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Summary

感染中にリステリア菌は脳を植民地化する血液-脳関門を通過することができます。このプロトコルではマウスの感染臓器の細菌の植民地化を評価する方法を示します。脳実質の細菌数の定量法の全臓器灌流を実行する手順を提供しています。

Abstract

リステリア菌は、食品媒介感染症に頻繁に関連付けられて、細胞内細菌病原体です。血液脳関門 (BBB) を横断する菌、リステリア菌の能力に関するそれは生命を脅かす髄膜炎や脳炎の症状につながることができます。BBB は様々 な毒性代謝産物や感染、血液、微生物病原体から脳微小環境を保護し、したがって脳のホメオスタシスをサポートしています。メカニズムは、菌、リステリア菌血流の存在は脳の感染症が完全に理解されていませんが発生する BBB を越えしても菌、リステリア菌によって脳の感染症を研究する堅牢なモデル システムの欠如があります。脳の体内に定着したバクテリアの負担を量的に、細菌が BBB を交差しているかどうかを決定する簡単なマウス感染モデルを紹介します。この方法では動物は静脈内菌、リステリア菌に感染していたし、頚部転位続いて CO₂の露出によって人道的安楽死されました。感染した臓器を収穫前に動物の心筋灌流を行った。灌流前に、採血し、臓器ごとの細菌数やミリリットルの血液寒天プレートに血液や臓器乳剤の希釈液をめっきによって決定された形成されたコロニーの数を数えます。このメソッドは、感染菌、リステリア菌による脳を強化し、複数の細菌性病原体の調査のために容易に適応することができます新規受容体-リガンド相互作用を調査する使用できます。

Introduction

グラム陽性菌リステリア菌は通性細胞内病原体と世界的なほとんどの致命的な食品媒介病原菌の一つ。菌、リステリア菌汚染された食品の摂取は、ターゲットに主に妊娠中の女性、新生児、高齢者、免疫不全、個人¹重度侵襲性疾患ヒトでは、リステリア症に可能性があります。米国の食品由来病原体による死の主要な原因菌、リステリア菌リステリア症から致死率は 20-30%、最高のすべての食品媒介病原体²のための高.菌、リステリア菌のワクチンが存在しないと、効果的に血液脳関門 (BBB) を交配することによって遠位臓器や脳に感染する細菌の能力は生命を脅かす髄膜炎と脳³の植民地化につながる可能性があります。^,4,5,6. 細菌性髄膜炎は通常厳しいです。治療を受けるほとんどの人は回復、感染症では、子供の重篤な合併症、例えば、脳障害、難聴、または学習障害を引き起こすことができます。菌、リステリア菌は、米国⁷で髄膜炎を取得すべてのコミュニティの少なくとも 10% を占めると予測されます。

脳と髄膜に細菌の散布のための主要なルートは、血流を介してです。脳の血管の循環細菌は、脳の感染症が発生する BBB を交差することができます。BBB は、異物循環血液中から脳を保護する高度に血管のバリア システムです。血管内皮細胞は、血管^8,9の内側の表面を覆う層を構成します。菌、リステリア菌髄膜炎菌、肺炎球菌、大腸菌インフルエンザ菌b 型 (Hib) など複数の細菌性病原体にも植民地化の対応BBB の^3,4,5,6の交差によって脳。ただし、感染マウスの脳に細菌負荷を検討する際、それ以外の場合脳に細菌の負担が脳の血管に残っている細菌を表す細菌は、BBB を交差している、かどうかを決定するため重要です。したがって、マウス脳ホモジネートのコロニー形成単位 (CFU) を決定する前にすべての血液を灌流する必要は。

本研究では生体内で脳の菌、リステリア菌の感染を調べる方法をについて説明します。ここで説明する方法、菌、リステリア菌ひずみ 10403S を使用しました。菌、リステリア菌10403S は感染¹⁰のマウスモデルで全身リステリア症の研究に最も広く使用されている実験室の緊張の 1 つであります。このプロトコルはマウスの灌流が続く菌、リステリア菌の標準的な静脈注射に基づいています。マウスにおける感染のプロトコルの概略は図 1に示します。菌、リステリア菌の感染した脳と非灌流または灌流のマウスから他の臓器を採取し、細菌臓器負担が決定されます。これらの方法だけではなく感染した動物では、脳の全細菌の定着を決定する役に立ちますが BBB は、生体内で脳の侵略を仲介する菌が浸透しているかどうかを決定するために有益。この実験室のプロトコルは、次の関連機関のバイオ セーフティ委員会と動物施設の経営陣と協議実施すべきことを強調することが重要です。

