方法論記事

腸管移植片対宿主病と生きたマウスのミニ内視鏡評価の誘導

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DOI：

10.3791/58871

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2019年2月11日

 ,  ,  ,  , 
1Department of Internal Medicine 1, University Erlangen-Nürnberg, University Hospital Erlangen, 2Institute of Pathology, Department of Nephropathology, University Hospital Erlangen, 3Deutsches Zentrum Immuntherapie (DZI), University Hospital Erlangen

この記事について

サマリー

ここでは、同種造血幹細胞移植を説明し遠位結腸の反復的なミニ内視鏡評価、存在、特性、およびライブ内で大腸の炎症の重症度をその場でプロトコルを提案します。マウス腸管移植片対宿主病に苦しんでいます。

要約

急性移植片対宿主病 (GvHD) は最も重篤な合併症が患者以前同種造血幹細胞移植 (同種 HCT) 顔を表します、頻繁に悪い臨床結果と関連付けられる。しばらくの間、例えば、皮膚 GvHD 症状は通常確立された免疫抑制療法に反応と致命的なコース、存在および腸の半ば-に-低部分の特に、腸管 GvHD の強度、したがってを取っていません。結果に強く影響、全体的な急性 GvHD。 治療選択肢を患者の生存率は中等度疾患を緩和する効果のみをもたらす古典的な免疫抑制剤に本質的に限られています。したがって、腸内細菌叢の変化組織住民免疫カスケードについての詳細な知識とイベントの基になるメカニズムを理解する前、及び腸管 GvHD 発症後に、間質反応が急務、病因と革新的な治療方法を開発します。GvHD のマウスモデルが頻繁に識別し、分子および推定腸管 GvHD を運転経路を機能的評価に採用します。評価し、グレードの急性 GvHD に確立されたスコアは日常的にむしろ全身 GvHD を反映するさまざまなパラメーターで構成されていますので具体的に監視し、時間をかけて腸内の炎症を評価する手段はない本質的に症状です。消化管 GvHD の詳細な評価は、それによって本質的に縦を除く、安楽死のマウスを用いた研究に制限されている (すなわち、キネティック) 与えられた実験条件下で結腸のコンパートメントの分析 (例えば、抗体炎症性サイトカインの封鎖) (すなわち、生体内) 生きているマウスで。ここで説明した同種 HCT 投与マウスの遠位結腸のミニ内視鏡その場で評価できます) 腸の炎症や b) 下流解析のための組織サンプルを収集するオプションのさまざまな側面の詳細な巨視的評価観察期間のコースを介して様々 な時間ポイント。全体的に、ミニ-内視鏡的アプローチは、臨床非侵襲的モニタリングおよび腸管 GvHD の影響評価の主要な進歩を提供します。

概要

直接造血幹細胞コンパートメントからと制御不能を生じた造血器腫瘍、急速に進んでいると重篤な免疫介在性疾患は、しばしば兆候同種 HCT1,2を実行します。しかし、予後の有益な移植片対腫瘍反応の発生の会計処理がドナーのリンパ球がよく誘発・助長する同種 HCT 受信者内の健康な組織のコンポーネントの不要な免疫介在性攻撃、移植片対宿主病3を呼び出されるプロセス。腸、いわゆる腸管 GvHD の症状は、急性 GvHD、重度のフォームは、関連付けられ、高い死亡率1,2,4の最も恐ろしい合併症を表しています。

同種 HCT の全体的なマウスのモデルは、識別や GvHD5病態免疫メカニズムを調査する貴重なツールとして浮上しています。ただし、運動評価の例えば、生きたマウスに時間をかけて新規治療の有益な効果は日常的に基づいて臨床 GvHD によるスコア6。これらのスコアが反映するように適切な例えば、全体的な疾病負担 (すなわち、全身の GvHD) 臨床スコア不足臓器特異症状を確実にミラーへの感受性 (例,腸内で)。したがって、結論は、スコアリング システム通常これらに基づく特定の治療的介入の腸保護効果に関して、例えば短い落ちる。

新規全身の発明によって主要な進歩にもかかわらず画像診断法、発光や蛍光遺伝子マウス モデル7,8の使用法との組み合わせで直接、具体的は方法論腸内を評価する生きているマウスで GvHD の症状が欠けています。したがって、次のセクションで説明されている腸管 GvHD 表現型の内視鏡的評価のプロトコルの後ろの理論的根拠は、この障害を克服するためにです。さらに、モチベーションは以来、これまでのところ、細胞、形態学的、および分子特性の詳細な評価実験マウスの数を減らすにも (例えば,病理組織学的、分子生物学) 腸管 gvhd症状は、実験マウスの犠牲を最終的に必要があります。

