酵母におけるポリグルタミン毒性の試金を使用して融合パートナーの蛍光タンパク質の効果

サマリー

この資料では、蛍光タンパク質凝集の効果と蛍光レポーターのコンテキストで新しく, 蛍光タンパク質の迅速な評価のための誤って折りたたまれたポリグルタミン拡張の毒性を評価するためにプロトコルについて説明します。

要約

蛋白質のローカリゼーションと生細胞イメージングを用いた人身売買の調査、研究者は、しばしば蛍光レポーターに興味の彼らの蛋白質の融合に依存します。遺伝的に符号化された蛍光蛋白質 (FPs) の常に進化するリストは、それは蛍光融合設計に来るときいくつかの選択肢を持つユーザーを示します。各 FP は、結果として得られる蛍光融合の生化学的な携帯電話、および機能のプロパティに影響を与えることができます特定の光学的・生物物理プロパティを持ちます。たとえば、いくつかの FPs はフュージョン パートナーの機能を阻害する影響を受けやすい無指定のオリゴマーを形成する傾向があります。残念ながら、少数の方法だけは、FPs の蛍光レポーターの動作への影響をテストする存在します。ここでは、出芽酵母出芽酵母におけるポリグルタミン (polyQ) 毒性の試金を使用して FPs の影響を迅速に評価できるようにする簡単な方法をについて説明します。PolyQ 拡大 huntingtin 蛋白質は、拡張の huntingtin が有毒なオリゴマーと封入体に集約 (HD)、ハンチントン病の発症に関連付けられます。集約と酵母 polyQ 展開の毒性、蛍光タグ、FPs の動作への影響を研究する理想的な実験プラットフォーム提供の存在を含め、polyQ 地域を並べる順序に大きく依存、フュージョン パートナー。

概要

オワンクラゲ¹、遺伝子にエンコードされた FPs の広いパレットから緑色蛍光タンパク質 (GFP) の初期特性が開発されているので同時にローカライズし、追跡する細胞生物学者が複数にできます。生活イベント/タンパク質は細胞^2,3です。FPs は、サンゴとしたがって、彼らのそれぞれの蛍光スペクトルを超えて広く流用表示特定生物物理プロパティにクラゲから複数の有機体から派生します。これらのプロパティには、明るさには、光安定性、^2,4他の間で oligomerize する傾向が含まれます。適切なタグの選択の重要な側面は、単量体の FPs を選択する不適切な相互作用と融合パートナーの機能の変化を最小限に抑え、レポーターの効率を最大化するために、蛍光レポーターを設計するとき、細胞内コンパートメント^4,5,6を与えられました。GFP、時間をかけて、進化されているフュージョン パートナー^5,7、8、蛍光タグの影響を最小限に抑えるため、FP の新しい亜種を実行と比較してどのように GFP のまま評価することは困難です。

FPs の動作を特徴付けるいくつかの方法が存在します。それらのほとんどは、超遠心法などの生化学的アプローチを使用して FPs の生物物理特性のテストを含むし、ゲルろ過プロトコル^9,10、11,12。このようなメソッドがあるのままなセルの動作に少し洞察力を提供するソリューションで精製された FPs を使用して警告。組織の円滑な小胞体 (オゼ) 試金提供の開発生活 oligomerize FPs' 傾向の定量的評価細胞¹³発現 FPs に小胞体尿細管を再編成する能力をテストすることによってオゼ渦巻き¹⁴。この手法は、GFP のモノマー ・ オリゴマーのバリエーション、および他の FPs の間の変更を正常に検出できます。主一時的に transfected セルで過剰発現に依存し、定量、画像解析を時間がかかること、自動データ収集および解析ワークフロー技術を採用しない限り、します。

これらのアプローチを補完するために酵母^15,16毒性に関する蛍光タグの効果と polyQ 展開の集計の活用を試金を設立しました。以上 36 polyQ ストレッチの拡大は huntingtin 蛋白質 (Htt) がハンチントン病^17,18と関連付けられている遺伝子の最初のエクソン内で繰り返されます。拡張 Htt^ex1ミスフォールド Htt タンパク質が重度の成長障害に結合の強い凝集酵母で発現。興味深いことに、これらの表現型は強く FPs^15,16を含む polyQ ストレッチを並べる順序によって影響されます。それは FPs のさまざまなプロパティも差動酵母 polyQ 毒性に影響を与えることができます合理化されました。確かに、GFP のような FPs と比べると、赤の蛍光タンパク質とその進化形態を示している減らされた毒性と集計¹⁶。この原稿は、次世代 FPs の polyQ 毒性と酵母の凝集の効果を評価するために詳細なプロトコルを提供します。この試金は以前の特徴と並行使用できる FP の亜種の迅速かつ潜在的高コンテンツ分析新しい FPs の最適な評価方法評価方法彼らは GFP と比較して実行できます。

