方法論記事

生体内でシルク/AAV 膜を用いた光遺伝学的タンパク質の発現

DOI：

10.3791/58728

⸱

2019年2月26日

 ,  , 
1Vollum Institute, Oregon Health and Science University, 2Harvard Medical School

この記事について

サマリー

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絹フィブロイン膜を用いた脳にウイルス発現ベクターを配信する方法を紹介します。このメソッドは、シルク/AAV 被覆光ファイバー、光ファイバー、・頭蓋の windows を使用しての表現のベクトルのターゲットを絞った配信できます。

要約

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順番にドライブ行動出力のプロセス情報を大きく操作およびニューロンの生体内の活動を監視するための光学的手法の最近開発されたに助けられたがどのように神経回路を理解するクエスト。これらの種類の実験の 2 つの主要なコンポーネントに頼る: 脳に光アクセスを提供する 1) 植込み型デバイスと神経活動の読み出しを提供したり神経細胞の興奮を変更 2) 光感応蛋白質。光感応蛋白質を表現する方法の数がありますが、式は、遺伝的、解剖学的、および時間の精度で制御できるためウイルスのベクトルの脳定位固定装置の注入は現在最も柔軟なアプローチ。ウイルスのベクトルの偉大なユーティリティ、にもかかわらず光インプラント ポーズのサイトに多くの課題にウイルスを提供します。定位ウイルス注射手術手術時間を高め、研究のコストは増大し動物の健康に危険をもたらす要求しています。注射器、高力価ウイルスの塊の突然の配信によって引き起こされる免疫原性炎症、周囲の組織を物理的に損傷することができます。小地域をターゲットにする場合の光インプラントと注射の整列は特に難しい脳の深い。これらの課題を克服するために、絹フィブロインとアデノ随伴ウイルス (AAV) ベクターから成るフィルムと光学インプラントの複数種類をコーティングする方法をについて説明します。フィブロイン、カイコ、繭由来のポリマーをカプセル化でき、生体分子を保護、水溶性フィルムからセラミックスに至るまでの形態に処理することができます。脳に注入、シルク/AAV コーティングは運転式が必要な場所に正確に光学素子と周囲の脳との間のインターフェイスでウイルスをリリースします。このメソッドは、簡単に実装し、大きく生体内神経回路機能の研究を促進することを約束します。

概要

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過去 10 年間は、監視および神経活動1を操作するために設計された光に敏感な蛋白質の爆発を生産しています。ウイルスは、脳のこれらの光遺伝学的ツールを表現するための比類のない柔軟性を提供しています。トランスジェニック動物と比較して、ウイルスが生成し、輸送、保管、最新の光遺伝学的ツールの高速実装を許可するはるかに簡単。式は異なる神経細胞の集団を遺伝的対象とすることができます、逆行の輸送用に設計されたウイルスは神経接続2に基づいた式を対象にも使用できます。

ウイルスは通常時間がかかり、困難なことができる定位注射で紹介しています。小領域を正確にターゲットは、多くの注射が必要ですが幅広い分野に式を頻繁運転困難。また、光デバイス、光生体内で提供する脳に植えられたその後ウイルス注入で、インプラントを正しく配置する必要があります。ここでは、絹フィブロイン膜3を使用して注入デバイス周りの組織にウイルスのベクトルを提供するための簡単に実装手法について述べる。絹フィブロインは市販、神経組織をよく容認を様々 な特性を持つ素材を生成する使用ことができます。絹フィルム マイクロインジェクション ピペットのような一般的な検査機器を使用してインプラントに適用することができます。 またはピペットを手します。シルク/AAV フィルム 2 つの外科プロシ....

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プロトコル

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次のガイドライン、米国 NIHのケアおよび実験動物の使用のためのガイドで説明されている動物のケアに関するハーバード大学常任委員会によって承認されたプロトコルに従い動物を含むすべての実験を行った。どちらの性別 (6-15 週齢) の大人の c57bl/6 マウスは、すべての実験に使用されました。

1. 水溶液の絹フィブロインを取得します。

  1. 準備または水溶液絹フィブロイン (5 7.5 %w/v) を購入します。

2. 式の AAV のベクトルを持つ水性シルクをミックスします。

  1. 光遺伝学的タンパク質や好みの蛍光指示薬を駆動する AAV 発現ベクターを選択します。
    注: シルク/AAV インプラントまだ堅牢な式を運転中に適用する必要がありますの量を最小限に抑える株式価 AAV (在庫通常ベクター コアから得られた抗体は周辺 10 ~13 gc/mL) お勧めします。
  2. 直前のコーティングのインプラント、AAV の因数を解凍し、5 7.5% 水溶液絹フィブロイン (この混合物があるというシルク/AAV と組み合わせます。200 μ L PCR チューブに水溶性フィブロイン、AAV を直前のアプリケーション (頭蓋 windows 使用 1:4) 1:1 の比率で混ぜます。フィブロイン、AAV を徹底的にミックスする....

