方法論記事

回転ディスク全内部反射蛍光顕微鏡による細胞の接着の形成の可視化詳細

DOI：

10.3791/58756

⸱

2019年1月21日

 , 
1UKE Microscopy Imaging Facility, University Medical Center Hamburg-Eppendorf

この記事について

サマリー

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高速・高分解能を可能にする高度な顕微鏡分離膜と周囲の細胞内のボリュームの両方の画像が表示されます。1 つのセットアップでディスクと全反射蛍光顕微鏡を回転の統合により、3.5 まで高い獲得率でライブ イメージング実験画像のスタック毎秒。

要約

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生きている細胞では、接着形成などのプロセスは、細胞膜と細胞内で広範な構造変化を伴います。ライブ サンプルの高速イメージングが可能 2 つの相補的な光学顕微鏡技術が結合されたこれらの非常に動的なイベントを視覚化するために: 高速で高解像度のボリューム録音および総内面反射の顕微鏡ディスク (SD) を回転正確な局在と細胞膜の可視化 (TIRF) 蛍光顕微鏡検査。試料作製、顕微鏡校正、画像形成および取得を通じた指導、多色・高時空間的解像度 SD 全反射イメージング ライヴ ・ シリーズの包括的かつ完全なイメージング プロトコルが表示されます。多次元のライブ イメージング データセット、すなわち登録および個々 のチャンネルの組み合わせを生成するためのすべての必要な画像後処理手順は、ImageJ のオープン ソース ソフトウェアの自己書かれたマクロで提供されます。開始時に蛍光タンパク質のイメージングおよび接着複合体の成熟だけでなく、アクチン細胞骨格ネットワークの形成は、この新たなアプローチの原則の証拠として使用されました。高解像度 3 D 顕微鏡や全反射の組み合わせがセルラ環境内および、同時に、高い検出膜準の分子の正確な局在これらの複雑なプロセスの詳細な説明を提供シグナル/バック グラウンド比。

概要

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日々、固定高/超解像イメージングと生体試料を提供する光学顕微鏡技術は急速に発展します。超解像技術枯渇 (STED) 構造化照明顕微鏡 (SIM) と光活性化ローカリゼーション顕微鏡 (パーム) または直接確率光再建顕微鏡 (嵐) の刺激をそれぞれ、市販分子スケール1,2,3,4,5,6のほとんどの詳細を示す細胞レベル下の構造のイメージングを有効にして。ただし、これらのアプローチは、大量が 2 番目の集録速度あたり複数のフレームを可視化する必要がありますライブ イメージング実験の適用性をまだ制限が。非常にダイナミックなプロセスを介して細胞膜、例えば遠藤 - 規制の品種/エキソサイトーシス、粘着性、移行、シグナル伝達、細胞大量に高速で発生します。最近、このギャップを埋めるために統合された顕微鏡法は提案と呼ばれる回転ディスク-全反射 (SD 全反射)7だった。詳しくは、全反射型顕微鏡特に分離膜8,9をローカライズ、SD 顕微鏡は最も敏感なと高速可視化と追跡のためのイメージング技術をライブすることができます。細胞質10,11細胞小器官。単一のセットアップの両方のイメージング技術の組み合わせが過去12,13で実現されている、ただし、ここ (図 1) に示す顕微鏡は最後にライブ イメージング SD 全反射実験を実行する条件を満たしています。3 コマ/秒のスピードで前述のプロセス。この顕微鏡は市販、この原稿の目標は詳細を説明して、画像の取得、登録、および関連付けられている SD 全反射型顕微鏡可視化のためのオープン ソース ツールやプロトコルを提供することです。

セットアップは、独立したポートを介して 2 つのスキャン ユニットに接続されている倒立顕微鏡に基づいている - の左側のポートは全反射し、光活性化/-漂白の SD ユニット、スキャナー ユニットを背面のポートにリンクされる実験。最大 6 レーザー (405/445/488/515/561/640 nm) 励起に使用することができます。励起とどちらか 100 x 蛍光信号の検出/NA1.45 オイルまたは 60 x/NA1.49 オイル全反射の目的、それぞれ採用されています。放出される光はダイクロイック ミラー (561 nm ロングパスまたは 514 nm ロングパス) によって分割し、様々 な帯域通過フィルターによってフィルター処理 (55 nm 幅 525 を中心とした nm、54 nm 幅 609 を中心とした緑と赤の蛍光の nm それぞれ) 2 つの EM CCD カムの前に置かれました。時代 (年号)。Zobiakらのセットアップに関するより技術的な詳細が表示されていることに注意してください。70.5 年頃内光路から移動された SD ユニット全反射構成で s ように同じの 2 台のカメラは、検出に使用することができます、1 年頃と比較すると 2 つの画像診断装置の高速切り替えをできるように、過去に報告された s13 <。/c2 >。この機能により、デュアル チャネル同時取得、したがって 4 チャンネルは SD 全反射イメージング以前で比類のないスピード、精度を実行することができます。また、SD と TIRF 画像間の位置合わせは必要ありません。2 つのカメラ間のイメージの配置は、ただし、実験を開始する前にチェックし必要に応じて修正あります。次のプロトコル登録修正ルーチンは自己 ImageJ マクロで実装されていました。さらに、マクロに sd と、異なる次元にもかかわらず全反射データセットの同時可視化できるように設計されました。集録ソフトウェア自体は、これらの機能を提供しませんでした。