当院は大腸の症状同系大腸炎モデル9間のミニ内視鏡的評価の方法論上以前報告しています。ここで提示されたプロトコル、洗練され、内視鏡を適応して私は完全に設定を一致しない alloresponse 駆動 alloreactive の移植時に腸管 GvHD と生きたマウス大腸炎 MHC クラスで HCT およびドナーのリンパ球のためのスコアリング マトリックス.腸管 GvHD 関連大腸病変を反映するように適した 4 つのパラメーターを同定しました。さらに、我々 は容易に腸管 GvHD 時点時点で与えられたマウスでの重症度について読者に知らせる新しいスコアの結果により、任意の 1 つの決定要因の微調整グレーディング システムを設立しました。病理組織学的分析は、特定のしきい値以上の内視鏡スコアは中程度の高級組織の炎症を予測して確実に確認しました。したがって、ミニ内視鏡的評価は、日常的に実験的マウスの犠牲を必要とする金本位制の病理組織学的に動作している代替を示す表示されます。重要なは、このプロトコルは、実質的に任意の特定の時点に適用できるし、病気10,11のコースの間に繰り返し使用できます。さらに、発光依存アプローチの使用と対照をなして交配遺伝子改変マウスのような激しい労働や時間がかかる対策も不要と、あらゆるマウスの線上の方法論を適用できるそれ故に、関心します。

まとめると、重症の消化管 GvHD 同種 HCT 患者の有害な臨床的視点を与えて急速な科学の進歩と免疫病態分子メカニズムに洞察力が急務します。同様に、重要な倫理的な考慮事項を要求する知識のゲインが実験的マウスの最小限の使用と達成されるべき。したがって、両方の実験的な作品チェーンを監視し、ライブの実験的マウス腸管 GvHD をグレードでコロンのシリアル ミニ内視鏡評価を実装して腸管 GvHD を探索研究コミュニティの要求を進めることができる認識モデルとして説明し、ここで提示されたプロトコルで検証。

