マウス表皮ケラチノサイトの単離とインビトロクロノジェニック培養

哺乳類の皮膚は全身を覆い、多くの機能(例えば、一次物理的障壁、温度調節、および保湿)を果たす。過去50年間にわたり、マウスの皮膚に関する基礎研究は、皮膚の構造と機能に関する新しい情報を生み出しました。マウスの皮膚モデルは、化学的または紫外線による発癌の複雑な分子機構の背後にある基礎生物学の理解に大きく役立った。これらのマウス皮膚モデルは、ヒトの皮膚疾患とその緩和に対する理解に大きく寄与した。毛包発生生物学における一次ケラチノサイトのさらなる分子解剖、幹細胞研究、発癌、表皮の遺伝的探索を探索するためには、一次上皮を分離して培養することがしばしば望ましい。マウスの皮膚からのケラチノサイトは、生体内実験と並行して使用する。この方法を開発する動機付け要因は、クロノジェニック表皮および毛包幹細胞1,2のインビトロアッセイの必要性であった。また、クロノジェニックアッセイ3、蛍光活性化細胞選別、及びフローサイトメトリー3、4に適した表皮細胞の単細胞懸濁液の緊急の必要性があった。この方法の利点は、他の方法5、6に対して大きさの桁を増加させる堅牢な収穫であり、毛包の上皮部分を包含し、収穫された細胞の高い培養性である。1980年代には、これらの要件を満たすことができる既知の方法はありませんでした。その後の年に、この方法は細胞収率を高めるために精製された。この方法の主な制限は、免疫反応性6を損なういくつかのトリプシン感受性抗体のマスキングであろう。

マウスは、特定の病原体フリーガイドラインに従って飼育を受けました。1~5匹の雌マウス54〜2日齢を得た。古いマウスでは、ケラチノサイトの生存率は、毛周期のアナゲン相(成長)のために減少する。また、トリプシン化のプロセスは、若いマウスに比べてより困難である。収穫手順は、オスと比較して雌マウスの薄い皮膚に対して正常に最適化されています。オスのマウスは、ハウジング中に互いに戦う傾向があるため、皮膚に傷や傷を残す可能性があるため、一般的にケラチノサイトの収穫には使用されません。

