プローブに細菌の病原体を用いた細胞・生体レベルのホスト応答

サマリー

ホスト エンコード要因の活動を分析する使用ことができます両方生体外でそして生体内で感染の試金を記述します。

要約

細菌性病原体が存続し、かつて真核生物の細胞内増殖を採用戦略のさまざまながあります。いわゆる '細胞' 病原体 (リステリア菌赤痢菌、細菌病菌 pseudomallei、野兎病菌、リケッチア属) による感染細胞の細胞質へのアクセスします。物理的に、酵素によってプライマリの液胞膜を分解します。一度、細胞質でこれらの病原体増殖し同様両方新しい細胞を感染させるために宿主細胞の細胞膜を貫通する十分な機械的な力を生成します。ここで、菌、リステリア菌(Lm) の細胞感染サイクルのこの最終段階のコロニー形成単位アッセイとフローサイトメトリーにより定量化することができ、これ両方の病原体およびホストでエンコードされた要因の影響の例を与える方法を紹介します。プロセス。また, Lm感染培養細胞動態の近い対応が生体外で感染しているし、感染肝細胞に由来するマウスの体内.これらの関数に基づく試金は比較的単純であり、真核生物細胞の機能の変調器のための高スループット画面の検出ベース容易に拡張できます。

概要

感染症に基づく実験的モデル、ホスト、そして病原体、様々 な病原体の感染戦略と病原体がホスト主導するプロセスに結び付ける難易度の開始状態への依存のために本質的に挑戦結果に基づきます。菌リステリア菌(Lm) の遺伝学的および微生物学的少ない、その迅速かつプロセッシブ細胞感染戦略と比較的明確なのためのに対する宿主の防御をプローブする理想的な病原体となっています。その携帯と生体レベルの感染症の表現型間の関係。Lmの細胞感染を通過 4 段階¹: (i) Lm ; 液胞で囲まれた中で結んで細胞浸潤(ii) Lm-液胞膜の溶解と細胞質; にLmの放出を指示(iii) intracytosolic レプリケーションそして (iv) 膜結果直接隣接する細胞 (上皮シートなど) のどちらかの感染または孤独な細胞は細胞外の環境にLmのリリースの物理的な侵入。特定Lmによって促進される、これらの各フェーズ-要因 ('病原因子」と呼ばれる) をエンコードされたが、削除されると、原因の感染欠陥細胞と動物のモデル。この一般的な感染戦略されて独立して進化しているいわゆる '細胞' 病原体²の数によって。

コロニー形成単位 (CFU) 試金は体外の両方を評価するため利用されています (すなわち、細胞) 同様の in vivo (すなわち、,) 感染症の結果。生体内での感染症のために特に感度が高くに加えて CFU の試金は病原体の侵入と細胞の生存/増殖のため明確な読み出しを提供します。CFU アッセイは、感染に影響を与えるLmとホストの両方の細胞の要因を分析するため広く使用されています。これらの先行研究は細胞浸潤と intracytosolic レプリケーションを分析されている有益 CFU の試金、我々 の知識を最大限に使用されていないLm感染プロセスの第 4 段階を追跡する: 細胞エスケープ。ここでは、比較的単純な CFU の試金 (およびフローサイトメトリーによって) (以下、出現') 携帯の脱出の手段を監視ことができ、どのように両方の病原体およびホストでエンコードされた要因の例を示す規制Lm のこの段階について述べる感染サイクル。携帯電話のLm感染サイクル ターミナル相の解析追加病原体および宿主細胞感染特異的因子と活動を識別することが可能になります。

プロトコル

ケアのため、すべての適切な政府ガイドラインに従ってマウスが人道的扱われ、国立衛生研究所の実験動物の使用とその使用方法は、この全体の研究のためのマイアミ大学の制度上の動物の世話が承認されましたおよび使用委員会 (プロトコル 16 053)。

1. 感染症の細胞を準備

1. DMEM 培養培地 10% 牛胎児血清 (今後 DMEM/FCS と呼ばれる) でマウスのマクロファージ様細胞ライン未加工 264.7 の伝達 125 mL フラスコと 37 °C/5% CO₂で維持培養インキュベーターを使用しています。
2. 感染前に、の日は、拡張フラスコからセルを削除し、15 mL スクリュー キャップの円錐管の収集に細胞スクレーパーを使用します。800 x gで 10 分間で細胞を遠心、上清をデカントし (抗生物質) なし DMEM/FCS の 1 mL の細胞ペレットを中断し、検定または自動化された細胞カウンターを使用して抗体価を決定します。
3. 2 x 10⁶セル/mL に価を調整し、48 ウェル培養皿の井戸に 0.10 mL (2 x 10 の⁵セル) を追加します。細胞懸濁液が井戸の表面全体をカバーすることを確認します。
   1. プレート細胞調節されたメディアの後でソースの追加の井戸。また 'ないセル コントロール' として機能する 3 つの追加井戸に DMEM/FCS の 0.10 mL を配置します。
4. 37 °C/5% CO₂で組織文化のインキュベーターで一晩インキュベートします。菌接種が準備し、使用する準備ができているまで、インキュベーターから次の日には取り外さないでください。