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プロトコル

ここで説明する実験方法は、Mittelfranken, ババリア, ドイツの政府によって承認されています。

1. GvHD 誘導

  1. 0 日目: 受信者のマウス全身照射
    1. 女性 CD45.2+ H2kd を使用して+ BALB/c マウス 10 週間、少なくとも受信者として古い。
    2. 計量し、GvHD 誘導前に受信者のマウスの体重を記録します。
      注:受信者が最小の本体重量 20 g を持っていることを確認します。開始体重、GvHD の誘導、進行の過程で個々 のマウスの体重減少を計算する基準値となります。
    3. X 線照射のコンテナーに最大 5 つのマウスを置きます。
    4. X 線の 8 Gy の単回投与による全身照射法によるマウスを照射します。Cs137を放射線源として使用します。
  2. 1 日目: T 細胞除去骨髄に放射線照射したマウスの再構成
    メモ:セクション 1.2, の下で詳細なアウトラインの同種骨髄細胞の移植は、照射後 24 h 内で起こるべきであります。実行無菌培養で以下に述べる手続フードし、フィルター処理された試薬を使用します。同種の CD45.1/Ly5.1 B6 を使用します。SJL-Ptprca Pepcb/BoyCrl マウスの T 細胞除去骨髄ドナーとして。
    1. CD45.1/Ly5.1 B6 を安楽死させます。受信者の BALB/c マウスの照射後 12-24 時間制度ガイドライン同種骨髄細胞を寄付 SJL マウス。このため、CD45.1/Ly5.1 B6 を麻酔します。5% イソフルレンの吸入による SJL マウス。呼吸停止後 1 分以上のイソフルラン暴露を続行し、頚部転位によって安楽死を確認します。
    2. 毛皮、70% エタノールで十分にマウスの皮膚を消毒します。
    3. きれいにマウスの位置は、腹臥位では実験者に直面してその後半部、マウス、鞘を取り組んでいます。長さ 13 cm Semken 鉗子の先端と鋸歯状の湾曲したヒント アキレス腱に毛皮を持ち上げます。鉗子と硬化 8.5 cm 高級はさみストレート ヒントとかかとの間の皮膚を切開します。
    4. (すなわち、上下肢と腰背部に太ももかかと) から頭側切開を延長します。鉗子の助けを借りて、後肢から皮膚や毛を削除します。
    5. 他の後肢で同じ手順を実行します。
    6. 隣接する股関節を介して切断して後肢を削除します。
    7. リアの足を切り取る。膝関節をカットします。太ももと 92 mm のペトリ皿リン酸緩衝生理食塩水 (PBS) 液氷の上でいっぱいで一緒にすべての後肢のシャンクを格納します。
    8. すべての太もも、すねからできるだけ多くの筋肉組織を削除することによって、大腿骨と脛骨の骨を慎重にきれい。大腿骨と脛骨の骨を 50 mL チューブ ステップ 1.2.7 で収集したすべての脛骨と大腿骨の骨まで濡れた氷上筋肉組織から掃除が生殖不能 RPMI 1640 媒体と場所に転送します。
    9. 骨髄を分離するには、RPMI 1640 媒体でいっぱい (92 の mm の直径) をシャーレに 50 mL のチューブから (これに記載されているステップ 1.2.8 として掃除されている) 時に 1 つの大腿骨や脛骨の骨を転送します。大腿骨や脛骨骨髄を含む骨の空洞へのアクセスを取得するメスとの両端を切ってください。
    10. RPMI 1640 培地 5 mL を 50 mL 採取管を準備します。骨の空洞に RPMI 1640 培地 1 ml 充填 1 mL 注射器に接続されている 26 G 針を挿入し、プランジャーを押すことによってコレクションの管にキャビティから骨髄をフラッシュします。
    11. 1.2.10 軽くて光沢のある骨が表示されるまで、手順を繰り返します (すなわち、骨空洞が目に見えて赤みを帯びた骨髄を欠いている)。空の骨を破棄します。
    12. 1.2.9 - 1.2.11、ステップ 1.2.8 からすべての大腿骨と脛骨の骨を使用しての手順を繰り返し、ステップ 1.2.10 から同じ 50 mL コレクションの管ですべての回復した骨髄の部分を収集します。1.2.8 のステップのすべてのボーンがそれに応じて処理されるまで濡れた氷の上コレクションの管を保ちます。
    13. フラッシュ、もろい骨髄の部分を上下にそっとピペッティングによる単一細胞懸濁液を作成します。新しい 50 mL コレクション チューブに配置 40 μ m メッシュ スクリーン携帯こし器を通って骨髄単一細胞懸濁液をフィルターします。
    14. 4 ° C で 5 分間 450 x gで骨髄単一細胞懸濁液を含む 50 mL コレクション チューブを遠心分離します。上清を捨てます。
