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方法論記事

ヒト臍帯由来間葉系幹細胞から早産児と正期産児の分離と性状

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DOI:

10.3791/58806

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2019年1月26日

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1Department of Pediatrics, Kobe University Graduate School of Medicine, 2Department of Pathology, Kobe Children's Hospital, 3Department of Pediatrics, Hyogo College of Medicine, 4Department of Developmental Pediatrics, Shizuoka Children's Hospital, 5Department of Pediatrics, Nihon University School of Medicine

この記事について

サマリー

ひと臍帯 (UC) は、早産、用語は、結果として周産期の期間中に得ることができるし、postterm 配信。このプロトコルで述べる分離・同定 UC 由来間葉系幹細胞 (UC MSCs) の胎児・幼児から妊娠 19 40 週で。

要約

間葉系幹細胞 (Msc) はかなり治療可能性を秘めているし、バイオメディカル分野で注目を集めます。MSCs は、もともとに分離し骨髄 (BM) から特徴、脂肪組織、滑膜、皮膚、歯髄、胎盤など胎児附属物などの組織から得られる臍帯血 (UCB) と臍帯 (UC)。MSCs は、(1) 標準的な培養条件、(2) 表面マーカー発現 CD73 のプラスチックへの付着のための容量を持つ異種細胞集団+/CD90+/CD105+/CD45-/CD34-/CD14-/CD19-/HLA-DR-の表現型、および (3) 過形成分化脂肪細胞、骨細胞、軟骨細胞、細胞療法 (ISCT) 国際社会で現在定義されています。BM は MSCs の最も広く使用されているソースが、BM 吸引の侵襲的な性質は倫理的、アクセシビリティを制限します。MSCs の増殖と分化の能力がバミューダ諸島から得られた一般的にドナーの年齢とともに減少します。対照的に、UC から得られる胎児の MSCs 活発な増殖と分化能力などの利点があります。それは通常、医療廃棄物としてみなされると UC のサンプリングで倫理的な懸念はありません。人間 UC 妊娠 4-8 週で羊膜腔の成長を継続的に開発を開始して長さ、50-60 cm に到達するまでの成長を続け、それは全新生児の配信期間中に分離することができます。難治性疾患の病態への洞察力を得るためには、様々 な妊娠年齢で提供される幼児から UC 由来 Msc (UC MSCs) を使いました。このプロトコルでは、分離、19-40 週間の妊娠時胎児・幼児から UC MSCs の評価について説明します。

概要

間葉系幹細胞 (MSCs) が分離された (BM)1,2骨髄から特徴、さまざまな組織の脂肪組織、滑膜、皮膚、歯髄、胎児附属物などから取得することも3。 MSCs が増殖と脂肪細胞、骨細胞、軟骨細胞に分化することができますする異種細胞集団として認識されます。また、MSCs は傷害のサイトに移行し、抑制する免疫応答を調節する能力を所有している改造し、傷害を修復します。さまざまなソースからの MSCs が数移植片対宿主病、心筋梗塞、脳梗塞45,などの難治性疾患に対する細胞治療のソースとして関心を集めている現在、.

BM は MSCs の最もよく特徴付けられたソースが、BM 吸引の侵襲性は倫理的、アクセシビリティを制限します。MSCs の増殖と分化の能力がバミューダ諸島から得られた一般的にドナーの年齢とともに減少します。これに対し、胎盤、臍帯血 (UCB) など胎児附属物から得られる胎児の MSCs と臍帯 (UC) サンプリングと堅牢な増殖と分化能力6についてあまり倫理的問題を含むの利点があります。,7します。 通常は医療廃棄物として破棄される胎児の肢、間 UCB と UC と見なされます胎児器官胎盤は臍と見なされます。さらに、胎盤と UCB サンプリングし、胎盤と UC を収集、新生児の配信後に処理されるに対し、新生児の配信の瞬間に収集する必要があります。したがって、UC は細胞療法8,9有望な MSC のソースです。

人間 UC 妊娠 4-8 週で羊膜腔の進歩的な拡張の開発を開始、50-60 cm の長さまで成長を続けている、新生児配信10の全体の期間中に分離することができます。難治性疾患の病態への洞察力を得るため、様々 な妊娠年齢11,12で提供される幼児から UC 由来 Msc (UC MSCs) を使用します。このプロトコルを特定し妊娠 19 40 週で胎児・幼児から UC MSCs を特徴付ける方法をについて説明します。

