方法論記事

生体内でシルク/AAV 膜を用いた光遺伝学的タンパク質の発現

DOI：

10.3791/58728

⸱

2019年2月26日

 ,  , 
1Vollum Institute, Oregon Health and Science University, 2Harvard Medical School

この記事について

サマリー

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

絹フィブロイン膜を用いた脳にウイルス発現ベクターを配信する方法を紹介します。このメソッドは、シルク/AAV 被覆光ファイバー、光ファイバー、・頭蓋の windows を使用しての表現のベクトルのターゲットを絞った配信できます。

要約

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

順番にドライブ行動出力のプロセス情報を大きく操作およびニューロンの生体内の活動を監視するための光学的手法の最近開発されたに助けられたがどのように神経回路を理解するクエスト。これらの種類の実験の 2 つの主要なコンポーネントに頼る: 脳に光アクセスを提供する 1) 植込み型デバイスと神経活動の読み出しを提供したり神経細胞の興奮を変更 2) 光感応蛋白質。光感応蛋白質を表現する方法の数がありますが、式は、遺伝的、解剖学的、および時間の精度で制御できるためウイルスのベクトルの脳定位固定装置の注入は現在最も柔軟なアプローチ。ウイルスのベクトルの偉大なユーティリティ、にもかかわらず光インプラント ポーズのサイトに多くの課題にウイルスを提供します。定位ウイルス注射手術手術時間を高め、研究のコストは増大し動物の健康に危険をもたらす要求しています。注射器、高力価ウイルスの塊の突然の配信によって引き起こされる免疫原性炎症、周囲の組織を物理的に損傷することができます。小地域をターゲットにする場合の光インプラントと注射の整列は特に難しい脳の深い。これらの課題を克服するために、絹フィブロインとアデノ随伴ウイルス (AAV) ベクターから成るフィルムと光学インプラントの複数種類をコーティングする方法をについて説明します。フィブロイン、カイコ、繭由来のポリマーをカプセル化でき、生体分子を保護、水溶性フィルムからセラミックスに至るまでの形態に処理することができます。脳に注入、シルク/AAV コーティングは運転式が必要な場所に正確に光学素子と周囲の脳との間のインターフェイスでウイルスをリリースします。このメソッドは、簡単に実装し、大きく生体内神経回路機能の研究を促進することを約束します。

概要

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

過去 10 年間は、監視および神経活動1を操作するために設計された光に敏感な蛋白質の爆発を生産しています。ウイルスは、脳のこれらの光遺伝学的ツールを表現するための比類のない柔軟性を提供しています。トランスジェニック動物と比較して、ウイルスが生成し、輸送、保管、最新の光遺伝学的ツールの高速実装を許可するはるかに簡単。式は異なる神経細胞の集団を遺伝的対象とすることができます、逆行の輸送用に設計されたウイルスは神経接続2に基づいた式を対象にも使用できます。

ウイルスは通常時間がかかり、困難なことができる定位注射で紹介しています。小領域を正確にターゲットは、多くの注射が必要ですが幅広い分野に式を頻繁運転困難。また、光デバイス、光生体内で提供する脳に植えられたその後ウイルス注入で、インプラントを正しく配置する必要があります。ここでは、絹フィブロイン膜3を使用して注入デバイス周りの組織にウイルスのベクトルを提供するための簡単に実装手法について述べる。絹フィブロインは市販、神経組織をよく容認を様々 な特性を持つ素材を生成する使用ことができます。絹フィルム マイクロインジェクション ピペットのような一般的な検査機器を使用してインプラントに適用することができます。 またはピペットを手します。シルク/AAV フィルム 2 つの外科プロシージャのための要件を排除し、ウイルスによる発現は光のインプラントに正しく配置されていることを確認します。結果の式は、繊維と定位注射よりも繊維のトラックに沿って以下の不要な式の結果の先端に制限されます。