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プロトコル

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1. 細胞の調製

  1. 2 日前の実験はシード 6 も細胞培養プレートのウェルあたり完全な成長媒体の 2 mL で 3 * 105 hela 細胞または NIH3T3 細胞です。このプロトコル全体の層流フードのセルを処理するを確認します。
  2. 実験の前日は、製造元の推奨事項または経験的に決定されるプロトコル、例えばによるとトランスフェクション試薬を準備します。
    1. Lifeact RFP の 1 μ g と YFP ビンキュリン 200 μ L 減少血清中の合計で 1 μ g を希釈します。渦のトランスフェクション試薬簡潔に、4 μ L 200 μ L の DNA と渦に再度追加します。室温で 15 〜 20 分のトランスフェクション ミックスを孵化させなさい。
    2. セルに直接滴下全体トランスフェクション ミックスを追加します。プレートを揺することによって混合し、インキュベーターに戻します。
  3. 実験の日、ライブ イメージングのサンプルを準備します。
    1. 35 mm ガラス底皿のガラス表面をコートする PBS におけるフィブロネクチンの 10 μ g/mL の溶液を準備します。最適なパフォーマンスの全反射高品質 0.17 mm ガラス coverslips のみを使用し、プラスチック製の底皿を避けます。常温で 30 分はそれを削除し、空気乾燥させる料理のガラス表面にソリューションを残します。
    2. 1.8 倍の蒸留水で mL あたり 109粒子の密度に 0.1 μ m マルチ蛍光ビーズ ソリューションを希釈し、フィブロネクチン コート ガラス面に 30-60 秒のためのソリューションを追加します。解決策はすぐに削除、空気乾燥させる料理。
      注: この手順は、ビーズによる画像登録の 2 色参照イメージを取得および/または細胞を播種する前に全反射面がある場合にのみ必要です。
    3. 0.1 M アスコルビン酸 (AA) ソリューションを準備し、0.1 mM 成長培地 (AA 中) の最終濃度に希釈します。37 ° C の水浴にソリューションを配置します。
      注: 使用蛍光最適化培可能であれば、このような phenolred-無料 (リボ-) フラビン減少中。AA は、ライブ イメージング14中に光毒性の影響を減らすことができる抗酸化剤です。我々 は、この分析では、すなわち複数のセル登場 AA 添加せずより適用される条件の下で健康的な正常にそれをテストしています。ただし、培地の pH は、0.17 pH 単位で下げられました。
    4. 2 ml の PBS セルを洗浄して、250 μ L を追加トリプシン-EDTA とセルが完全になるまで待つ戸 (37 ° C の定温器で 2-3 分)。再懸濁しますセル 1 mL に慎重にピペットで AA 中で加温、4 ml AA 培地 15 mL 細胞培養管にそれを追加します。顕微鏡の近くの 37 ° C および 5% の CO2に設定インキュベーターに少し開いた蓋の細胞懸濁液を配置します。
    5. 1 mL ガラス底皿 AA 中で加温し、事前に加熱された顕微鏡のホルダーを追加 (次の段落を参照)。