Protocol

すべての動物を維持して最大のケア手順の中に不快感を最小限に抑えることで処理が。手順は、機関動物ケアおよび使用委員会ならびにすべての連邦、州、地方の法律に従って行われることです。また実験がバイオ セーフティ レベル 2 のガイドラインに従って行われることに注意してください。 1. マウス感染研究菌、リステリア菌の成長 オートクレーブの固体媒体のプレートの準備を 1 L の三角フラスコに脳心臓注入 (BHI) 寒天培地 500 mL。メディアを 56 ° C の水浴中で冷却し、最終濃度 100 μ G/ml にストレプトマイシンを追加を許可します。 メディア/シャーレの 25 mL をシャーレ プレートに注ぐ。プレートは室温 (22 oC-25 ° C) で乾燥を許可します。必要な場合、プレートを 37 ° C まで完全に乾燥で乾かすことができます。 完全ループを取得滅菌接種ループと無菌技術を使用して冷凍菌、リステリア菌のひずみ 10403S11,12 BHI メディア プラス 30% グリセロールで冷凍ストックの文化から-80 ° C のフリーザーの維持と。 BHI 寒天培地/ストレプトマイシンの菌、リステリア菌プレート シングル コロニーを分離できるようで止めた。菌、リステリア菌のコロニーを成長する (24 h に 18 h) 一晩 37 ° C のインキュベーターでプレートを配置します。 1 つを選ぶ滅菌接種ループを使用して BHI 寒天培地から菌、リステリア菌コロニー プレートし、100 μ g/mL ストレプトマイシンを含む BHI 培地 5 mL を含む滅菌試験管に植民地を接種します。 わずかに静的のインキュベーターで一晩 30 ° 傾いている菌、リステリア菌培養管を孵化させなさい。 次の日は、(BHI メディアが濁ったなります) 成長と文化の均一懸濁にように簡潔に渦の菌、リステリア菌文化を視覚的に検査します。 無菌細菌文化の 1 mL の約数を削除し、600 の光学濃度を測定 nm (外径600) 分光光度計を使用しています。メモ: 滅菌 BHI ブイヨンは、菌、リステリア菌培養の光学濃度を測定する前に読んで分光光度計の空白として使用されます。菌、リステリア菌培養を希釈もことができます (2 つに 5 倍) 光の密度を読む前に BHI で。 BHI 文化の mL あたり文化の十倍のシリアル希薄をメッキすることによって菌、リステリア菌のコロニー形成単位 (CFU) の数を決定します。これは、菌、リステリア菌培養の光学密度と文化の mL あたりの菌数との間の関係を確立する便利です。一般に、菌、リステリア菌培養の 1.0 の外径600は約 1 × 109 mL あたり細菌の CFU を等しくなります。 2. マウスの感染菌、リステリア菌の準備 24 時間動物感染前に 18 歳は 100 μ g/mL ストレプトマイシンを含む BHI 培地で菌、リステリア菌の文化を育てるし、OD600を決定/~ CFU 1 mL ステップ 1 に記載されています。注: マウス感染を事前に 1 週間一般に並べ、感染症研究を実行する前に動物施設に順応。本研究では 6-8 週間古い女性 BALB/c マウス (1 グループあたり 5 マウス) ハーバード大学医学部 BSL2 レベル動物封じ込め施設におけるバリア環境に収容された、食糧および水の自由を提供します。 菌、リステリア菌文化に基づいて各マウスに感染に必要な量を決定する、〜 CFU 細菌培養の mL あたり。細菌濃度を適切に滅菌リン酸緩衝生理食塩水 pH 7.2 (PBS) の菌、リステリア菌文化の希釈を行います。通常は 1-2 × 104細菌/動物の CFU を含む PBS の 200 μ L で静脈内投与マウスが感染しています。 100 μ g/mL ストレプトマイシンを含む BHI 寒天培地プレート 10 倍のシリアル希薄をメッキすることによって、菌の菌、リステリア菌の数を確認します。マウスあたり次のように接種した菌、リステリア菌の数を調べる一晩 37 ° C のインキュベーターでプレートを孵化させなさい。接種 (CFU) = (x の希釈倍率のコロニーの数)/mL メッキ量 (mL) × 3. マウス尾静脈注射・点滴を介して菌、リステリア菌の感染 マウスを含むケージから箱のふたと食品を取り出し、5 分間 250 W 赤外線ランプの下でケージを置きます。注: このメソッドにより拡張する尾静脈注射が簡単に実行することを確認します。 慎重に適切なサイズのマウスの尾静脈注射時に動物を安全に抑制するデバイスを抑制に動物を配置します。 菌、リステリア菌接種 (手順 2.2) をミックスし、26 G 針装備 1 mL シリンジに接種を読み込みます。 マウスの外側尾静脈を見つけ、アルコール パッドまたは 75% エタノール スプレーを使用して、注射部位を洗浄します。 ゆっくりマウスを菌、リステリア菌懸濁液 200 μ L で 26 G 針とシリンジを使用して外側尾静脈に挿入します。 コットン ガーゼを使用して、簡単に任意の出血を止めるための注射部位に圧力を適用して、新しいケージに動物を配置します。注: は、注入して適切なラベルが付いたケージをマークにマウスのすべてのこのプロセスを実行します。菌、リステリア菌接種の後注入濃度を決定するには、手順 2.3 接種の残りの量を使用して.静脈内投与前および投与後の接種のサンプルから測定した平均 CFU マウスあたり菌、リステリア菌感染菌が報告されます。 