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プロトコル

この研究用ひと試料の使用は、神戸大学大学院医学部 (承認番号 1370 と 1694) の倫理委員会によって承認され、承認されたガイドラインに従って実施します。

1 UC MSCs の分離と培養

注:UC MSCs は正常に分離培養されているし、このプロトコルを拡張 (以上通路番号 4) 200 以上から UCs 受けます。200 以上の中で UCs、100% 示されている成功の UC MSC 分離増殖停止を示されている 15% と 80% 以上が巧妙な UC MSC 拡張を示されているより小さい 5% 未満が偶発的な汚染を示しています。

  1. UC を収集します。
    1. イーグル最小必須培地 (アルファ MEM) 4 ° C で修正された無菌のシザー、アルファの 500 mL のボトル、50 mL プラスチック チューブを準備
    2. 無菌 UC 手術約 5-10 cm の長さにハサミでカットし、帝王切開で新生児の出生後すぐにそれを収集します。
    3. すぐに 50 mL プラスチック チューブに UC を配置し、アルファ MEM チューブに 20-30 mL を追加します。
    4. それは研究室に運ばれるまでは、常温 (RT) UC を格納します。
      注:2 日間の RT で無血清培地で無菌の UC を格納できます。したがって、それが 2 日以内の研究室に配信される場合は、近隣病院から得られる UC を収集できます。
  2. UC を解剖します。
    1. プラスチック トレイ、滅菌ハサミ、鉗子、10 mL ピペット 25 mL のピペット、リン酸緩衝生理食塩水 (PBS) 2 つ 60 mm ティッシュの培養皿の準備、精製酵素ブレンド (テーブルの材料、滅菌 PBS 濃度で再構成したを参照してください。13 Wünsch 単位/mL の-80 ° C で保存し、)、および減らされた血清中の 500 mL ボトル (材料の表を参照してください)。
    2. PBS、精製酵素ブレンド減少血清培地をウォーム アップし、右に培養液 [アルファ MEM 含む 10% 牛胎児血清 (FBS) と 1% 抗生物質抗真菌薬ソリューション (AA) の 4 ° C で保存]
    3. チューブから UC を取り出し、プラスチック製のトレイに置きます。
    4. 重量を量るそして滅菌ハサミで UC の 5 g を解剖します。
    5. 70% エタノール 10 mL を 10 mL のピペットを使用して殺菌のため UC に注ぐ。
    6. 10 ml 2 回 10 mL のピペットを使用して PBS の UC を洗います。
    7. 滅菌 60 mm 培養皿に UC を置きます (図 1ステップ 1 を参照してください)。
    8. 皿に減らされた血清培地 10 mL を追加します。
    9. 約 0.62 Wünsch 単位/ml の最終濃度に到達する精製酵素ブレンドの 0.5 mL を加えます。
      注:伝統的なコラゲナーゼの代わりに精製酵素ブレンドの使用は、収量を改善するために示されている、UC から UC MSCs の生存率が分離されました。
    10. 滅菌ハサミ鉗子 (図 12 のステップを参照) と、2 〜 3 mm の部分に UC をカットします。
      注:このプロセスは約 30 分です。
    11. UC 作品を 5% CO2インキュベーターで 30 分の 37 ° C で孵化させなさい。
    12. 25 mL のピペットが流れやすく小さな断片に部分的にしか消化 UC 部分をカットします。
      注:このプロセスは約 30 分です。
    13. 5% CO2インキュベーターで 15 時間 45 分の 37 ° C で UC の小さな断片を孵化させなさい。
      注:インキュベーションは、乳剤が粘性になるまで継続する必要があります。総消化時間は約 120 分です。早産児から UCs を使用する場合ただし、消化時間短縮できますので、これらを簡単にカットして消化します。
  3. UC MSCs を分離します。
    1. 4 50 mL プラスチック チューブと培養液 500 ml を準備します。
    2. 各管で約 7.5 mL で 25 mL のピペットを使用して 2 つの 50 mL プラスチック チューブに UC ホモジネートを分割します。
    3. 各チューブに培養液 20 mL を加え、よく混ぜます。
    4. UC 由来細胞を収集するために 25 mL のピペットを使用して、新しい 50 mL 採取管の上に置かれた 100 μ m 携帯こし器を通って各 UC の磨砕液をフィルターします。
      注:このプロセスは、消化の UC ソリューションは、粘着性、約 15 分をかかります。
    5. 5 分間 1,000 x g で 2 つの管を遠心します。
    6. 慎重に、上清を吸引し、それを破棄します。
    7. 5 ml の培地の 2 つの管の細胞ペレットを再懸濁します。
    8. 5% CO2インキュベーターで 37 ° C で 60 mm の板を新しい文化に細胞懸濁液を転送 (図 1手順 3 を参照)。
  4. 文化 UC-MSCs。
    1. トリプシン-EDTA (0.25 w/v%)、PBS をウォーム アップし、培養液 (アルファ MEM 10 %fbs と 1% の AA を含む) に RT。
    2. セルは、60 mm のプレートに接続されて、培養培地を取り除き、5 mL の破片と赤の血液細胞を削除する 2 回 PBS で洗浄します。
      注:添付の電池は通常初期めっき後 3-5 日時に現れる (図 1ステップ 4 を参照してください)。
    3. 週 2 回の培養液を交換し、90-100% の confluency まで 37 ° c 5% CO2インキュベーターで孵化させなさい。
      注:初期めっき後 7-14 日通常かかります。
    4. 5 ml の PBS のセルを 2 回洗うトリプシン-EDTA の 0.5 mL を追加し、5-10 分の 37 ° C で孵化させなさい。
    5. いつセル丸くなり、分離、培養液 9 mL を加え、よく混ぜるトリプシンを不活化します。
    6. 5% CO2インキュベーターで 37 ° C で 100 mm の板を新しい文化に細胞懸濁液を転送 (図 1ステップ 5 を参照してください)。
    7. 週 2 回の培養液を交換し、90-100% の confluency まで 37 ° c 5% CO2インキュベーターで孵化させなさい。
      注:初期めっき後 4-8 日通常かかります。
    8. 10 ml の PBS のセルを 2 回洗うトリプシン-EDTA の 1 mL を追加し、5-10 分の 37 ° C で孵化させなさい。
    9. いつセル丸くなり、分離、培養液 9 mL を加え、よく混ぜるトリプシンを不活化します。
    10. 2 つの新しい 100 mm プレートと 37 ° c 5% CO2インキュベーターで培養に細胞懸濁液を転送 (図 1ステップ 5 を参照してください)。
    11. 10 通路までサブカルチャー (1:2 分割) を繰り返します (図 1ステップ 5 を参照してください)。
      注:少ない合流条件下で培養した細胞は、以前の増殖停止に到達する傾向がある、ので 1:2 の分割比で細胞を通過することが重要です。
    12. 細胞表面マーカーの解析、細胞分化アッセイおよび他の実験 5 ~ 8 通路でセルを使用します。
      注:できるだけ長くのための活発な増殖を保つためには、セルは一般的に以上の 70-80% 合流条件下で培養されます。