小さな繊維の先端に対象式に加え、シルク/AAV 映画を広範なドライブを使用できます (> 直径 3 mm) 頭蓋窓下に皮質表現。センサー蛍光活動 2 光子励起イメージング体内運転感覚と認知処理における神経活動の役割を評価するため不可欠なツールとなっています。しかし、制服を運転する多くの実験者の広範な皮質上式で複数の注射を実行します。これらの注射は非常に時間がかかることができ、ビューのフィールド間で一貫性のない表現につながることができます。対照的に、頭蓋 windows のシルク/AAV コーティングが製造し、手術に必要な時間を大幅に削減、最も著しくドライブ式数百ミクロン皮質表面の下の非常に簡単です。

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プロトコル

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

次のガイドライン、米国 NIHのケアおよび実験動物の使用のためのガイドで説明されている動物のケアに関するハーバード大学常任委員会によって承認されたプロトコルに従い動物を含むすべての実験を行った。どちらの性別 (6-15 週齢) の大人の c57bl/6 マウスは、すべての実験に使用されました。

1. 水溶液の絹フィブロインを取得します。

  1. 準備または水溶液絹フィブロイン (5 7.5 %w/v) を購入します。

2. 式の AAV のベクトルを持つ水性シルクをミックスします。

  1. 光遺伝学的タンパク質や好みの蛍光指示薬を駆動する AAV 発現ベクターを選択します。
    注: シルク/AAV インプラントまだ堅牢な式を運転中に適用する必要がありますの量を最小限に抑える株式価 AAV (在庫通常ベクター コアから得られた抗体は周辺 10 ~13 gc/mL) お勧めします。
  2. 直前のコーティングのインプラント、AAV の因数を解凍し、5 7.5% 水溶液絹フィブロイン (この混合物があるというシルク/AAV と組み合わせます。200 μ L PCR チューブに水溶性フィブロイン、AAV を直前のアプリケーション (頭蓋 windows 使用 1:4) 1:1 の比率で混ぜます。フィブロイン、AAV を徹底的にミックスするソリューションに数回軽くピペットします。
  3. 氷の上のシルク/AAV の混合物は使用前に保ちます。

3. 作製とシルク/AAV コーティング デバイスのストレージの機器を準備します。

  1. 被覆光ファイバーの屈折率分布 (笑) レンズ (図 1 2) 機器を購入します。
    1. 安定したフェルール ホルダーを構築します。セラミック フェルールを保持するには、¼"シート アクリルのブロックで 1.25 mm の穴をドリルします。場所でフェルールを保持する側からのセットのネジを挿入する穴をタップします。
      注:この目的のため、クランプを使用できます。
    2. 光ファイバー (脳定位固定装置またはその他の精度マイクロマニピュレーター) を移動するサブミリ精度を有するマニピュレーターを位置します。
    3. ガラスシリンジの位置に安定したホルダーを組み立てます。
    4. 堅実を使用して、光ファイバーとシルクの液滴を視覚化します。
    5. 光ファイバーを照らす光源を配置します。
  2. 頭蓋ウィンドウ (図 3) をコーティングする装置を準備します。
    1. 任意の P10 pipettor を選択します。
    2. 蓋付きコンテナーを取得します。
      注: シリコーンの下で任意のコンテナーが示唆された、柔らかい底を容易に頭蓋の windows を持ち上げます。
  3. 完成したインプラント (図 4) を格納する機器を準備します。
    1. 小型 (1 5 L) 真空チャンバーを取得します。
    2. 4 ° C の冷却装置でインプラントを格納する領域があることを確認します。