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結果

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式の運転でシルク/AAV の映画の成功を評価するためには、動物に注入後 2-3 週間を灌流し、関心の領域から脳切片を作製しました。光の蛍光タグ付きタンパク質 (ChR2 YFP) の蛍光画像には、式 (図 1) の範囲のメジャーが用意されています。典型的な光ファイバー (230 μ m 径) は 200 を容易に収容することができますシルク/AAV の nL。練習では、実験者は注入された線維 (図 5) の先端周り信頼性の高い表現を実現できます。

シルク/AAV コーティング頭蓋 windows によって駆動式を評価するために注入後 7-10 日から始まるイメージングを開始します。可視化、2 光子イメージングを使用しているが、蛍光を CCD イメージングなど他の方法も使えます。コーティングされた頭蓋窓 2 つの可能な問題は不十分な表現.......

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ディスカッション

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シルク/AAV の optogentic 蛋白質の表現を対象とするは、現在使用しているアプローチの限界を克服します。多くの研究は、正常に光遺伝学的蛋白質を表現する AAV 注射を使用して、式光ファイバーの先端にテーパーの繊維の長さの周りの地域に、GRIN レンズの表示領域に合わせて挑戦です。光学部品、光式芯ズレ、ため定位注射が信頼性の高い、することができ、多くの実験は失敗します。ここで述べる方法をラベリング シルク/AAV は、この問題を解決します。2 番目の手術手順を排除することによって、場合によっては 2 回目の手術の必要性を排除することで、手順も簡単になります。それは困難な頭蓋窓下に広範な表現を取得するウイルスを使用することができ、実験者は通常、複数の場所でウイルスを注入する長い手術を実行します。シルク/AAV コーティング頭蓋窓単に大規模な皮質領域に広範な表現を取得する機能は、多くの侵襲的な注射の必要性を排除する簡素化です。

シルク/AAV メソッドのもう一つの潜在的な利点はそれがウイルス注射と比較して神経組織における以下の炎症を誘発する可能性があります。(ただし、このよう.......

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開示事項

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著者が明らかに何もありません。

謝辞

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著者試薬と有用なガイダンス、および生体内イメージングのサバティーニ B. と c. ハーヴェイのラボ イラスト j. バスケス、d. カプラン、C. オイゲンプレダを感謝したいです。M. Ocana ・一部、国立研究所の神経疾患として神経イメージング研究センター部分で支え神経イメージング センターによって可能になった顕微鏡とストローク (NINDS) P30 コア センター (NS072030) を与えます。この仕事を受けました GVR 帰れない家族財団、ナンシー Lurie マーク財団と NIH の補助金、NINDS R21NS093498、U01NS108177、W.G.R に組織プラスミノーゲンアクテベータ R35NS097284、F32NS101889 C.H.C. に NIH ポスドク研究員プログラム

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
水性シルクフィブロインシグマ5154-20MLフィルムを作るための水性シルクフィブロイン (5% w/v)
シルクを堆積させるマイクロインジェクター/AAVドラモンド3-000-207ナノジェクト III ナノリットルインジェクター
インプラントを保持するマニピュレーターナラシゲMM-33マイクロマニピュレーター
シルクの堆積物を視覚化するステレオスコープAmScopeSM-6TX-FRL3.5X-45X リングライト付き三眼関節ズーム顕微鏡
インプラントを保管するための真空チャンバーAblazeN/A3.5クォート真空真空脱気チャンバー
オプション、保管用インプラントホルダーN/AN/A既製の光ファイバーを収納するには、フェルールの直径よりもちょうど大きい直径の~4mmの深さの穴をプラスチックブロックにドリルで穴を開けます。
光ファイバーThorlabsFT200EMTØ200 µm ファイバーインプラント用コアマルチモード光ファイバー
フェルールKientecFZI-LC-230LC ファイバーインプラント用ジルコニアフェルール
慢性ファイバーインプラント製造のための様々な材料様々なN/A詳細な手順については、Ung K, Arenkiel BR. 脳組織の慢性光遺伝学的刺激のための光ファイバーインプラントを参照してください。視覚化実験ジャーナル:JoVE。2012年(68)。
テーパーファイバーインプラントオプトジェニックスラムダ-Bテーパーファイバーインプラント
GRINレンズGoFotonCLH-100-WD002-002-SSI-GF3GRINレンズ
小さなガラス頭蓋窓ワーナー64-0726 (CS-3R-0)小さな丸いカバーガラス、#0の厚さ
大きなガラスの頭蓋窓ワーナー64-0731(CS-5R-0)小さな丸いカバーガラス、#0の厚さ
頭蓋窓を製造するための様々な材料様々なN/A詳細な手順については、Goldey GJ et al. Removable cranial windows for longterm imaging in awake mice. を参照してください。ネイチャープロトコル。2014年11月;9(11):2515。

参考文献

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  1. Klapoetke, N. C., et al. Independent optical excitation of distinct neural populations. Nature Methods. 11 (3), 338-346 (2014).
  2. Tervo, D. G., et al. A Designer AAV Variant Permits Efficient Retrograde Access to Projection Neurons. Neuron. 92....

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