    15. 5 mL の ACK 溶解バッファー (1 mM ナ2EDTA; 10 mM KHCO3; 144 mM NH4Cl pH 7.2) 赤い血セル換散のためにペレットを再懸濁します。室温で 3 分間細胞懸濁液を孵化させなさい。その後、すぐに細胞懸濁液に PBS 溶液 10 mL を追加します。
    16. 450 x g 4 ° C で 5 分間の懸濁液を遠心分離します。上澄みを廃棄し、PBS 溶液 2 mL に細胞を再懸濁します。
    17. 診断を使用して、骨髄のセルをカウントします。6 x 106細胞細胞精製後、細胞の純度を確認する流れフローサイトメトリー解析のための因数を保持 (1.2.20 の手順を参照してください)。
    18. 培養骨髄細胞から T 細胞の枯渇、市販細胞精製キットを使用します。次の製造元のプロトコル全骨髄細胞から CD90.2+細胞 (すなわち、リンパ球) を使い果たす磁気。
    19. 1.2.18、診断の手順で説明するように分離されている T 細胞除去骨髄細胞を数えます。1.2.20 の手順で説明されているように流れフローサイトメトリー分析後に実行される 1 x 10 の6セルの因数を保持します。
      注:マウスの 1 つのドナー由来の平均細胞収率は、通常、2 x 107 107 T 細胞除去骨髄細胞 x 3.4 〜。
    20. フローサイトメトリーを用いた正常な T 細胞の枯渇を確認します。1 x 106セル、手順 1.2.17 (磁気細胞分離前に骨髄細胞) と次抗体 1.2.19 (磁気細胞分離後の T 細胞除去骨髄細胞) から保持を染色: α-CD45.1 (A20)、α-CD3 (17A2)、α CD4 (GK1.5) と α-CD8α (53-6.7)。無染色のコントロールとコントロールの単一染色、流れの cytometer を設定するステップ 1.2.17 から残りのセルを使用します。
      1. 汚損プロシージャ フロー フローサイトメトリーを実行する V 下 96 ウェル プレートのウェルに各サンプルから 1 x 10 の6セルを転送します。
      2. 4 ° C で 5 分間 450 x gで 96 ウェル プレート (ステップ 1.2.20.1) 内のセルをスピンします。上澄みを廃棄し、FACS バッファー (3% を添加した PBS は、ウシ血清をフィルタ リング) を 100 μ l 添加の細胞を再懸濁します。
      3. 遠心分離機の 4 ° C で 5 分間 450 x gで 96 ウェル プレート内のセル上清を捨てます。
      4. 単一染色 FACS バッファーの 100 μ L のサンプルを選択 (ステップ 1.2.20 と比較) の抗体の適切な量を追加します。
      5. 前から保存骨髄細胞採取を別々 に染色する十分な適切な量を含む全ての抗体 (マスター ミックス) の混合物を準備 (手順 1.2.17 参照) と後 (手順 1.2.19 参照) 磁気 T 細胞の枯渇。両方の因数にマスター ミックスの 100 μ L を追加します。
      6. FACS バッファーのだけ 100 μ L を無染色のサンプルに追加します。
      7. 暗闇の中で 4 ° C で 20 分の 96 ウェル プレート内のセルを孵化させなさい。
      8. FACS バッファーを 100 μ l 添加し、遠心分離機の 4 ° C で 5 分間 450 x gで 96 ウェル プレート内のセル上澄みを廃棄し、FACS バッファーの 100 μ L に細胞を再懸濁します。
      9. 4 ° C で 5 分間 450 x gで細胞を遠心分離します。上澄みを廃棄し、FACS バッファーの 250 μ L で細胞を再懸濁します。
      10. 5 mL ポリスチレン丸底チューブにサンプルを転送し、(手順 1.2.20 参照) 細胞サンプルを特徴づけるために用いる抗体のラベルに使用された蛍光分子を検出することができる流れの cytometer 楽器でそれらを分析します。
      11. 磁気細胞分離前後の細胞組成を比較します。
        注:約 95% の純度 CD45.1+CD3- (すなわち、T 細胞除去骨髄) ライブのゲート内のセルは通常達成されます。
    21. T 細胞除去骨髄細胞懸濁液 2 を洗う x PBS 溶液 (450 x g 4 ° C で 5 分間) で、最後に、5 x 107セル/mL に細胞濃度を調整する PBS 溶液中の細胞を再懸濁します。注射まで濡れた氷の上細胞を保ちます。
    22. (参照セクション 1.1) 前日に照射した受信者のマウス T 細胞除去骨髄細胞を注入します。
      1. 防漏室で実験的マウスを置き、最大 4% の吸入による麻酔イソフルラン、マウスが意識するまで。立ち直り反射の消失をテストすることによって鎮痛や意識消失を確認し、ペダルの後の損失が反射を撤回します。