プロトコル

1. 新しい蛍光タグ Htt^ex1酵母式の報道記者の世代

注: このセクションによって変更されているプロトコルから江ら¹⁶と Albakriら¹⁹。

1. 蛍光タンパク質または PCR によって関心をコードする配列を増幅するプライマーを設計します。前方のプライマーは、制限酵素消化 (GATC) 中に続いて SpeI 制限サイト (ACTAGT) と興味の蛍光タンパク質遺伝子の ATG (ATG を除く) の下流 20 拠点を支援するリーダーのシーケンスを含める必要があります。逆のプライマーは、続いてサリ制限サイト (GTCGAC) と逆の補数 (stop を含む) FP シーケンスの停止コドン上流 20 拠点のリーダー シーケンス (GATC) を含める必要があります。
2. 次の設定で、たちを使用して PCR の反作用を実行手順 1.1 で設計したプライマーを使用して: 95 ° C、1 分および 30 のサイクル 95 ° C で熱 s、60 ° C、30 秒と 2 分キロバイトごとに PCR の製品のための 72 ° C。18 サイクルを実行することは、十分です。
3. Agarose のゲル (トリス酢酸 EDTA は 0.5%) の PCR の反作用を実行します。予想される製品サイズに対応するシングル バンドする必要があります。ゲル精製キットを使用してフラグメントを分離します。
4. このプロトコルは、25 (無毒) を運ぶ Htt^ex1ベクトルと 72 polyQ を繰り返す (HD 関連、強力な集計を表示する)。PCR のフラグメントと 37 ° C で 3 時間 SpeI とサリの制限の酵素とベクトルの両方をダイジェストします。
5. 手順 1.3 のように agarose のゲルを実行することによって消化されたベクトルを浄化します。
6. PCR 精製キットを使用して消化の PCR のフラグメントを浄化します。
7. 結果として得られる消化液の PCR のフラグメントを縛る、p415-GAL1-フラグ-25/72QpolyQ プラスミド¹ T4 リガーゼ (室温で 1 h) を使用して。10 μ L 反応 (T4 酵素の 1 μ L、10 X バッファーの 1 μ L、6 μ L の PCR のフラグメント、およびベクトルの 2 μ L) を使用します。
8. 大腸菌の 50 μ L に ligation の反作用の 2 μ L を変換-有能なセルと 30 分間氷の上にそれらを孵化させなさい。その後、熱ショック 30 42 ° C で細胞 s の追加 SOC 伸長メディアの 1 mL とシェーカーで 1 h の 37 ° C で孵化させなさい。100 μ g/mL アンピシリンを含む LB 寒天培地プレート上の反応の 200 μ L をプレートします。37 ° C でプレートを一晩インキュベートします。
9. 3 つの個々 の細菌のコロニーを選択、一晩シェーカーで 37 ° C で 100 μ g/mL アンピシリンを含む流体培養基 LB の 3 mL でそれらを成長し、プラスミド プラスミド精製キットを使用して DNA を抽出します。
10. 500 の消化によってプラスミッドをチェック 37 ° C および実行 agarose のゲル (トリス酢酸 EDTA は 0.5%) の反応で 1 h の SpeI とサリの制限酵素を用いた DNA の ng。ベクター (〜 7 kb) と挿入の右のサイズで 2 つのバンドをする必要があります (サイズは興味の遺伝子によって異なります)。その後、シーケンスによってプラスミッドを確認します。
11. P415-GAL1-フラグ- polyQ FP プラスミド酵母 W303 標準酵母変換プロトコル²を次に変換します。