すべての脊椎動物使用プロトコルは、推奨されるNIHおよび政府のガイドラインに従って、ミネソタ大学の施設動物ケアおよび使用委員会によって承認されています。

1. フィーダー層の初期化とサブカルゼーション

1. 液体窒素タンクから凍結スイスマウス3T3を含有する1つの細胞バイアルを1〜2分間37°C水浴に入れ、解凍する。バイアル中の細胞数は約1 x 10⁶である。
2. 氷の最後のスライバーが溶けたら3T3細胞バイアルを取り除きます。70%のアルコール綿棒でチューブを拭きます。次に、バイアルをバイオセーフティキャビネットに移します。
3. 細胞をT-150フラスコにゆっくりと移し、3T3バイアルを1mLのCGM培地ですすぎます。予温められた3T3完全増殖培地(CGM)の30mLを細胞にゆっくりと加える。フラスコをそっと揺らして3T3線維芽細胞を均等に広げます。フラスコにセルラインの詳細、日付、および通路番号を適切にラベル付けします。
4. 5%CO₂および95%の湿度で37°Cで細胞をインキュベートする。
   注:ATCCによると、スイスマウス3T3の倍増時間は18時間です。コンフルエント(接触阻害)の場合、密度はcm2当たり約40,000細胞である。初期化後の10~15節内で3T3の特定のラインを使用します。より急速な成長または紡錘形細胞の存在は、より高い通路で起こり、通常、3T3が成体マウスケラチノサイトのフィーダー細胞と同様に機能しないことを示す兆候である。急速な増殖が起こる場合は、下部通過細胞から新しい行を開始することをお知りたい。
5. 24時間後に培温を変更して、死細胞と残りのDMSO(凍結保存剤)を除去し、その後週2回行う。細胞が約80%の合流を増殖させ、培養開始にT-150フラスコを使用できるようにします。初期化後のサブカルチャーにはT-225フラスコを使用してください。
6. 3T3線維芽細胞をサブ培養するには、細胞培養インキュベーターからフラスコを取り出し、ゲンタマイシンで冷たい無菌PBS(1x)で2回洗浄する。ピペット 10 mL の予温められた (37 °C 水浴) トリプシン溶液 (0.25%)各T-225フラスコに。
   1. フラスコを3~8分間温めたプレートの上に置き、手のひらを軽く取り出してフラスコの壁をタップして細胞を剥離し、反転顕微鏡下で細胞の剥離を確認します。トリプシン溶液は、剥離した3T3細胞で曇りが現れることがある。
7. トリプシン溶液を3~4倍にピペ状にしてフラスコの細胞増殖面を洗浄し、50mL円錐管でCGMの30mLにトリプシン化細胞を移移す。50 mL円錐管からCGM-トリプシン細胞混合物の10 mLでフラスコ3-5xを再洗浄します。
   注:2つのフラスコの内容物の内容物は50 mLの管に加えることができる;フラスコを1つだけ使用する場合は、10 mLのトリプシン/セルを50mLチューブに20mLのCGMに入れます。
8. 4 °Cで7分間160 x gで50 mL円錐管を遠心分離します。
9. 次亜生を吸引し、5 mLのCGMで細胞ペレットを再中断し、細胞ペレットを完全に破壊するために~10x穏やかにピペッティングする。CGMの10 mLを追加して、50 mL円錐管の総容積を15 mLにします。
   1. 再び~10xを混ぜ、セル懸濁液の5 mLを3つの別々のT-150フラスコに入します。サブ培養比は、T-225フラスコで1:3、T-150フラスコで1:4です。各フラスコに30mLの予め温められた3T3 CGMを加えます。
10. フラスコにセルライン名、セルシードの日付、および通過番号にラベルを付けます。
11. サブ培養工程で遠心分離に続く3T3細胞を凍結させるには、遠心分離機から50mLチューブを取り出し、氷のバケツの上に置きます。上清を吸引し、収穫した各フラスコについて、5%DMSO-DMEM混合物の1mLでセルペレットを再中断する(表1参照)。
12. DMSO-DMEM混合物を各凍結液に1mL置きます(3T3フラスコ収穫につき1回)。バイアルに通路番号、セルライン名(3T3)、およびセルが凍結された日付にラベルを付けます。
13. これらの3T3セルバイアルをセル冷凍庫の瓶(材料の表を参照)に入れ、-70°C冷凍庫に移し、細胞冷凍庫の瓶からバイアルを慎重に取り出し、次の使用まで長期保存用の液体窒素貯蔵タンクに入れます。.セルライン名、タンク内の位置、および実験室の液体窒素インベントリシートの日付に関する情報を入力します。

2. X線照射および播種のための3T3フィーダー層の調製

1. 照射の1週間前に3T3細胞を調作し、約100%の合流を増殖させます。3T3細胞は、典型的には120~130の通過内にある。
2. 一次ケラチノサイトのクロノジェニックアッセイに成功した場合、3T3細胞を播種する前に、60mmペトリ皿をコラーゲンで表面塗りする。
   1. コラーゲンコーティング液の約2〜3mLのピペットを60mmペトリ皿に塗布し、余分なコラーゲンコーティング液を除去する(表1参照)。ペトリ皿を37°Cのインキュベーターに移し、5%CO2で最低1時間の間移します。インキュベーターで皿を乾燥させないようにしてください。
3. X線照射ステップ:手順1.4~1.6に従ってください。50 mLの新鮮なCGMを使用して細胞ペレットを再中断し、円錐管を閉じ、パラフィンシールフィルムでシールします。汚染を避けるため、ビニール袋を使用して、チューブを含むパラフィン密封セルを二重袋に入れ、氷の上に置きます。マイトマイシンベースの代替フィーダー層は、ケラチノサイト培養7に使用することができる。
4. 生物学的X線装置を用いた5,000ラッド(50 Cgy)用量を用いた50 mL円錐管内の線維芽3T3細胞を照射する。これらのセルを CGM メディアと共に照射します。
   1. X線照射に続いて、遠心分離球は4°Cで7分間160xgである。 上清培体を吸引し、5mLのCGMで細胞ペレットを穏やかに〜10倍に再濁させる。今、ミディアムとトリチュレート10xの追加の25 mLで30 mLに最終容積をもたらします。これらのトリチュレーション工程は、クロノジェニシティアッセイの均一な3T3線維芽細胞層にとって極めて重要です。
5. 生存細胞計:通常のガラス血球計を使用してケラチノサイトを数えます。約0.5 mLのセルを取り、1.5 mLチューブに入れます。200 μLの細胞混合物を取り出し、0.4%のトリパンブルー溶液と混合物3-4倍の等しい体積を追加します。血球計で細胞を転写し、すべての核細胞(小さな金とピンクの細胞)を生存可能な細胞としてカウントします。生存可能な金細胞の最終的な濃度を計算します。
6. ピペット1 x 10⁶ 3T3細胞(最低7 x 10⁵⁾細胞を60mmコラーゲンコーティングペトリ皿(ステップ2.2)にし、4mLの修飾高カルシウムウィリアムズE培地を穏やかに添加する(表1参照)。新たに播種された3T3細胞を24時間アタッチできるようにします。翌日、新鮮な一次ケラチノサイトを収穫し、以下に示すようにクロノジェニックアッセイのために付属の3T3線維芽細胞層の上に種をまきます。