2 UC MSCs の表面マーカーの発現

  1. 100 mm プレート内のセルを準備し、1 ml のトリプシン-EDTA 5-10 分の 37 ° C での関連付けを解除します。
  2. 5 分間 1,000 x g で 9 mL の培養液の遠心分離機を追加します。
  3. 上清を吸引し、それを破棄します。
  4. 10 ml の PBS の細胞ペレットを再懸濁します、1,000 x g で 5 分間遠心はこの洗浄工程を 2 回繰り返します。
  5. 〜 1 × 106セル/mL に流れフローサイトメトリー (FCM) バッファー (PBS 2 ミリメートルの EDTA および 10% のブロッキング試薬を含む) を持つ細胞を再懸濁します。
  6. 1.5 mL チューブに細胞懸濁液の 50-100 μ L に転送します。フィコエ リスリン (PE) を追加-CD14、CD19、CD34、CD45、CD73, CD90, CD105、または HLA-DR; 抗体の共役45 分間氷の上を孵化させなさい。
  7. FCM ではセルを洗浄バッファー 2 倍と 0.2% 生存率色素溶液の 50-100 μ L を追加 (材料の表を参照してください)。
  8. 70 μ m 携帯こし器を通って 15 分、FCM バッファー 2 倍とセルを洗浄するフィルター セルに RT で孵化させなさい。
  9. FCM を介して細胞を実行し、FCM 製造元の指示に従ってソフトウェアを使用して得られた結果を分析します。