2. スポッティング アッセイ

1. ストリーク酵母は、炭素源としてブドウ糖を酵母選択メディア (合成を完了-SC ロイシンなし) を含む寒天培地プレート上の任意の FP が付いたキャリング 25Q/72Q を複製します。同時にまた 25Q/72Q-ymsfGFP 肯定的な制御として使用するを連勝します。
   注: 25Q/72Q 構造蛍光タグが含まれていない毒性はなく、ネガティブ コントロールとして使用できます。
2. 2-3 d のための 30 の ° C でプレートを孵化させなさい。
3. プレートから最大 3 つのシングル コロニーを選択します。
4. 炭素源として 2% グルコースを添加した SC の 5 mL を接種します。
5. 一晩カルチャごとの 200 μ L をペレットし、洗って 3 x 滅菌蒸留水します。
6. 2% ガラクトース polyQ 融合発現を誘導するために炭素源として SC 培地で細胞を再懸濁します。メディアが 30 ° c 管回転で一晩ガラクトースを孵化させなさい。コントロールとしてグルコースを含むメディアを使用してこの手順を繰り返します。
7. 次の朝、600 の光学濃度に細胞の密度を均等化滅菌 96 ウェル プレートで SC メディアの 0.2 に 100 μ L の nm (外径₆₀₀)。
8. 4 つの準備に次もメディアの 80 μ L にも前からサンプルの 20 μ L 分注による滅菌水で各サンプルの 5 倍希釈。
9. 選択式ナンバー プレート (グルコースやガラクトースを含む) に細胞を発見し, 2 d の 30 ° C で酵母の固定ツールを使用します。
10. 画像ドキュメント機器とプレートのイメージです。

3. 液体培養の細胞の成長の定量化

1. このプロトコルの次の手順 2.1 2.5、細胞培養を準備します。
2. 分光光度計を用いた OD₆₀₀を測定します。
3. 96 ウェル プレートでメディアの 0.1 で 300 μ L の OD₆₀₀細胞を希釈します。
4. 3 通では、各サンプルを実行します。
5. 振動機能を持つプレート リーダー/インキュベーターでプレートを孵化させなさい。600 サンプル、30 ° C の温度、吸光度の数値を設定 nm、24 h 実験と連続振動モードを選択し、15 分の測定間隔の長さ。
6. 成長曲線を作成して科学的グラフ作成ソフトウェアを使用して曲線の下の領域を定量化します。グラフパッド プリズム 7 をお勧めします。3 つのレプリケーション値を XY テーブルにデータを貼り付けます。成長曲線は、左側にある [グラフ] フォルダーの下に表示されます。曲線下面積を定量化するには、左上で分析を選択し、 XY 解析の曲線下の領域をクリックします。

4. 蛍光顕微鏡

1. このプロトコルの次の手順 2.1 2.5、細胞培養を準備します。
2. 10 セルを希釈 8 ウェル イメージング室に各サンプルの成長メディアと転送 200 μ で x。
3. 室温で 63 X 計画 Aprochromoat 目的 (1.4 NA) を搭載した共焦点顕微鏡を用いた細胞をイメージします。
   注: 共焦点の顕微鏡の使用はオプションです。標準的な広視野蛍光顕微鏡を使用もできます。
4. 最適な画像の取得のピンホールとレーザー パワーを調整します。72Q 集計はディフューズ 25Q 信号よりはるかに明るいので、よく蛍光信号の飽和を避けるために異なるプラスミド間別の取得の設定を使用する必要があります。
5. ImageJ²⁰または別の画像処理ソフトウェアを使用して画像を処理します。この手順では、表示の集計を手動で計算できる細胞の割合が望まれます。

