保護シェル ベースが固定されて安定しています。第二に、ECoG ネジの直径よりわずかに大きい穴の初期のスクリュウ駆動がねじ山を形成する穴を大きくなりますので。本研究ではタングステン線の穴と皮質ネジ用の穴の間の距離が非常に小さい (例えば、0.3 mm 未満)。穴をすべて、ECoG 前にネジを駆動し、深さワイヤー挿入、ECoG 穴の周りの頭蓋骨は、壊れやすいだろうし、それはねじ駆動中に穴の拡大の機械的負荷を冠していません。このため...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
雄 Sprague-Drawleyラット	バイタルリバー
イソフルラン	RWD ライフサイエンス
小動物用イソフルラン麻酔システム	RWD ライフサイエンス		ラット用麻酔ガスマスクを含む 定
位固定装置	RWDライフサイエンス
ECoG電極とLFP電極			を組み合わせた装置この装置は自家製で、ECoGと深度ワイヤー電極をコネクタモジュールに組み立て
3Dプリントされた保護シェル			シェルの質感はポリラクティックで、シェルは自家製で、ベース、壁、キャップの3つの部分が含まれています。壁は銅の先を細くしてファラデーのおりの
タングステン ワイヤー(直径:50 mm)	カリフォルニアの細いワイヤー会社		質LFPの記録のための電極
。ステンレスネジ (直径0.6mm)			ECoG記録用電極
電動頭蓋ドリル	RWD ライフサイエンス
ドリルビット(直径:0.5mm)	RWDライフサイエンス		ECoGネジの穴あけに使用します
ドリルビット(直径:0.2 mm)	RWD ライフサイエンス		ドリルは、深線の穴を開けるために使用されます
歯科用アリル粉末	SNC歯科
用アリル液体	SNC歯科
パラフィン	フィッシャーサイエンティフィック
電気凝固器	Bovie medical Corporation
RHD2132アンプボード	Intan Technologies		32チャンネルヘッドステージ
RHD2000 systerm	Intan Technologies		データ収集 systerm
赤外線ネオジムイットリウム アルミニウムペロブスカイト (Nd:YAP) レーザー発生器	Electronical Engineering
Matlab R2016b	The MathWorks