      2. 5 x 106 T 細胞除去骨髄細胞 (すなわち、5 x 107セル/mL の 100 μ L) 注入 PBS 溶液 1 mL 注射器 30 G 針装備を使用して 静脈静脈洞を含む球空間に。
  3. 2 日目: T 細胞伝
    注:滅菌のティッシュ文化フードの下記載されている手順を実行し、フィルター処理された試薬を使用します。CD45.2 C57Bl/6 (野生型; を使用します。Alloreactive T 細胞のドナーとして WT) マウス。コンジェニック マーカー システムの使用により、受信者の識別 (CD45.2+ H2kd+ Balb/c マウス) とドナーの造血細胞型 (骨髄細胞: CD45.1+ H2kb+ B6。SJL マウス;同種の T 細胞: CD45.2+ H2kb+ C57/Bl6 マウス)。
    1. 適用に従って c57bl/6 マウスを安楽死制度のガイドラインと当局。そのため、濃度 5% イソフルレンの吸入によるマウスを麻酔します。呼吸停止後 1 分までイソフルラン暴露を続行し、頚部転位による安楽死を確認します。毛皮、70% エタノールで十分にマウスの皮膚を消毒します。
    2. 50 mL のコレクション チューブに 40 μ m メッシュ スクリーンとストレーナーを配置します。脾臓を取り外し、こし器の上に置きます。
    3. シリンジのプランジャーをこし器に脾臓を comminute します。ストレーナーとシリンジのプランジャーはすべて脾細胞を収集する PBS で洗います。
    4. 遠心分離機の 4 ° C で 5 分間 450 x gで 50 mL のコレクション チューブ内のセル上清を捨てます。
    5. 3 mL の赤血球を溶解する ACK 溶解バッファーで脾細胞を再懸濁します。3 分後、10 mL の PBS を追加、および遠心分離機の 4 ° C で 5 分間 450 x gで細胞に細胞懸濁液を孵化させなさい上澄みを廃棄し、PBS の脾細胞を再懸濁します。
    6. 診断を使用して、脾臓のセルをカウントします。1.3.9 のステップで精製の大きさを評価するための流れの cytometry 分析 6 x 10 の6セルの因数をそらします。
    7. 合計 CD3 の+ T 細胞総脾細胞から分離市販細胞精製キットを使用します。次の製造元のプロトコル、脾 T 細胞を分離します。
    8. 脾の CD3 をカウント+ T 細胞に従ってステップ診断 1.3.7。フローサイトメトリー解析のための 1 x 10 の6 T セルの因数を保持します。
      注:脾 T の平均収量は 1.3 × 10 から磁気細胞分離範囲によって分離されたドナー マウスあたりセル 2 x 10 の7セルに7 。
    9. フローサイトメトリーによる細胞分離の成功を確認します。汚損のプロトコルの詳細についてを与えるし、1.2.20.1 - 1.2.20.10 の手順に従います。
      1. 次抗体で (磁気細胞分離) 後のステップ (前磁気細胞分離) に、1.3.6 と 1.3.8 1 x 106脾細胞を染色: α CD45.2 (104)、α-CD3 (17A2)、α-CD4 (GK1.5)、α-CD8α (53-6.7)。
      2. 無染色コントロールと単一それぞれ抗体染色の流れの cytometer を設定するステップ 1.3.6 から残りのセルを使用します。
      3. 磁気細胞分離前後の細胞組成を比較します。
        注:純度 CD45.2+CD3 の ≥95%+ T のリンパ球のライブ ゲート内のセルを達成べきであります。
    10. 洗浄 T 細胞 PBS で 2 倍 (4 ° C で 5 分間g 450 x)、最後に、7 × 106セル/mL に細胞濃度を調整する PBS 溶液中の細胞を再懸濁します。注射まで氷の上細胞を保ちます。
    11. Alloreactive、以前 CD45.1+ T 細胞除去骨髄細胞 (手順 1.2.22 参照) を受けた照射の balb/c マウスに、(手順 1.3.10 参照)、脾の T 細胞を注入します。
      1. その意識を失うまで最大 4% イソフルランにさらされて防漏室でマウスの実験を配置することによって麻酔を誘導します。立ち直り反射の消失をテストすることによって鎮痛や意識消失を確認し、ペダルの後の損失が反射を撤回します。
      2. 0.7 x 106 alloreactive CD3+ T を注入 30 G 針装備 1 mL 注射器を用いた細胞 (すなわち7 x 106セル/mL の 100 μ L) PBS 溶液 (1.3.10 のステップを参照)、球後に静脈内誘発する GvHD。 マウスの空間は、これらのマウスを実験群として命名します。
      3. 100 μ L の PBS、単独での球空間に静脈内投与マウスの別のグループを注入し、その後と呼ばれる対照群としてこのグループを命名"いいえ T 細胞移植マウス (ない)」。