4. シルク/AAV フィルムをデバイスに適用します。

  1. 光ファイバー先端にドライブ焦点式に光ファイバーをコーティング
    1. 前述4として慢性的な繊維インプラントを準備します。
    2. 使用前にリンスはエタノール、インプラントし、確実に超純水と光ファイバーはきれい。
      注: 絹フィルムはガラスの表面をきれいにより確実に従います。
    3. フェルールを保持するデバイスを準備します。典型的な 1.25 mm 径フェルール、1/4 インチ ~1.3 で、透明なアクリル ブロックの使用は mm 穴とネジ穴 (図 1 a) の場所にしっかりとインプラント側から入力をタップします。
    4. 脳定位固定装置 (またはサブミリ精度で任意の操作ソリューション) にフェルール ホルダーの装備、マイクロインジェクター マウント。上記のガラスシリンジ フェルール ホルダーを置き、下からシルク/AAV の混合物を適用します。
      注: これは上から大量のアプリケーションが先端に制限されなかったシルク/AAV になるためにです。ただし、しかし、多くの小さな連続ボリューム上からまたは下のアプリケーションは、先端に限られている (我々 は下から適用することを好む) AAV/シルク預金を生成できます。
    5. キャピラリー ホウケイ酸ガラスから標準的な頭蓋内インジェクション ピペットを引き出します。
      1. やすくには
      2. 希望の直径のきれいなフラット チップの注入ヒントを生成、それぞれの手で 1 つのピペットなどを保持し、必要な休憩場所で他のピペットをスコアに 1 ピペットに厚くテーパー部を使用します。
      3. 鋸の動き (ガラス-ガラスのスコアリング方法) で前後をこすり。
      4. ピペットを得点した後に、決別を達成するために他のピペットのボディと得点のピペットの先端に穏やかな圧力を適用されます。
    6. 光面の明確なビューを提供する万国実体写真を配置します。
      注: 倍率は光ファイバーの顔上インジェクション ピペットを正確に配置するための十分なはずです。
    7. 下向きの光ファイバーの脳側のホルダーに繊維のインプラントを挿入します。
    8. シルク/AAV のソリューションは、任意の標準的な頭蓋内注入5に関してはインジェクション ピペットをロードします。ピペットの目詰まりに起因する損失に対応する余分な 〜 30% プラス、作られているインプラントの数に必要な金額をロードします。たとえば、10 のインプラントが行われる場合 100 nL 預金を読み込んで、~1.3 μ L を撤回します。
      注: ピペットを詰まらせることができますの噴出の間にピペット チップでシルク/AAV の乾燥があります。大径のピペット (50-100 μ m) が目詰まりしにくいです。下駄は、湿紙のワイプまたはアルコール綿棒でピペットの先端を優しくブラッシングで外れていることができます。
    9. 触れる、またはほぼ光ファイバーの表面の中心に触れるまで、インジェクション ピペットを操縦します。シルク/AAV ソリューションの 10-20 nL を取り出します。ピペットを撤回します。
      注: 配信レートは、重要ではありませんが、典型的な率は 5-20 nL/s。
    10. フラット フィルム 〜 1 分以内に乾燥する液体のドームのように平らな面にシルク/AAV の塊を観察(図 1 b)。
    11. 手順 4.1.9-4.1.10 シルク/AAV の希望の金額まで堆積 (20-200 nL ほとんどのアプリケーションのための合計) を繰り返します。複数のインプラントを準備するとき 1 つインプラントにシルク/AAV を適用し、コートに戻る前に他のインプラントに移動最初に。
    12. 1 h は、インプラントを移動する前に乾燥を可能にします。
    13. ~ 125 Torr (で-25 宿泊の真空乾燥。Hg)、4 ° C真空チャンバー内に全体フェルール ホルダーを置くことによってこれを行います。
    14. 高倍率の顕微鏡の下で得られた絹フィルムの位置や形状を評価します。フィルムが光ファイバー表面の先端に限られていることを確保するため、比較的薄く (> 100 μ m)、および対称 (図 1)。
      注: 大規模または非対称のシルク/AAV 映画を注入 (図 1) の中に繊維から取り除く場合があります。問題の最も一般的な原因は、多くの小さなボリュームの逐次適用ではなく、単一の大きなボリュームのアプリケーションから発生します。
  2. コーティング テーパ光ファイバーを光軸に沿ってドライブ式
    1. テーパ光ファイバー インプラントを入手し、インジェクター (図 2 a) に直角になるように、テーパー光ファイバーが横方向に配置されていることを除いて、手順 4.1.2-4.1.8 を実行します。テーパー光ファイバー上のインジェクターを配置します。