2. 感染症のリステリア菌(Lm) を準備します。

1. たてすじの寒天から単一コロニー脳心臓注入 (BHI) 2 mL を接種する (< 2 日) Lmの 130 回転/分の振動で 37 ° C で一晩インキュベートし、。
2. 次の日、追加 2 mL に一晩文化の 0.10 mL BHI で加温し、光学濃度 (OD₆₀₀) が 0.4 と 0.6 まで揺れで 37 ° C で培養を続けます。
3. 経験的派生変換式を使用しておおよその細菌抗体価を決定します。私たちの研究室で BHI で指数関数的に成長のLm文化は約 1.3 × 10⁹コロニー形成単位 (CFU)/OD₆₀₀。細菌文化は、部屋の温度にさらされている時間の量を最小限に抑えます。
4. 感染の直前に 5 × 10⁷ CFU/mL の希釈剤として予め温めておいた DMEM/FCS を使用して力価を調整します。

3. 感染症

1. 20 μ L を追加作業迅速かつ正確には、(1 x 10⁶ CFU; MOI 感染症の多様性 = 5) 皿の少し傾斜上を覆うメディアのピペット先端部を慎重に配置することによって井戸に出来立てLm接種 (2.4 上記のステップ) の
   注:ピペット先端部の井戸の壁には触れないでください。
2. 優しくをピペットで移しなさいように各ウェルの内容完了混合;振る、これが井戸の壁上のLmを分散大幅プレートを傾斜したりしないでください。細胞培養ディッシュを 37 °C/5% CO₂インキュベーターに戻ります。
3. 感染していない井戸から調節されたメディアを使用して希釈液として 10 μ g/mL ゲンタマイシン溶液を調製します。
4. 30 分で感染症 (mpi) の記事、慎重にゲンタマイシン液 (最終濃度 2.5 μ g/mL) と優しくピペット 30 μ L に 37 °C/5% CO₂インキュベーター戻り細胞培養ディッシュ、前に同様の内容を追加します。
5. 60 mpi で (それぞれ 4、5 のセクションで後述) として CFU の試金 (60 mpi 時点) または FCM 解析のいずれかの適切な井戸を収穫します。
6. 残りの井戸、ゲンタマイシン無料エアコン メディアの 150 μ L で取り外して交換井戸からメディアが完全する前に、または、 Lm出現の試金のための細胞を収穫どちらかその後の様々 な時。

4. サンプリング CFU アッセイによる細胞内と創発のLmの処理と解析

1. 収穫、料理を少し傾けるし、井戸からメディア全体を慎重に取り外します。井戸に 0.50 mL 滅菌蒸留水 (dsH₂O) を追加します。30 後 s、結果水のライセートを転送 (10⁰) 1.5 mL 容マイクロ チューブと精力的に 10 の渦に s。
2. 準備 10^-1および 10^-2希薄か 4.5 μ L または dsH₂O の 450 μ L に溶解水の 50 μ L と簡単に渦徹底的な混合を確実を追加します。
3. 10 の 50 μ L を広めるホストゲノム スープ (LB) 寒天培地プレート 10^-2サンプルや 10^{-1 0}。
4. 創発的Lm (3.6 上記のステップ) の試金し、オーバーレイするメディアの 10 μ L を削除 2 つ 5 μ 因数に分割: 1 つの因数を追加 DMEM/FCS と 2 番目の約数を 5 μ L 5 μ G/ml ゲンタマイシンを含む DMEM/FCS の 5 μ L を追加。後者のコントロールを区別細胞外Lm (機密ゲンタマイシン) と細胞内Lm (ゲンタマイシン耐性) 以降 CFU で試金。
5. 室温で 5 分後に LB 寒天培地プレート上 dsH₂O、10 s は積極的に渦の 90 μ L と拡散 50 μ L を追加します。
6. 次の 2 日の 37 ° c. で孵化 LB 寒天培地プレート上のLmコロニーを列挙します。