2. 全身 GvHD の評価

注:ライセンスし、動物の施設内で生きたマウスを処理するために装備の実験室周辺の不稔にこの手順を実行します。

  1. 個々 のマウスで GvHD の臨床経過をたどる具体的には、評価し、実験的マウス 3 倍以下、クックら6が以前に確立したスコアリング システムから適応の得点システムに基づく GvHD 症状の有無を 1 週間のスコアします。
    1. 個別に各マウスの重量を量る、重量を記録し、特定日 0 (ステップ 1.1.2) 実験 (100% 相当) の開始前に決定された体重参考体重を計算します。グレード 0、体重減少 10% と 25% グレード 1、グレード 3 の 25% 以上の減量と開始の重量の 10% 未満の重量損失をスコアします。
    2. それぞれのマウスは、通常のアクティビティ レベルで目の肥えたマウスの活動レベルをスコア (スコア = 0) 緩やかな減少の活動レベルをマウスから (スコア = 1) と静止の動作とマウス外的刺激でない限り、(スコア = 2)。
    3. 通常、光沢のある、ボサボサの毛皮をそれによって差別毛皮テクスチャをスコア (スコア = 0) 適度に波立たせられた毛皮から (スコア = 1) とはげスポットの存在 (スコア = 2)。
    4. 肌の質感は、正常な皮膚を差別をスコア (スコア = 0) (例えば、尾および足) で皮膚をスケーリングの散発的なスポットから (スコア = 1)、明白なスケーリングと痛い皮膚エリア (スコア = 2)。
    5. 分泌されたスツール分数の整合性を分析します。スコアをグレード 0 正常 (すなわち、ハードの一貫性) 便、グレード 1 の変形と柔らかい便と便と一貫性なしと、それ故に、2 級の重度の下痢便。
    6. マウスあたり 12 の最大の臨床スコア別に得点パラメーターはすべてをまとめます。
  2. 検討し制度適用のガイドラインに従い、個々 のマウスの現在の病気の重大度レベルによる実験を中止の条件を評価し、動物のプロトコルを許可します。