      注: は、表面張力をインジェクション ピペットに戻ってジャンプまたはテーパー光ファイバーに移行する水滴が発生する傾向があるので、課題を追加テーパファイバー ポーズに液滴を読み込みします。この問題を克服するインジェクション ピペットが詰まらせるリスクが増加することも小さくインジェクション ピペット (30-50 μ m 径)。表面張力により液滴表面面積の領域に付着する傾向があるので、最適なインジェクション ピペット サイズ テーパー光ファイバーと時折詰まらせるのため、自分の許容範囲のサイズに依存です。
    2. テーパの初めに光ファイバーの側面に対してシルク/AAV インジェクション ピペットを配置します。インジェクション ピペットは、光ファイバーを触れているかどうかを確認します。
    3. 20 を取り出しシルク/AAV の nL をコーティング プロセスを開始します。液滴が光ファイバーを遵守し、繊維/ピペットのインターフェースのままを確認します。シルク/AAV 乾燥としてファイバー先端の終わりに向かって液滴を優しく芯 (~ 45 s)。注入ピペット ピペット チップの目詰まりを避けるために乾燥の液滴との接触を保ちます。
      注: 各預金テーパファイバー (図 2 b) の約 400 μ m をコートする必要があります。
    4. 最初の塊は、ほぼ完全に乾燥している、別の 20 をイジェクト nL コンティニュのテーパーに沿って液滴をウィッキングします。
      注: 液体のシルクに準拠します乾燥シルク ピペットと液滴のアンカーの一方の端は、テーパに沿って移動します。
    5. シルク/AAV の少量を取り出しとテーパの側をソリューションを徐々 に引くことによって 4.2.4 のステップを繰り返します。5-6 噴出で 2.5 mm のテーパー面を走査する十分です。
    6. 繊維のすべての辺の周囲より一貫した式をドライブするには、光ファイバーを回転させるし、手順 4.2.2-4.2.5 を繰り返して、シルク/AAV の希望の金額を預託されています。
    7. 吊り鎖の乾燥した絹/AAV を超えた先端、慎重にストランドをはさみでカットか戻ってストランドを曲げるし、ファイバーのテーパに付着する放出ピペットを使用します。
    8. 1 h は、インプラントを移動する前に乾燥を可能にします。
    9. 4 ° C で真空乾燥一晩全体フェルール ホルダーは、真空チャンバー内に配置できます。
    10. 高倍率の顕微鏡の下で得られた絹フィルムの位置や形状を評価します。
      注: 映画は制服に完全にする必要はありませんが、バンプ注入 (図 3) の間に周囲の組織への損傷を最小限に抑えるために、ファイバーの表面を越えて以上 100 μ m を拡張する必要はありません。フィルムのサイズを最小限に抑えるため、後続の預金を行う前に各液滴が完全に乾くことが重要です。
  3. コーティング GRIN レンズをインプラントします。
    1. GRIN レンズ6,7を取得し、手順 4.1.2-4.1.8 を繰り返します。インジェクターは、上記マウントできます。
    2. 単一の放出 (1.0 mm 径レンズ用 1 μ L) にシルク/AAV を入金します。
      注: これは、レンズの表面に付着、均一な膜 (100-200 μ m 厚) を生成する乾燥液体のドームになります。ただし、単一の大規模な放出がない均等に乾燥、GRIN レンズの端に近い厚いフィルムを作り出すことを試みる複数小さい液滴 (100-200 nL) を堆積 (入金前に乾燥する各液滴が可能レンズの表面の中央に次には) フィルムが視野の中心に式を駆動することを確認します。
    3. 1 h は、インプラントを移動する前に乾燥を可能にします。
    4. フィルムがレンズの表面を覆うように高倍率の顕微鏡の下で得られた絹フィルムの位置や形状を評価します。
  4. 頭蓋窓からすをコーティング
    1. 準備のガラスの付着の 2 つの 3 mm 径で頭蓋 windows ラウンド coverslips (第 1 厚さ) 光学接着剤と 1 つの 5 mm 径ウィンドウ (詳細については、ゴールディら20148を参照してください)。
    2. シルク: ウイルス映画の絹の総量を減らすために 1:4 の割合でミックスします。絹の余分な量は注入後頭蓋窓下には溶解しません。滴定実験比および目的の発現プロファイルを与える量を確認する必要があります。
    3. 手のピペット 3 mm (脳向き) カバーガラスの表面に 5 μ L の液滴。液滴は全体のガラス表面 (図 3) をカバーする広がる必要があります。
    4. 2-3 h は、ウィンドウを移動する前に乾燥を可能にします。