3. 過形成分化 UC MSCs の

  1. 脂肪細胞形成を実行します。
    1. 5 × 103セル/mL の濃度で培養液に細胞懸濁液を準備します。
    2. 12 ウェル プレートで細胞を懸濁液の 1 mL をプレートし、37 ° c ~ 24 h の 5% CO2インキュベーターで孵化させなさい。
    3. 脂肪細胞分化培地と培養液を交換 (材料表参照) し, 5% CO2インキュベーターで 37 ° C で 2-3 週間。週に 2 回脂肪細胞分化培地を変更します。
    4. PBS のセルを 3 回洗浄します。
    5. 室温 30 分 4% ホルムアルデヒド溶液セルを孵化させなさい
    6. 洗浄のセル PBS 3 回と 60% イソプロパノール 3 回。
    7. 0.5% オイル赤い O ソリューション準備 84 mg のオイルを溶解することにより赤 O の 100% イソプロパノールと 6.7 mL の追加の 10 mL の蒸留水します。20 分間常温 0.5% オイル赤い O 溶液の 1 ml の細胞を染色します。
    8. 3 回 60% イソプロパノールと細胞を洗浄し、顕微鏡下で可視化します。
  2. 骨形成を実行します。
    1. 1 × 104セル/mL の濃度で培養液に細胞懸濁液を準備します。
    2. 12 ウェル プレートで細胞を懸濁液の 1 mL をプレートし、37 ° c ~ 24 h の 5% CO2インキュベーターで孵化させなさい。
    3. Osteogeneic 分化培地と培養液を交換 (材料の表を参照) と 1-2 週間の 37 ° c 5% CO2インキュベーターで孵化させなさい。週に 2 回、骨分化培地を変更します。
    4. PBS のセルを 3 回洗浄します。
    5. 室温 30 分 4% ホルムアルデヒド溶液セルを孵化させなさい
    6. PBS のセルを 3 回洗浄します。
    7. アリザリンの 200 mg を溶解することにより 2% アリザリンレッド S ソリューションを準備 10 mL の蒸留水でレッド S。3 分間常温 2% アリザリンレッド S 溶液 1 mL の細胞を染色します。
    8. 3 回 PBS で洗浄し、顕微鏡下で可視化します。
  3. 軟骨を実行します。
    1. 1.6 × 107セル/mL の濃度で培養液に細胞懸濁液を準備します。
    2. 12 ウェル プレート (存在しており文化) の井戸の中央に細胞懸濁液 5 μ L の液滴を置き、37 ° c 2-3 h の 5% CO2インキュベーターで孵化させなさい。
    3. 優しく軟骨分化培地 1 mL を追加 (材料の表を参照してください)、4-7 日の 37 ° c 5% CO2インキュベーターで孵化させなさい。週に 2 回軟骨分化培地を変更します。
    4. PBS のセルを 3 回洗浄します。
    5. 室温 30 分 4% ホルムアルデヒド溶液セルを孵化させなさい
    6. PBS のセルを 3 回洗浄します。
    7. 0.05% トルイジン ブルー溶液を準備するには、500 ml の 0.1 M 酢酸緩衝液 ph 4.1 のトルイジン ブルーの 250 mg を溶解します。30 分常温 0.05% トルイジン ブルー溶液の 1 ml の細胞を染色します。
    8. 洗浄のセル PBS で 3 回、顕微鏡の下で視覚化します。

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結果

UC コレクションから MSC 文化までの手続きは、図 1にまとめます。約 5-10 cm の長さの UC は、すべての新生児の帝王から収集できます。UC は、妊娠の 4-8 週間で開発を開始して、図 2に示すように、長さ 50 ~ 60 cm まで成長を続けています。図 3と図 4に示すように、2 つの動脈 (A)、1 つ静脈 (V)、コード ライニング (CL)、Wharton のゼリー (WJ) UC があります。UC MSCs は、すべてのコード領域または全体のコード13から分離できます。早い妊娠年齢児から UC は壊れやすく、単一コード領域に郭清困難、UC MSCs は全体のコード11,

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ディスカッション

MSCs は、といったさまざまな組織から分離することができますで、同じ表現型マーカーすべてエクスプレスを行う細胞の異種集団です。ここでは、我々 は早産児と正期の幼児からコレクションと UC の郭清をガイドして UC MSCs の分離と培養したりできるようにプロトコルを説明しました。このプロトコルに従って正常に胎児・幼児妊娠 19 40 週で配信され、難治性疾患の病態のいくつかの側面を表すことを示したから ISCT 基準19を満たす UC MSCs を分離しました。期間は出生前の開発11,12。

BM 由来 Msc (BM MSCs) で若いドナー由来の BM MSCs は一般的に古い同等より大きい増殖や発生の可能性を表示し、細胞療法20,21のより多くの可能性を保持します。同様に、胎児の妊娠の 8-12...