2. ライブ イメージング

  1. 安定した 37 ° C、5% CO2湿気のある大気を達成するために顕微鏡の環境制御を開始します。
    注: ここでは、小さなステージ トップ インキュベーション室使用されている約 15 分大きいインキュベーター内で許可されている安定した設定が安定した状態を達成するためにより多くの時間を必要があります。
  2. 細胞懸濁液を適用する前に、顕微鏡で取得のすべての設定を修正します。
    1. 時間間隔 30 に設定 s と 60-90 分に期間ごとの時点 (値「1」) でオート フォーカスをハードウェア ベースのオート フォーカス機能をアクティブにします。
    2. カメラの露出とゲイン、すべてのチャネルのためのレーザー出力の調整します。レベルの高利得、低露光時間と低いレーザー力、写真毒性を減らすためにお奨めします。
      注: ここに示すデータは 200 ms 露出に買収されました、488 の 0.5 W/cm ² の励起強度に等しいレベル 500 と 20% レーザー電力利得 nm、1 W/cm ² 561 の nm、それぞれ。
    3. 0.4 μ m 間隔で 10 μ m に回転ディスク チャネルの z スタックを設定します。ド全反射チャンネル z スタックを有効に。ハードウェアのオート フォーカスのフォーカス位置を「0」、すなわち最低平面になります下オフセットを設定します。
    4. 多地点機能「ステージ ポジション」をアクティブにします。
      注: 30 s の時間で 3 つのポジションまでを記録できます。
  3. 眼またはコンピューターの画面上にエピ蛍光照明蛍光ビーズを見つけるし、全反射チャネルを 1 つをアクティブにし、照射角を全反射照明を示す値に設定。顕微鏡のパネルでボタンを押してオート フォーカスをアクティブにしてオフセットのホイールとフォーカスを調整します。その後ビーズ画像登録、2 色データセット、つまり全反射 488 と全反射-561 を取得 (を参照してくださいポイント 3.1)。
    1. オプション: 全反射照明を確保するため、追加自由にフローティングの多色蛍光ビーズ懸濁液の数マイクロリットル (を参照してくださいポイント 1.3.2。)。全反射チャネルのライブビューをアクティブにし、照明角度を大ききます。正しい全反射照明8を確保する臨界角を超えて非付着ビーズが消えます。
  4. 2-3 回、閉管の反転によって再び細胞懸濁液を混ぜるし、セルの 1 mL をイメージングの皿に適用します。
  5. 低レベル エピ蛍光照明ダブル transfected セルをすばやく見つけます。明視野照明を使用してライブ カメラのプレビューでセルの中心し、位置をマークします。別 1-2 観光名所を検索し、位置リストに保存します。
    注: 初めに、セル簡単に外し舞台上の動きのため、それゆえ 4-5 ポジション設定、できますすべて画像の取得を開始する前に再チェックします。その後、1-2 の位置を破棄します。
  6. 「順序」ボタンをクリックしてしてデータ集録を開始します。

3. 画像の後処理 ImageJ で

  1. フィジー15で登録無料の hyperstack を生成するためには、2-4 チャンネル SD 全反射蛍光タイムラプス データセットに適用することができる「SD TIRF_helper」という名前のマクロを書かれています。サブフォルダー「マクロ」、フィジーの「SD TIRF_helper_JoVE.ijm」ファイルを保存し、、メニュー コマンドをクリックして、マクロを実行"プラグイン > マクロ > 実行..."。
    1. カラー チャンネル登録修正が必要、オプションを選択し新しいビーズ ベースの登録参照 (ランドマーク ファイル) を作成または前に作成された既存のファイルを使用します。
      注: turboreg プラグイン16は、蛍光ビーズの参照画像に適用されます。プラグインのインストールの一般的なガイドラインに従って、フィジー ソフトウェアのプラグインをインストールします。
    2. バイオ形式のインポーターとデータをインポートし、表示オプションとして hyperstack を選択します。画像データセットを読み込み、最初の手順と 2 番目のステップで全反射シリーズの SD シリーズを選択します。フィジーは、チャネルとステージの位置、すなわち通常すべて SD のチャンネルとすべての全反射チャンネルは選択されているすべての段階の位置の 1 つ hyperstack として表示で並べ替えられたデータが表示されます。
      注: データのインポート、各種ファイルから可能な限りたとえば TIFF シリーズまたはプラットフォーム依存のファイルの種類のように * .nd。それは独立した、圧縮 TIFF 形式として取得ソフトウェアによってエクスポートされなかった場合にのみ、ファイルの種類を認識できません。
    3. 事前に決められたランドマーク ファイルを読み込み、それぞれのチャンネルに登録補正を適用します。
    4. すべての SD と全反射チャネルの希望カラー ルックアップ テーブル (LUT) を選択し、それらをマージして単一の多次元 hyperstack。
      注: 強度値がゼロの z 平面の数は全反射チャンネルの処理中に SD データセットで z 平面の数と一致する底面の上に追加されます。この手順は、最終的な hyperstack の可視化が重要です。この方法論が正しければ、全反射照明の深さから SD スタックの z ステップ サイズより小さい (200 nm7未満) は (400 nm)。