5. シルク/AAV コーティングのインプラント

  1. (図 4 a) を使用する前に冷却真空デシケータ (4 ° C ~ 125 Torr) でシルク/AAV コート光ファイバーを格納します。
  2. 注入後完全に溶解する大きな絹フィルム真空下で保存が失敗するように頭蓋窓と真空下で GRIN レンズを格納しないようにします。インプラント頭蓋 windows とにやにや笑いレンズの乾燥、直後後や製造大気圧および 4 ° C で保存されている場合の日以内

6. 注入デバイス

  1. インプラント手術のため前述4として動物を準備します。
    1. 簡単に、ケタミン ・ キシラジン 100/10 mg/kg の腹腔内注入マウスを麻酔し、穏やかなつま先ピンチを使用して麻酔の深さを確認します。インプラント部の頭蓋骨を削るし、きれいにヨードとアルコール頭皮。
    2. 脳定位固定装置で動物をマウントし、酸素とイソフルラン (1-2%) の混合物を用いた麻酔を補います。関心の領域に頭皮の切開をするし、開頭術、インプラントを収容できる大きさを実行します。
  2. インプラント光ファイバー9と microendoscope は、以前公開された手順に従って10をレンズします。ハンドル インプラント、注意して, 不完全な開頭手術することによって頭蓋骨の端に引くインプラント シルク/AAV 預金をノックすることができます。ゆっくりと脳にインプラントを下げる (~ 2 mm/分)。
  3. インプラント頭蓋 windows8を以前説明したよう。ウィンドウのコーティング面に触れるし、強制経口投与を実行している場合、これはウイルスを洗い流すことができる流体でウィンドウを洗浄を避けるためしません。最大の表現を達成するために、痛覚を実行します。

7. 式の評価とトラブルシューティング

  1. 2 ~ 3 を許可するウイルス発現タンパク質の発現を評価する式をドライブし、リン酸の 4% パラホルムアルデヒドで intracardial 潅流を実行するウイルスの週間バッファー蛍光の食塩11とプロセス脳組織顕微鏡12。
  2. 光の蛍光タグ付きタンパク質の発現パターンをイメージさせる蛍光顕微鏡を使用して、式を評価します。
  3. 表現のレベルが不足している場合は、シルク/AAV コーティングの容量を高めるか、または可能であれば高い力価のウイルスを使用してコーティングのウイルスの量を増やします。

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結果

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式の運転でシルク/AAV の映画の成功を評価するためには、動物に注入後 2-3 週間を灌流し、関心の領域から脳切片を作製しました。光の蛍光タグ付きタンパク質 (ChR2 YFP) の蛍光画像には、式 (図 1) の範囲のメジャーが用意されています。典型的な光ファイバー (230 μ m 径) は 200 を容易に収容することができますシルク/AAV の nL。練習では、実験者は注入された線維 (図 5) の先端周り信頼性の高い表現を実現できます。

シルク/AAV コーティング頭蓋 windows によって駆動式を評価するために注入後 7-10 日から始まるイメージングを開始します。可視化、2 光子イメージングを使用しているが、蛍光を CCD イメージングなど他の方法も使えます。コーティングされた頭蓋窓 2 つの可能な問題は不十分な表現...