3. 原発性ケラチノサイトの収穫と播種

1. 承認された動物施設/IACUC基準に従ってCO2吸入を介して4~5匹の成体雌マウスを安楽死させる。しかしながら、このプロトコルは、単一の雌/雄マウスにも使用されてもよい。
   1. 電気動物のクリッパーで後毛の約9 cm²をクリップし、1-2分それらをカバーするのに十分なポビドネヨウ素消毒溶液(スクラブではない)で500 mLの瓶にすべてのクリップマウスを置きます。マウスの上の解決策。
   2. 溶液を注ぎ、液体が透明になるまできれいな水で洗い流します。同じ消毒洗浄を繰り返し、その後に水洗いを行います。ヨウ素溶液で消毒洗浄した後、5-10分間70%エタノールですべてのマウスを浸します。
      注:軽い毛皮を持つマウス(例えば、BALB/c)は消毒ヨウ素の洗い流しからわずかに黄色がかった色を保持し、暗いマウス(例えば、C57BL/6)は保持しません。特に、細胞の生存率または培養の増殖は、黄色のために影響を受けない。
2. 層流フードに親指の鉗子とはさみを使用して、切り取られた背中の皮膚を慎重に取り除きます。PBS/2xゲンタマイシンで満たされた円錐形のチューブに取り除かれた後部皮膚を置きます。培養中の乳細胞汚染を防ぐために、腹部側の皮膚を使用することは避けてください。
3. オートクレーブされた鉗子とメスを使用して、薄いペトリ皿の上に一度に毛深い側面に1つの背中の皮膚を置きます。半半透明になるまで、皮膚組織の腹部側から脂肪を含むすべての皮下組織を掻き取り始める。皮膚(毛包部分)を引き裂かずに皮下組織の最大痕跡を除去してみてください。また、長時間擦り、皮膚の乾燥を避けてください。
   1. 他のすべての残りのスキンが処理されるまで、PBS 溶液中に擦り傷を付けた皮膚を保持します。メスを使用して、0.5 cm x 1-1.5 cmのストリップに皮をスライスし、無菌ペトリ皿の上に毛深い側面を置きます。
4. トリプシンと混合したPBS/2xゲンタマイシン溶液の慎重なピペット20 mL (0.25%)100ミリメートルx 20ミリメートルプラスチックペトリ皿に。無菌鉗子を使用して、皮膚を転送し、32°Cのインキュベーターで2時間トリプシン溶液の表面に毛深い側面を浮かべる。
   注:トリプシン化時間と温度は、非常に培養性の高い一次ケラチノサイトの良好な収率のために重要です。他の方法は、生存細胞の良好な収率を提供する可能性があるが、ケラチノサイトの培養性はあまり満足されていない。
   1. この2時間のインキュベーション時間の間に、コラーゲンコーティングで皿を塗り、1時間37°Cに置きます(ステップ3.1.2を参照)。クロノジェニックアッセイの場合、60mmペトリ皿は、照射された3T3フィーダー層が底部に付着して均等に広がるように、ケラチノサイト収穫前に24時間コーティングされています。
      注:クロノジェニック培養のための培養皿のコーティングは、適切な付着、コロニー形成、およびマウス表皮ケラチノサイトの最終的な増殖/増殖のために非常に重要である。
5. 表皮スクレーピング工程:滅菌プラスチック正方形ペトリ皿を配置し、収穫媒体の15 mLで適切な表皮擦り傷のための30°傾斜で表面を作成します(表1参照)。曲がった鉗子でトリプシン溶液から浮遊皮膚ストリップを慎重に取り除きます。新しいメスブレードで、表皮と毛を媒体にこすり落とします。
   1. 過度の力を使用しないでくださいが、表皮を掻くために十分な力を使用するか、細胞の生存率に影響を与えます。
   2. 表皮の擦り傷の間、刃を皮膚片に垂直に保つ。ブレードがブレードの動きに向かって角度を付けている場合は、皮膚が引き裂かれる可能性が高くなります。ブレードがブレードの動きから離れている場合は、表皮除去が不十分な可能性が高くなります。
6. 1.5インチの磁気攪拌バーで、スクレイピングされた表皮細胞を含む収穫媒体を無菌60 mL瓶(オートクレーブ可能で再利用可能)に注意深く注ぎます。残りの表皮細胞を収集し、30 mLに最終容積をもたらすために追加の収穫培地でペトリ皿をすすいでください。磁気撹拌機を使用し、室温で20分間100rpmでかき混ぜます。このプロセスは、毛髪から閉じ込められた表皮細胞を除去します。