5. サンプリング処理とフローサイトメトリー (FCM) による細胞内と創発のLmの解析

1. 1.1 4 の手順で説明するように、未加工 264.7 のセルを準備します。1 x 10⁶セル/mL にセルを調整し、6 ウェル培養皿の井戸に 1 mL (1 x 10 の⁶セル) を追加します。
2. 2.1 2.3 の手順で説明するように菌接種を準備し、50 (5 x 10⁷ CFU) の慣性モーメントに対応する接種量と細胞に感染します。
3. 1.5 時間ポスト感染 (hpi)、井戸の最初のセットからメディアを収集し、すべての井戸が処理されるまで 4% パラホルムアルデヒド (PFA)、氷の上の場所の 500 μ L で 1.5 mL 遠心チューブに配置。
4. 細胞内Lmを収集するために井戸の中に、60 歳以降後に dsH₂O の 1 mL を追加 s、4% の 500 μ L で 1.5 mL 遠心チューブに生じる水ライセートを転送 PFA。10 s およびすべての井戸が処理されるまで氷の上場所は積極的に渦。(サンプル処理は 5.8 以下の手順で説明します)。
5. 残りの井戸のメディアを取り出し、細胞外Lmを殺すために、速やかに細胞をインキュベーターに戻ります 5 μ G/ml ゲンタマイシンと DMEM/FCS の 1 mL に置き換えます。
6. 30 分 (2 hpi) 後にメディアを取り出し、ゲンタマイシンなし DMEM/FCS に置き換えます。
7. 2 と 4 h (4 と 6 の hpi) 後 2 番目と 3 番目 5.3 および 5.4 の手順としてメディアと溶解液を集めることによってポイントを時間します。
8. 不穏なペレットなし 7 分削除清 10,000 x gでチューブを遠心します。
9. 4% の 50 μ L のカクテルを染色でペレットを中断 PFA とファロイジン 15 μ L。4 ° C、20 分で暗闇の中のチューブを孵化させなさい。
10. 孵化後各管し、ミックスを上下にピペット 1 mL の FACS バッファーを追加します。
11. 不穏なペレットなし 7 分削除清 10,000 x gでチューブをスピンします。
12. すぐに使用、FACS バッファーの 400 μ L または FACS バッファーの 200 μ L、200 μ L 4% のペレットを中断 PFA を後で分析を格納する場合。
13. Cytometry 流れのサンプルを実行し、収集されたデータを分析します。

6. サンプリング処理とLm植民地化し、肝臓でのホスト応答の解析

1. 2.1 2.3 の手順で説明するよう、感染症のLmを準備します。
2. 3 × 10⁶ CFU/mL の希望価のサブカルチャーの必要量を計算します。
3. 感染の直前に計算される細菌で予め温めておいたハンクのバランスの取れた塩ソリューション (HBSS) 1 mL の最終巻での量を希釈します。これは、マウスに注入される入力の接種です。
4. 28 G½ 100U インスリン注射器を使用して、入力菌の 100 μ L (3 x 10⁵ CFU) を描画し、目に見える空気の泡を削除します。
5. 持株拘束にマウス (緊張 C57BL/6; 6 および 12 週古い間の男性) を配置、尾静脈を拡張する暖かい水 (45 ° C 以上) を使用し、入力の接種を静脈に注入します。
6. プレート 10^-2と LB 寒天の 10bcm に入力の接種の 10^-3希薄と実際の入力の量を決定するための 37 ° C で一晩インキュベートします。
7. 18 hpi の人道的安楽死させるマウス (CO₂窒息頚部転位続いて) と外と内のピンセットとはさみの別のペアを使用して肝臓の前頭葉を収集する滅菌はさみカット オープン マウス腹膜を使用マウス。6 cm シャーレ氷の上に肝臓を配置します。
8. 小さなキューブに肝臓を切り取り、電磁攪拌棒とガラスの瓶に。2 mg/mL コラゲナーゼ FCS なし DMEM で再構成した D の 2 mL を追加します。マグネチックスターラー 30−45 分の 37 ° C でバイアルを孵化させなさい。組織をホモジナイズ DMEM/fcs、コラゲナーゼを不活化する 3 mL を追加します。
9. セルを 70 μ m セル ストレーナーより DMEM/FCS を必要に応じて追加、円錐管にフィルターします。
10. 10 分のための 4 ° C でペレット、上清を除去および赤血球を溶解する ACK バッファーの 500 μ L の細胞ペレットを中断する 800 x gで細胞を遠心します。
11. セル ACK バッファーで 5 分間室温で孵化させなさい。DMEM/FCS の 1 mL の細胞を中断します。
12. 4 ° c 10 分のペレット、上清を除去および DMEM/FCS の 1 mL に中断する 800 x gで細胞を遠心します。次に、診断または自動化された細胞カウンターを使用してセルをカウントします。
13. 餌のためにスピンして 1.5 mL 遠心チューブに 1 x 10 の⁶セルを転送します。DsH₂O と、細胞を溶解する渦の 1 つの mL で、停止します。原液で LB プレートに 50 μ L および 10^-2希薄をプレートし、CFU 解析のLmを列挙する 37 ° C で孵化させなさい。
14. セルのカウントによると各組織サンプルの FACS チューブに 1 x 10 の⁶セルを転送し、FACS バッファーの 1 つの mL で洗います。
15. 800 × g 10 分のための 4 ° C でペレット、上清を除去し、細胞を遠心します。
16. 各抗体および FACS バッファーの推奨濃度に基づく興味の抗体を含む抗体カクテルを準備します。分析で使用推奨量の材料表を参照してください。
17. 抗体カクテルの 100 μ L でペレットを中断し、30 分のための 4 ° C で暗闇の中のチューブを孵化させなさい。
18. インキュベーション後、各管に 2 mL の FACS バッファーを追加し、細胞を中断します。
19. 4 ° C でペレット、上澄みを廃棄し 800 x gで細胞を遠心します。すぐに使用、FACS バッファーの 400 μ L または FACS バッファーの 200 μ L、200 μ L 4% のペレットを中断 PFA 後保管する場合。
20. フローサイトメトリーによる細胞を分析 (手順 5.13 参照)。