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開示事項

著者が明らかに何もありません。

謝辞

この作品は、Scientific Research (C) の補助金によって支えられた (許可番号: 25461644)、若手研究 (B) (番号を付与: 15 K 19614、26860845、17 K 16298) 日本学術振興会科研費の。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
50 mL プラスチックチューブAS One Coporation, 大阪, 日本Violamo 1-3500-22
12-well plateAGC Techno Glass, Tokyo, JapanIwaki 3815-012
60 mm dishAGC Techno Glass, Tokyo, JapanIwaki 3010-060
Cell strainer (100 μm)サーモフィッシャーサイエンティフィック、ウォルサム、マサチューセッツ州 Falcon 35-2360
セルストレーナー (70 μm)サーモフィッシャーサイエンティフィック、ウォルサム、マサチューセッツ州 Falcon 35-2350
Alpha MEM和光純薬 Pure Chemical, 大阪, 日本135-15175
ウシ胎児血清Sigma Aldrich, St. Louis, MO172012
Reduced serum mediumThermo Fisher Scientific, waltham, MAOPTI-MEM Gibco 31985-070
Antibiotic-antimycoticThermo Fisher Scientific, Waltham, MA Gibco 15240-062
Trypsin-EDTA和光純薬, 大阪, 日本209-16941
PBSTakara BIO, 滋賀, 日本T900
精製酵素ブレンドロシュ, マンハイム, ドイツリベラーゼ DH 研究用グレード 05401054001
CD14 BD に対する PE-標識マウス一次抗体BD バイオサイエンス, フランクリンレイクス, ニュージャージー347497 ロット: 3220644、RRID:
PE標識マウス一次抗体、フランクリンレイクス、ニュージャージー340364ロット:3198741、RRID:
AB_400018 PE標識マウス一次抗体、フランクリンレイクス、ニュージャージー555822ロット:3079912、RRID:
AB_396151 PE標識マウス一次抗体、フランクリンレイクス、ニュージャージー555483Lot: 2300520, RRID: AB_395875
PE-conjugated mouse primary antibody against CD73BD Bioscience, Franklin Lakes, NJ550257Lot: 3057778, RRID:
AB_393561 PE-conjugated mouse Primary Antibody against CD90BD Bioscience, Franklin Lakes, NJ555596Lot: 3128616, RRID:
AB_395970 PE-conjugated mouse Primary Antibody against CD105BD Bioscience, Franklin Lakes, NJ560839ロット:4339624、RRID:
AB_2033932 PE標識マウス一次抗体、HLA-DRBD Bioscience、フランクリンレイクス、ニュージャージー347367ロット:3219843、RRID:AB_400293
PE標識マウスIgG1 kアイソタイプBDバイオサイエンス、フランクリンレイクス、ニュージャージー555749ロット:3046675、RRID:AB_396091
PE標識マウスIgG2a kアイソタイプBDバイオサイエンス、フランクリンレイクス、ニュージャージー555574ロット:3035934、RRID:AB_395953
PE標識マウス IgG2b k アイソタイプBD Bioscience, Franklin Lakes, NJ555743Lot: 3098896, RRID: AB_396086
Viability dyeBD Bioscience, Franklin Lakes, NJFixable Viability Stain 450 562247
Blocking reagent大日本製薬, 大阪, 日本Block Ace UKB80
FCMBD Bioscience, Franklin Lakes, NJBD FACSアリア III Cell Sorter
FCMソフトウェアBD Bioscience, Franklin Lakes, NJBD FACSDiva
Adipogenic differentiation mediumInvitrogen, Carlsbad, CAStemPro Adipogenesis Differentiation kit A10070-01
骨分化培地Invitrogen, Carlsbad, CAStemPro 骨形成分化キット A10072-01
軟骨分化ミディアム Invitrogen, Carlsbad, CAStemPro 軟骨形成分化キット A10071-01
FormaldehydePolyscience, Warrigton, PA16% UltraPure Formaldehyde EM Grade #18814
Oil Red OSigma Aldrich, St. Louis, MOO0625
Arizarin Red SSigma Aldrich, St. Louis, MOA5533
Toluidine BlueSigma Aldrich, St. Louis, MO
顕微鏡キーエンス 大阪府BZ-X700
州 CD19 BD Bioscienceに対するAB_400312州 CD34 BDバイオサイエンスに対する州 CD45 BDバイオサイエンスに対する州 州 州 州 198161

参考文献

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