感染している動物を毎日監視し、病気の明白な兆候に注意してください (例えば、フリルの毛皮、背を丸めて姿勢、低迷の動き、体重減少)。大幅 72 h 後感染症 (例えば、 24、48 時間後) 研究から前に瀕死の状態と人道的犠牲動物を削除します。感染後 72 時間で残りのすべての動物が犠牲になるまで日々 の監視を続けます。注: BALB/c マウスで菌、リステリア菌ひずみ 10403S の 50% 致死量 (LD50) は ~ 1-2 × 104 CFU/動物です。LD50用量このプロトコルを使用して菌、リステリア菌の感染マウスは前述のように、病気の兆候を示すことができるし、研究者は感染後 72 時間を術後感染に屈することを開始するマウスを期待できます。 4. 解剖と菌、リステリア菌に感染マウスの心筋灌流 感染後 72 時間 (または目的の時間前の時点で)、安楽死、機関動物倫理委員会の承認、頚部転位続いて CO2窒息などのプロトコルを使用して感染したマウスです。注: 血のコレクションが実行される場合は、頚部転位を実行中、血管の断裂を最小限に抑えます。 マウスを持って足を収縮応答の不在によって安楽死されてを確認します。注: 心筋灌流を実行する場合は、ボリューム 4 mL/分の流量で自動ポンプ/灌流システムを設定します。 郭清パンにその背中に動物を置き、腹部の毛皮/皮膚表面の 75% エタノールを適用します。 はさみを使用して、腹壁の切開をするし、胸郭の下だけ切開を展開します。 横隔膜や内臓を公開します。注: 任意の内臓をずたずたに引き裂いたないように気をつけてください。 横隔膜を切断することによって胸腔内を開き、心臓の左心室を公開する両側の肋骨をカットします。 鈍い鉗子を使用して、優しく心と挿入 21 G 蝶針左心室に灌流システムに接続し、10 mM エチレンジアミンを含む 2 mL チューブに採血 (~0.2 mL) 右心房を慎重にカットを把握します。酸凝固を防ぐために (EDTA)。マウスにおける心筋灌流の模式図を図 2に示します。注: 灌流が行わない場合は、血液 1 mL 注射器を用いた心臓穿刺によって収集およびすぐに譲渡でき 10 ミリメートルの凝固を防ぐために EDTA を含む 2 mL チューブに。L. リステリア菌の感染器官、説明 (ステップ 5.1) として収穫されます。 灌流を開始し、15-20 mL 10 mM EDTA を含む PBS の 4 分のための動物を灌流します。注: は、血と PBS EDTA 溶液を介して右心房と郭清の鍋に観察することによって血流を評価します。脳と肝臓は、確実に収穫器官とは、循環血液から細菌が残り完全な灌流後湯通しに表示されます。 5. 器官の収穫および細菌負荷の決定 次の血流、血管と靭帯を慎重に外して収穫器官 (例えば肝臓、脾臓)、臓器を含む滅菌冷 (4 ° C) PBS の 5 mL 滅菌 15 mL の円錐管に別々 に配置。さらに処理が発生するまで、氷のサンプルを格納します。 脳を収穫、はさみを使って耳の後ろ頭の首をはねるし、頭皮皮膚間正中線を動物の目をカットします。必要な場合は、頭蓋骨に対して押されたはさみを維持する余分な組織をトリムします。 優しく後頭 (脊髄が通る頭蓋底の穴) にはさみの先端を挿入し、両側頭蓋骨に横方向に切る。 優しくカット頭蓋骨間を正中線に, 横方向の圧力を適用することを確認されている齧歯動物の目。脳の摂動を避けるため、脳組織とハサミの間の最低の接触を維持します。 ファインチップ鉗子を使って脳を公開し、脳の下面と脳を削除する頭蓋底のヘラを配置頭蓋骨を開きます。注: 脳神経線維の断裂でこの結果します。 慎重に脳を 5 mL の滅菌冷 PBS を含む 15 mL の円錐管に転送します。 マウスの死骸を破棄し、残りの動物のこの手順を繰り返します。注: すべての器官を収穫されているプロシージャの部分をきれいに、細菌負荷を決定する器官の均質化の準備します。 きれいにし、先端を挿入し、ホモジナイザーを実行して 10 秒で順番に 5% 漂白剤、滅菌水、エタノール 75%、別の 15 mL の円錐管に含まれる滅菌水各キャビネット、バイオ セーフティにおける配置組織ホモジナイザーの先端を滅菌します。 感染した脳を均質化 (~ 20 設定 s 6、最大 rpm) 目に見える組織片がなくなるまで 15 mL の円錐管に。 きれいな細菌を防ぐためにホモジナイザー手順 5.3 で説明したを引き継ぐ次の器官のサンプルを汚染。 他のすべての器官 (例えば肝臓、脾臓) の均質化プロセスを実行します。 均質化のプロセスが完了すると、さらに使用するまでステップ 5.3 およびストアの説明に従って、ホモジナイザーをきれい。 滅菌 PBS で臓器ホモジェネートの十倍のシリアル希薄を準備し、臓器ごと CFU を決定する BHI 寒天培地/ストレプトマイシン プレートに希釈液をプレートします。注: 同様のメソッドは実行血の mL あたり CFU を決定します。 すべての希釈は、メッキ後、一晩 37 ° C の定温器にプレートを転送します。 次の日は、臓器ごとの細菌の総数または血の mL を次のように決定する各プレートのコロニーの数をカウントします。CFU/オルガン = (x の希釈倍率のコロニー数) 磨砕液 mL メッキ x 5/CFU/mL の血液 (x の希釈倍率のコロニーの数) = ミリリットルの血液をメッキ/