結果

病原体と感染細胞に影響を与えるホスト エンコード要因の役割を評価します。
上記の感染条件を使用して、入力の野生型Lmの 0.15% は 1.5 h 培養マクロファージ (図 1A) と共同の孵化の後回復します。共同インキュベーション (3 h ポスト感染、hpi) の後続の 1.5 h で実行可能なLmの回復で 4 倍の増加があったし、3 6 hpi から実行可能なLmの回復の追加 7.5-fold 増加があった。以来、細胞外Lmをなくす 1 hpi で共培養する細胞不浸透性の抗生物質のゲンタマイシンを追加すると、1.5 〜 6 hpi の間に実行可能なLmレベルで 30 倍の増加は専ら細胞内増殖を表します。

Lm...

ディスカッション

その迅速かつプロセッシブ細胞感染プログラムLm感染に影響を与える細胞の活動を調査する理想的な病原体です。ホストの要因の数が肯定的または否定的に影響を与えるLm細胞感染^11,12,13,14に同定されています。2 つのような宿主因子研究室、パーフォリン 2 とヘム調節剤の特徴 (P2、こんにちは)、 Lmの感染過程の個別の機能を調節します。P2 欠損細胞はLmに非常に敏感、図 3のように、そしてこの高められた感受性はまた P2 ノックアウト マウス⁴の真実です。P2 表現と P2 欠損マクロファージの詳細な比較研究を示した後者のセルが強く酸性Lmを形成-病原性遺伝子発現を強化につながったファ...

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
ACKライジング	バッファーGibco
ArCアミン反応性補償ビーズ	ライフテクノロジー	ズA10346
BHI(ブレインハートインフュージョン)ブロス	EMDミリポア	110493
セルストレーナー、70&マイクロ;m	VWR	10199-656
コラゲナーゼ D	ロシュ	11088858001
DMEM培地	ギブコ	11965-092
FACSチューブ	BDファルコン	352054
FBS-熱不活性化	シグマ-アルドリッチ	F4135-500ML
ハンクス'平衡塩溶液	Sigma-Aldrich	H6648-6X500ML
LB 寒天	成長細胞 MS	MBPE-4040
LIVE/DEAD 固定可能な黄色の死細胞染色キット	ライフテクノロジー	L349S9
ローダミン・ファロイジン	サーモフィ	ッシャーR415
SP6800スペクトルアナライザー	ソニー
シリンジ28 G 1/2 "1cc	BD	329461
TPP組織培養48ウェルプレート	MIDSCI	TP92048
TPP 組織培養 6 ウェルプレート	MIDSCI	TP92406
UltraComp eBeads	eBioscience	01-2222-42
抗原
CD11b	Biolegend		Flurochrome = PE Cy5, 希釈率 = 1/100, クローン = M1/70
CD11c	Biolegend		Flurochrome = AF 647, 希釈率 = 1/100, Clone = N418
CD45	Biolegend		Flurochrome = APC Cy7, 希釈率 = 1/100, Clone = 30-F11
F4/80	Biolegend		Flurochrome = PE, Dilution = 1/100, Clone = BM8
Live/Dead	Invitrogen		フルロクロム=AmCyN、希釈率=1/100
Ly6C	バイオレジェン		フルロクロム=PacBlue、希釈率=1/200、クローン=HK1.4
MHC II	バイオレジェン		フルロクロム=AF700、希釈=1/200、クローン=M5/114.15.2
NK1.1	バイオレジェンド		フルロクロム=BV605、希釈=1/100、クローン=PK136