3. 消化管 GvHD の評価

  1. 遠位大腸領域の小型内視鏡による GvHD 関連病変の得点
    メモ:実験室ライセンス、動物の施設内で生きたマウスを処理するためにので以下の実験周辺でこれを実行します。小動物用が承認されたミニ内視鏡ワークステーションを使用します。
    1. 内視鏡検査鞘 (1.9 mm の直径) と長さ 10 cm の望遠鏡を覆うことによって内視鏡デバイスを準備します。きれいにし、水とエタノールで内視鏡を消毒します。
    2. コンピューター、調節可能なキセノン光源とカメラ モジュールの切り替え、レンズに近いオブジェクトが明確なイメージを与えることの方法でフォーカスを設定します。
    3. 内視鏡の鞘に空気ポンプを接続します。空気の流れを可視化、水で満たされたビーカーのガラスに、内視鏡の先端を浸し。空気ポンプと内視鏡の鞘の間の弁を調整することにより空気の流れを調節します。いくつか連続して昇順で反映、ゆっくりと、一定の空気の流れを調整する泡。
    4. 防漏チャンバーにマウスを配置します。4% の吸入による麻酔イソフルラン マウスが意識するまで。立ち直り反射の消失をテストすることによって鎮痛および反射の不在の状態を確認し、ペダルの後の損失を撤回する反射。
    5. 使用される動物のプロトコルに従って適切な獣医の麻酔機を使用します。大腸内視鏡検査ワークスペースに商工会議所からマウスを転送します。ここでは、粗野で (これは、麻酔器に接続)、きれいな上に鼻と、麻酔下マウスの位置は、マウスは腹臥位でその後半部と実験者に直面して、鞘を取り組んでいます。
    6. 大腸内視鏡検査のプロシージャの間に麻酔を維持するためにおよそ 2% にイソフルラン麻酔濃度を低減します。マウスの呼吸と、内視鏡検査中の刺激への応答を監視し、必要に応じて、気化器はイソフルラン濃度を調整します。乾燥を得ることからそれらを防ぐために軟膏でマウスの目をカバーします。
    7. マウスの指の間をつまんで麻酔の効果を制御します。反応性不在の場合は、3.1.8 のステップに進んでください。
    8. 片方の手で尾のルート上尾を持ち上げ、内視鏡で、直腸に肛門を介して他の手の位置を慎重に挿入します。
    9. 一方、空気の流れは、ゆっくりと慎重に著るしく拡大方向に進む内視鏡を移動大腸内腔を膨らませます。
    10. 大腸の内腔の真ん中に内視鏡を置き、大腸の壁との接触を最小限に抑えるため、傷、深い壁に関連した傷害を避けるためにこの位置を維持 (出血の結果など)、またはも壁の穿孔 (手順 3.1.17 参照).この手順を制御するには、完全に (すなわち、大腸のコンパートメントの一定の可視化) の下でビデオ ストリームを見ています。
    11. 糞便は、ビューを収縮し、内視鏡を削除、直腸まで 2 ml の生理食塩水、ソフト パスツール ピペットを使用してフラッシュで浣腸を実行します。糞便や否定的粘膜面と、最終的には、採点結果の特性に影響を与える他の副次効果の意図しない希薄化を防ぐために、可能な限り少量の液体として使用します。
    12. 定期的に内視鏡を配置しようとすると、(すなわち,異なる) 遠位結腸大腸炎症の得点を標準化し、マウス間および実験の結果を得点の比較を最適化する内の解剖学的部位。
      注:通常、硬性内視鏡と 4 cm の最大深さは直腸ルート経由でアクセスできます。2 ~ 4 cm aborally、コロン定期的に化す曲げ剛性内視鏡に渡したことはできません。遠位撓曲デフォルト得点としてスポットに隣接するコロンの領域を使用します。
    13. ビデオ ストリームを記録し、炎症の得点で始まるを開始します。
    14. 説明し、表 1及び図 3に示されているパラメーターを得点でコロンの GvHD に関連する炎症を評価します。
      1. スポットを優しく得点と若干戻る - 内視鏡を移動し、別のパラメーターを評価するために転送します。
      2. 大腸の壁に関連してより広い距離で内視鏡の位置によってパラメーター「半透明」として「スツールの一貫性」を評価します。
      3. 内視鏡を大腸の壁に近接配置することで、パラメーターの「粒度」と「血管」を評価します。このタスクでは、内視鏡の先端で大腸の壁によく投与緊張を慎重に適用します。
    15. スコアリング プロセスが完了したら、記録を停止します。
      注:その後、記録ビデオ クリップを合計で使用または大腸の炎症に貢献する全体的なミニ内視鏡評価基準の代表的なイメージ (すなわち、スクリーン ショット) の生成に使用できます。
    16. 内視鏡を慎重に取り外します。
    17. マウスを周囲の空気にさらされて別々 のケージに移すことによってイソフルラン博覧会を中止します。赤いランプとマウスを温める、それが麻酔から回復し、完全な意識を取り戻すまでマウスを観察します。
      注:大腸内視鏡検査中に空気のインフレのため、マウスの腹部はその後直接パフをあります。これは通常、一時的な性質の長期徴候腹部の大量でも進歩的なインフレとマウスの回復の障害の可能性があります (この場合、安楽死されるマウス ニーズでコロンの予期せぬ穿孔すぐ)。
    18. 完全復旧時にそのそれぞれのケージにマウスを配置します。
    19. オプションの方法: ビュー ガイド下組織生検を取ることもあります。以下の手順を実行します。
      注:内視鏡は、3.1.1 - 3.1.18 以下の変更の手順で説明するように同じ方法で実行されます。
      1. 3.1.1 ステップで望遠鏡をカバーするため動作しているチャネルのない簡単な検査シースではなく、組み込み作業チャネルに内視鏡検査シースを使用します。これは主腸へ予期せぬ損傷を防止するため、その先端がビデオ画面で内視鏡の前にちょうど目に見えないまで作業チャネルに生検鉗子を紹介します。
      2. 3.1.11 3.1.2 - の手順に進みます。コロンとプッシュは、関心のスポットを慎重に前方に内視鏡を挿入します。
      3. 大腸組織生検のタスクの 2 番目の実験者の助けを採用してください。鉗子の顎を開くことができるまで楽しみにするゆっくりと作業チャネル内で鉗子を押す選択の大腸領域に生検鉗子の先端を移動する 2 番目の実験者を求めます。大腸の壁を傷つけるリスクを最小限に抑えるこの手順中にビデオ ストリームを常に監視します。
      4. 慎重に生検鉗子の顎の開閉により結腸壁組織サンプルを回復します。
        注:これは大腸の壁の穿孔を防ぐために慎重に。大腸穿孔のまれな場合は、すぐに制度のガイドラインに従い、麻酔薬の継続的な管理の下での測定を適用することで影響を受けるマウスを犠牲に。
      5. 引き戻すし、閉じ鉗子で作業チャネルからを削除します。生検鉗子の顎から試料を浸漬滅菌 PBS 溶液で開かれた鉗子を慎重に揺することによって削除します。その後、計画された下流解析に従って、組織サンプルの適切な保管条件を選択します。70% エタノールで消毒後さらに生検を行う鉗子が再利用されます。
      6. 生検を取った後内視鏡を削除し、手順 3.1.16 - 3.1.18 で大腸内視鏡検査を終了します。
  2. 病理組織学的解析
    1. 日の 26、x 線照射後 30、間制度のガイドラインおよび当局の適用に従い同種 HCT 受信者マウスを安楽死させます。このため、5% イソフルレンの吸入によるマウスを麻酔します。呼吸停止後 1 分のイソフルラン暴露を続行し、頚部転位による安楽死を確認します。徹底的に毛皮や 70% エタノールでマウスの皮膚を消毒します。
    2. 腹腔内を開き、コロンを削除します。PBS で (92 の mm の直径) をペトリ皿に転送します。
    3. PBS で 5 mL ディスペンサー チップを埋めます。長さ 13 cm および鋸歯状の湾曲したヒントのスリップ ディスペンサー チップの先端の上コロン (約 5 mm) の遠位部 Semken 鉗子の助けを借りて。慎重にディスペンサー先端に鉗子でコロンを修正し、腸から便を削除するディスペンサー チップのプランジャーを押し、PBS でコロンをフラッシュします。
    4. メスの助けを借りて、肛門から約 5 mm に位置する結腸を切り取る。
    5. 一晩、腸の切除標本を 4.5% のホルムアルデヒドに修正します。パラフィンに埋め込む、前に直立位置にティッシュを置き。
    6. カット 3 μ m コロンのパラフィン包埋組織の断面積と染色標準プロトコルを使ってそれらヘマトキシリンとエオシン (HE) 染色します。
    7. 大腸組織サンプルの断面を彼ステンド グラスを準備します。
    8. カプランら12によって報告されたスコア行列から適応、病理組織学的炎症性活動重大度とスコア 0-3 のスコア: 炎症がない (スコア = 0)、軽度の炎症 (スコア = 1)、中等度の炎症 (スコア = 2)、や重度の炎症 (スコア 3 を =)。
      注:理想的には、このタスクのマウス腸管 GvHD の評価で経験され、実験の性質と制御グループに目がくらんで病理学者の専門知識を採用してください。