7. 50 mL円錐管の上に無菌の70 μmセルストレーナーを置きます。細胞のストレーナーは50 mL円錐形の管の上に合う。
   1. バイオセーフティフードの中に瓶を入れて攪拌棒を取り外し、50 mL円錐形のチューブに取り付けられたストレーナーフィルターに内容物を注ぎます。角質層の望ましくない髪とシートをひずみます。
   2. ストレーナー内の角質層材料と一緒に毛髪を押し、閉じ込められた毛細胞を解放するためにそれらを操作します。5 mLの収穫培地を使用して、残りの閉じ込められた細胞がチューブに放出され、流れ込むことを可能にします。円錐形の管の総容積を50までのmLに持って来なさい。
8. 50 mL円錐管に細胞濾過と遠心分離機を160 x gでキャップし、4°Cで7分間使用します。次に上清を吸引し、収穫培地の5 mLを追加します。5 mLピペで~20xを優しくトリビュートしてセルペレットを再ステージングします。
   1. この手順では、セルをアイスボックスに保持して、集約を避けます。収穫媒体の25 mLを追加し、再びトリチュレート(20-25x)。
   2. この工程で正確なケラチノサイト数を確保するには、1mLの細胞懸濁液を取り、19 mLの収穫培地を追加します。これで細胞希釈は50mL円錐管で1:20です。ケラチノサイトが単一のマウスから採取される場合は、細胞懸濁液の体積を調整する。30 mL の代わりに、15 mL を使用し、細胞をカウントするための 1:10 希釈を行います。
9. 50 mL円錐管(1:20希釈)からの希釈細胞のピペ状0.5mLを、1.5mLのオートクレーブマイクロ遠心管に移移す。別の1.5 mLマイクロ遠心分離管に0.2 mL(200 μL)のセルミックスを取り出し、0.4%のトリパンブルー溶液の等しい体積(200 μL)を追加します。この溶液を3xに穏やかに混合し、核化したケラチノサイトを数えるための血球計に細胞を移す。
   1. トリパンブルーに対してすべての濃い青色の細胞を生存不能な死細胞としてスコア付けし、小さな金とピンクがかった細胞を生存可能な細胞としてスコア付けします。マウス当たりの最終的なケラチノサイト収量は、約3,000万個の生存細胞でなければなりません。
10. 4 °Cで160 x gで7分間、元の50 mL円錐形チューブ(ステップ3.8から)を遠心分離します。このステップで、所望の培地で細胞を再中断し、播種細胞に必要な希釈を行う。
    1. 質量培養の場合、細胞培養培地中の35mmペトリ皿各35mmペトリ皿中の種子2~400万個の生存可能な金細胞(KGM型培地+単層培養用サプリメント)(表1参照)。クロノジェニック(コロニー形成)アッセイの場合、コラーゲンコーティングを施したスイスマウス3T3フィーダー層をX線上の60mmペトリ皿当たり1,000個の種子とサプリメントと血清で改変した。
    2. それぞれ35mmと60mmのペトリ皿には、合計2~4mLの媒体を使用します。また、5%CO₂で使用するための重炭酸ナトリウムのレベルを低減してATCCから調達したDMEMおよびウィリアムズE培地を処方する。
11. 培養細胞(質量またはクロノジェニック)を32°Cで成長させ、5%CO2で湿度95%を満たします。マスカルチャーの最初の種まきの翌日にメディアを変更し、その後毎週3倍に変更します。しかし、クローンアッセイの場合、最初の培地変化は細胞播種後2日目、その後週3回です。
12. クローン培養の場合、2週間と4週間の間隔で細胞を培養する。クローン培養の完了後(2または4週間)、培地を吸引する。コロニーを室温で一晩10%緩衝ホルマリンに固定し、オートクレーブ水中で0.5%のローダミンBを1時間染色する。その後、皿の端からピペットでローダミンB染色を取り除きます。
    1. 料理が澄むまで冷たいオートクレーブ水で皿をすすいでください。皿の蓋に傾斜した皿を置き、最終的なコロニーカウントのために乾燥させます。特に、クロノジェニック培養アッセイを行う場合、細胞のピペット<1 mLは決してありません。細胞が濃縮されている場合は、細胞濃度を連続的に希釈する。