Representative Results

脳は非常に血管し、血液3,13内にあるセル型に感染する菌、リステリア菌が知られています。記述のプロトコルを使用して、マウスの脳の感染症につながる血液-脳関門 (BBB) を横断する菌、リステリア菌の能力を発揮します。細菌が生体内でBBB 越えているかどうかするには、マウスの血液の血流が脳の細?…

Discussion

菌、リステリア菌は、人間の生命を脅かす髄膜脳炎を引き起こすことができます。先行研究では、血液脳関門 (BBB) を横断して脳を植民地化する細菌の能力を実証しています。感染時脳侵略の 3 つのルートが提案されている: 細菌によって BBB、細菌を引き起こす菌、リステリア菌の菌株によって単核球³、および軸索移行中含まれているステルス輸送の浸透を直?…

Materials

Brain Heart Infusion media	Becton Dickinson	237200
Streptomycin sulfate	Amresco	0382-50G
Petri dishes	VWR	25384-342
Glycerol	VWR	97062-832
IKA T18 ULTRA-TURRAX Basic Homogenizer	IKA	3352109	Model: T18BS1
Spectrophotometer	Beckman Coulter	DU 800 series
BALB/c mice	Jackson Laboratory	Model #000651
1 mL syringes	Becton Dickinson	309659
26-gauge needles	Becton Dickinson	305115
21-gauge butterfly needles	Becton Dickinson	367281
Ethylenediaminetetraacetic acid	Sigma-Aldrich	60004
15 mL conical tubes	VWR	21008-918
Round-bottom test tubes	VWR	60819-546
Phosphate-buffered saline	Corning	46-013-CM
Stainless steel spatula	VWR	82027-520
Stainless steel scissors (6.5 in)	VWR	82027-592
Stainless steel scissors (4.5 in)	VWR	82027-578
Stainless steel blunt forceps  (4.5 in)	VWR	82027-440
Stainless steel fine tip forceps  (6 in)	VWR	82027-406