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結果

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アッセイ開発されました SD 全反射イメージングの可能性を示すために細胞-マトリックス接着複合体との相互作用、細胞骨格細胞接着過程の時空間的組織を明らかにする必要があります。したがって、付着 hela 細胞、あるいは NIH3T3 細胞は 18-24 時間、YFP ビンキュリンと RFP Lifeact を導入させたトリプシン、フィブロネクチン コート ガラス底培養皿上にシードします。これらの細胞株で選択された彼らの顕著な骨格と高い耐性のライブ イメージング実験対照的にたとえば、一次電池。それらは彼らはトリプシン処理後、非常に敏感な状態でイメージング耐えられない可能性があります。顕微鏡で YFP/RFP 発現細胞が選ばれ、接着工程時に観測された 60 分コマ撮り (図 2および映画の 1 と 2)。この特定のアッセイめったといない明確に記載されている文献17,18.また、癒着形成は、例えば...

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ディスカッション

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本稿で示したライブセル イメージング実験、3 の異なるステージで 1 分あたり 2 SD 全反射画像のスタックなど高い獲得率すなわちを実行に適した構成で SD と全反射顕微鏡の最初の成功の実装合計 (およそ毎秒 3 フレーム)、168 のフレームに対応する位置に買収されました。されたいくつかの SD 全反射顕微鏡は前述12,13、主に、3 D の細胞プロセスに従うことの十分に高いイメージング速度の不足 2 未満の時間分解能画像のスタックあたり s がしばしば必要。提示セットアップは 1 秒あたり 0.78 画像のスタック最大イメージング、3.5 の転送速度を達成できる調査 3 D 小胞ダイナミクスがされているライブの実験で大きな画像のスタック毎秒7を示した。さらに、前の SD 全反射顕微鏡イメージング モードでは、さらに多チャンネル集録速度を下げるあたり 1 つだけ検出器があった。技術的には、分割ビュー構成を実装できるシステムにもできる同時のデュアル カラ...

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開示事項

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著者が明らかに何もありません。

謝辞

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科学界の医療センター ハンブルク大学エッペンドルフ評価用サンプルで私たちを支援するため大いに感謝いたします。すなわち、NIH3T3 細胞、YFP ビンキュリンのアンドレア ・ Mordhorst と RFP Lifeact のマレン ルドルフをザビーネ Windhorst を感謝いたします。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
顕微鏡とアクセサリー
SD-TIRF顕微鏡Visitron Systems
Ti パーフェクトフォーカスシステムニコン倒立顕微鏡スタンド
CSU-W1 T2横河ニングディスクユニット
iLAS2 ローパー・サイエンティフィックTIRF/FRAPスキャナー
Evolve PhotometrixEM-CCDカメラ
PiezoZステージLudl Electronic Products電動Zステージ
Bioprecision2 XYステージLudl Electronic Products電動XYステージ
ステージトップインキュベーションチャンバーOkolabボールドライン温度、CO2および湿度供給
細胞培養
HeLa子宮頸がん細胞DSMZACC-57
NIH3T3線維芽細胞DSMZACC-59
ダルベッコのリン酸緩衝生理食塩水(PBS)Gibco14190144
Trypsin-EDTA 0.05%Gibco25300054
Dulbeccoの修飾イーグル培地+グルタMAX-I(DMEM)ギブコ31966-021
OptiMEMGibco31985070Reduced serum medium
Fetal calf serum (FCS)Gibco10500064
Penicillin/Streptomycin (PenStrep)Gibco15140148
Full growth medium (DMEM supplemented with 10% FCS and 1% PenStrep)TurboFect
ThermoFisher ScientificR0531Transfection試薬
アスコルビン酸 (AA)シグマA544-25G
6ウェル細胞培養プレートSarstedt83.392
ガラス底皿MatTekP35G-1.5-10-C35mm, 0.17mm ガラスカバースリップ
フィブロネクチン、ウシ血漿サーモフィッシャーサイエンティフィック33010018
ノイバウアー改良チャンバーVWR631-0696
TetraSpeck ビーズThermoFisher ScientificT7279
Plasmids
RFP-LifeactMaren Rudolph, Institute of Medical Microbiology, University Medical Center Hamburg Eppendorf,
Germany YFP-VinculinAndrea Mordhorst, Institute of Medical Microbiology, University Medical Center HamburgEppendorf, Germany
Software and plugins
VisiViewVisitron SystemsVersion 3
ImageJVersion 1.52c
Turboreg plugin
http://bigwww.epfl.ch/thevenaz/turboreg/ Macro "SD-TIRF_helper_JoVE.ijm"この出版物
https://github.com/bzobiak/ImageJ VolocityPerkinElmerバージョン6.2.2
電機スピ

参考文献

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