典型的には、20 x 106から30 x 106トリパンブルーを除く細胞を除くマウス当たりの表皮ケラチノサイトの収量は、8、9を得られる。生存率は80%から90%の範囲です。典型的な播種効率は、24時間で約30%の付着であり、照射された3T3フィーダー層上のコロニー形成は、C57BL/6マウス用に播種された1,000匹あたり約60コロニー、およびスイス型マウス10の1,000細胞あたり約30コロニーである。、11.コロニー形成アッセイからの典型的な結果を図1に示す。毛包幹細胞の数は、C57BL/6マウス12用CD34+/CD49f+幹細胞の約9%である。フローサイトメトリーの典型的な結果は、図2に与えられる。

4つの異なるメディアの成長特性を図3に示します。試験されたメディアには、KGM-gold、SFM、ウィリアムズE培地、およびモリス-2(ウィリアムズEに基づくモリス研究所で開発された還元カルシウム培地)が含まれます。

図1:成体マウス由来のクロノジェニックケラチノサイトに対するアッセイからの代表的な例。この写真は、CD-1雌マウス54日目からケラチノサイトコロニー形成を示す1)治療なしで、2)アセトンは1週間後に2週間に2回アセトンで1週間後、3)DMBAは1週間後に週2回アセトンで続いた。2週間、4)アセトンは1週間後にTPAが2週間、5)DMBAが1週間後に2週間、TPAが1週間後に2週間、TPAが1週間後に2週間続いた。生体内治療の後、ケラチノサイトを1皿1,000細胞で採取し、照射した3T3のフィーダー層に播種し、2週間培養し、その後、皿を緩衝ホルマリンで固定し、ローダミンBで染色した。各カラムの料理は、各マウス処理群からの複製である。なお、DMBAによる治療時により大きなコロニーの数が増加し、ケラチノサイトの採取前にマウスのTPA処理が増加したコロニーの総数が増加した。略語: DMBA: 7,12-ジメチルベンツ[a]アントラセン;TPA: 12-O-テトワルト-13-アセテート.この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

図2:成体マウス由来の毛包幹細胞のフローサイトメトリーの代表的な例。簡単に言えば、単離された一次ケラチノサイトを後回しマウスの皮膚から単離し、細胞フィルターを用いて細胞破片を濾過した。単離されたケラチノサイト懸濁液は、生きた死色素および他のコントロールと共にCD49fまたはα6-インテグリン(PE)およびCD34(FITC)抗体で標識された。FITCおよびPEアイソタイプコントロール抗体(ラットIgG2akappa)は、補償目的で使用された(材料の表参照)。幹細胞は、基底表皮および毛包細胞に見られるヘミデスモソームの外部成分を認識したCD49f(PEチャネル)と、毛包幹細胞を認識したCD34(FITCチャネル)によって選択された。.a6-PE+ (右上の列、合計 5%)。右側の列は、CD34-FITCのみ、CD34-FITCおよびa6-PE細胞(二重陽性幹細胞集団)、a6-PEのみ、および染色されていない細胞の異なるケラチノサイト集団を示しています。なお、6,14に報告されているように、2つのCD34+幹細胞集団がある。 この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

図3:成体雌マウス由来の表皮細胞の一次培養に関する4つの異なる培地の比較。一次ケラチノサイトを後部マウスの皮膚から単離し、4つの異なる培具(KGM、SFM、ウィレム-EおよびMorris-2)を用いて播種のためにカウントした。同数のケラチノサイトが播種され、その一般的な形態および成長パターンについて続いた。増殖するケラチノサイトは、わずかに異なる形態を有する。KGM、SFM、およびモリス-2は、カルシウム培中の全てが14日後に最も堅牢な成長を有する。対照的に、1.4mMカルシウムとナトリウムに対するカリウムの比率が高いウィリアムズE培地で培養しても細胞は持続しない。驚くべきことに、サプリメントと20%の胎児ウシ血清を含むウィリアムズE培地は、おそらく濃縮されたウィリアムズE培地が3T3フィーダー細胞をより良く「飼料」するのに役立つため、テストされた他の培地よりもはるかに優れたケラチノサイトクローン培養をサポートしています。この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

表 1: ソリューションとメディアのレシピ。

著者は何も開示していない。