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ディスカッション

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

シルク/AAV の optogentic 蛋白質の表現を対象とするは、現在使用しているアプローチの限界を克服します。多くの研究は、正常に光遺伝学的蛋白質を表現する AAV 注射を使用して、式光ファイバーの先端にテーパーの繊維の長さの周りの地域に、GRIN レンズの表示領域に合わせて挑戦です。光学部品、光式芯ズレ、ため定位注射が信頼性の高い、することができ、多くの実験は失敗します。ここで述べる方法をラベリング シルク/AAV は、この問題を解決します。2 番目の手術手順を排除することによって、場合によっては 2 回目の手術の必要性を排除することで、手順も簡単になります。それは困難な頭蓋窓下に広範な表現を取得するウイルスを使用することができ、実験者は通常、複数の場所でウイルスを注入する長い手術を実行します。シルク/AAV コーティング頭蓋窓単に大規模な皮質領域に広範な表現を取得する機能は、多くの侵襲的な注射の必要性を排除する簡素化です。

シルク/AAV メソッドのもう一つの潜在的な利点はそれがウイルス注射と比較して神経組織における以下の炎症を誘発する可能性があります。(ただし、このよう...

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開示事項

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

著者が明らかに何もありません。

謝辞

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

著者試薬と有用なガイダンス、および生体内イメージングのサバティーニ B. と c. ハーヴェイのラボ イラスト j. バスケス、d. カプラン、C. オイゲンプレダを感謝したいです。M. Ocana ・一部、国立研究所の神経疾患として神経イメージング研究センター部分で支え神経イメージング センターによって可能になった顕微鏡とストローク (NINDS) P30 コア センター (NS072030) を与えます。この仕事を受けました GVR 帰れない家族財団、ナンシー Lurie マーク財団と NIH の補助金、NINDS R21NS093498、U01NS108177、W.G.R に組織プラスミノーゲンアクテベータ R35NS097284、F32NS101889 C.H.C. に NIH ポスドク研究員プログラム

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
水性シルクフィブロインシグマ5154-20MLフィルムを作るための水性シルクフィブロイン (5% w/v)
シルクを堆積させるマイクロインジェクター/AAVドラモンド3-000-207ナノジェクト III ナノリットルインジェクター
インプラントを保持するマニピュレーターナラシゲMM-33マイクロマニピュレーター
シルクの堆積物を視覚化するステレオスコープAmScopeSM-6TX-FRL3.5X-45X リングライト付き三眼関節ズーム顕微鏡
インプラントを保管するための真空チャンバーAblazeN/A3.5クォート真空真空脱気チャンバー
オプション、保管用インプラントホルダーN/AN/A既製の光ファイバーを収納するには、フェルールの直径よりもちょうど大きい直径の~4mmの深さの穴をプラスチックブロックにドリルで穴を開けます。
光ファイバーThorlabsFT200EMTØ200 µm ファイバーインプラント用コアマルチモード光ファイバー
フェルールKientecFZI-LC-230LC ファイバーインプラント用ジルコニアフェルール
慢性ファイバーインプラント製造のための様々な材料様々なN/A詳細な手順については、Ung K, Arenkiel BR. 脳組織の慢性光遺伝学的刺激のための光ファイバーインプラントを参照してください。視覚化実験ジャーナル:JoVE。2012年(68)。
テーパーファイバーインプラントオプトジェニックスラムダ-Bテーパーファイバーインプラント
GRINレンズGoFotonCLH-100-WD002-002-SSI-GF3GRINレンズ
小さなガラス頭蓋窓ワーナー64-0726 (CS-3R-0)小さな丸いカバーガラス、#0の厚さ
大きなガラスの頭蓋窓ワーナー64-0731(CS-5R-0)小さな丸いカバーガラス、#0の厚さ
頭蓋窓を製造するための様々な材料様々なN/A詳細な手順については、Goldey GJ et al. Removable cranial windows for longterm imaging in awake mice. を参照してください。ネイチャープロトコル。2014年11月;9(11):2515。

参考文献

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
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