5. ドットのしみ

メモ: このプロトコルでドットのしみは蛋白質の表現のレベルを調べるため使用されます。このプロトコルの次の手順 2.1 2.5、細胞培養を準備します。

1. 換散バッファー (100 mM トリス、pH 7.5; 200 mM の NaCl; 1 mM EDTA; 5% グリセロール、1 mM ジチオトレイトール [DTT]) でガラス製のビーズを使用して蛋白質の lysates を生成します。プロテアーゼ阻害剤、4 mM 特異フッ化物 (PSMF) とプロテアーゼ阻害剤のカクテルを直接使用する前に追加します。一晩の文化の 5 mL をペレットし、ガラスビーズの 200 μ L、200 μ L の換散バッファーのでそれを再懸濁します。12 ラウンドの渦 30 s。4 ° C 10 分で 12,000 × gで遠心し、上清を収集します。
2. 総蛋白の濾過装置を用いた硝酸セルロースの膜に同量をスポットします。PBS で膜を prewet し、装置を組み立てます。真空源に接続し、ネジが締まっていることを確認します。真空をオンにし、重力によって膜サンプル フィルター。
3. PBS-0.05 %tween/5% 無脂肪牛乳の膜をブロックします。
4. 4 ° C で一晩一次反フラグ抗体と膜をインキュベートします。モノクローナル抗フラグ M1 をお勧めします。
5. 膜 3 を洗って 10 分 PSB-0.05% トゥイーンの x。
6. 膜蛍光に分類された二次抗体 (抗マウス IgG) PBS-0.05 %tween/5% 無脂肪牛乳に室温で 1 時間インキュベートします。
7. 膜 3 x 10 分 PSB-0.05% トゥイーンを洗います。
8. 画像 - イムノブロット ドキュメント システムを使用してしみ。

結果

FPs プロパティを持つ異なる生物物理 oligomerize、傾向を含む蛍光レポーターのコンテキストでその融合パートナーの行動に影響を与えることができます。このプロトコルでは、有毒な polyQ 展開に複数 FPs を融合することができます簡単な方法について説明します。PolyQ 毒性は並ぶ polyQ ストレッチ¹⁵シーケンスに依存、ので、この試金は蛍光 polyQ 融合記者 (図 1) の迅速かつ直接比較を可能します。HD-関連付けられている polyQ 長さ (25Q) ネガティブ コントロールとして使用され、有意な毒性または集計^15,16,21,22が表示されません。強い成長阻害と polyQ 凝集を含...

ディスカッション

この記事で Htt^ex1 polyQ 展開と酵母の増殖への影響の集計を測定する様々 な試金がどのように異なる蛍光を勉強するはモデルとして採用されたタンパク質蛍光レポーターのコンテキストでその融合パートナーの変更.肯定的な制御として GFP バリアント (ymsfGFP) を使用して、示した polyQ 毒性と異なる蛍光タグ間集計の大幅な変化を検出とこに対して polyQ FP 融合パフォーマンスの直接かつ迅速な比較では、GFP 付けられた構造^16,19。

この議定書は蛍光蛋白質に焦点を当てて、プロトコルのさまざまな部分が他の蛋白質のタグの効果をテストする容易に合わせることができます。さらに、この議定書は、コピー数 (一般に 1 ~ 2 コピー) セル²⁵の存在の点で異なることができます低コピー酵母セントロメア ベクトルを採用しています。実験の条件統一式を確実に統合のベクトルを使用してこの問題を回避...

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
5-α 有能な大腸菌 (高効率)	ニューイングランド バイオラボ	C2987
SpeI-HF	ニューイングランド バイオラボ	R3133	高忠実度酵素が好ましい
SalI-HF	ニューイングランド バイオラボ	R0138	高忠実度酵素が好ましい
アガロース	フィッシャー サイエンティフィック	BP160
LB-寒天	フィッシャー サイエンティフィック	BP1425
LB-Broth	フィッシャーサイエンティフィ	BP1426
アンピシリン	ッシャーサイエンティフィック	BP1760
PfuUltra ハイフィデリティ DNA ポリメラーゼ	Agilent Technologies
EPOCH2 マイクロプレート分光光度計	BioTek Instruments inc	EPOCH2TC
酵母ピンリプリケーター	V&Pサイエンティフィック株式会社
SPIイメージ	ャーS&ピーロボティクス株式会社	spImager-M
Zeiss LSM 800 共焦点	AryScan カールツァイス顕微鏡	LSM 800
8 well Lab-Tek イメージングチャンバー	フィッシャーサイエンティフィック	12565470
バイオドット装置	バイオ・ラッド	1706545
Chemi Doc XRS+	バイオ・ラッド	1708265
抗FLAG M1抗体	シグマ・アルドリッチ	F3040
ヤギ抗マウスIgG alexa 555二次抗体	Thermo	A32727
プラスミド MiniPrep キット	フィッシャー・サイエンティフィック	K0503
プラスミドゲル抽出キット	フィッシャー・サイエンティフィック	K0831
PCR 精製キット	フィッシャー・サイエンティフィック	K0702
Prizm	GraphPad	N/A
TAE (Tris-Acetate-EDTA)	フィッシャー・サイエンティフィ	BP13354