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結果

ミニ内視鏡遠位結腸の腸管 GvHD 関連病変評価を記述する、現在のプロトコルの確立し、以前深刻な急性 GvHD モデルの全身誘導を受けるマウスで検証されています。この研究で使用して私は完全に一致しない BALB/c マウスが致死的照射、続いて T 細胞除去同種骨髄移植と GvHD を誘発する alloreactive C57BL/6 CD3の投与によるモデル システム MHC クラス +T リンパ球。T 細胞除去骨髄細胞と GvHD 誘導脾 T 細胞を磁気分離による精製しました。これらの細胞集団の純度は cytometry 流れによって決定され、浄化プロセスの代表の結果が図 1、合計骨髄細胞から T 細胞の十分な枯渇との一貫性のある濃縮を示すに表示されます。脾臓由来 CD3+ T 細胞以前への移転前に放射線照射したマウス。図2 臨床コースは、alloreactive ドナーの T リンパ球の不在 (ない、グレー...

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ディスカッション

プロトコルでは、誘導の方法論と腸管 GvHD 間観測された大腸の表現型のミニ内視鏡評価について説明します。科学者 (すなわちから大腸の症状と最大の疾患活動性までの進行の発症) 全体の病気にわたって縦方向と非侵襲的腸管 GvHD を調査するを有効にするのより広い目的を提供しています。

ただし、本質がありますいくつかの重要なステップと重要な制限事項提示の方法論を実験者、それぞれ科学的な文脈の技術を適用する前に注意する必要。まず、正常にマイナーな組織適合性の不一致モデル システム11腸管 GvHD 関連大腸病変の内視鏡ミニ評価を使いました、ここに提供されているプロトコルが現在 mhc 排他的に適用私は完全に一致していない急性 GvHD モデル クラスです。私は完全に一致しない GvHD モデル MHC クラスは共通および頻繁に使用される5が、それはよく確立されて以来、これは強く、例えば、影響、GvHD 症状の特性、使用マウス亜に大きく依存、照射する感度。さらに、速度と消化管 GvHD 症状

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開示事項

著者が明らかに何もありません。

謝辞

本研究は、共同研究センター (CRC) 221 (CRC/TR221 (dfg)、#324392634; プロジェクト B03) (コンゴ) や CRC 1181 (CRC (dfg)、プロジェクト B05) (コンゴ) に支えられた、ドイツ研究振興協会 (DFG、ドイツ研究振興協会) によって資金を供給される両方。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
BIOBEAM 2000 ガンマ線照射器Gamma-Service Meical GmbH
リン酸緩衝生理食塩水 (PBS)Sigma-Aldrich Co. LLC.D8662-6x500ML
セムケン鉗子(長さ:13 cm、鋸歯状、湾曲した先端)ファインサイエンスツール11009-13
ファインハサミ(長さ:8,5 cm、ストレートチップ、刃先:24 mm)ファインサイエンスツール14090-09
RPMI-1640ミディアムシグマ-アルドリッチ株式会社R8758-500ML 
皮下注射針 (26 G)B. Braun Melsungen AG4657683
1 mL シリングB. Braun Melsungen AG9166017V
50 mL チューブSarstedt Ag & Co.KG62,547,254
セルストレーナー 40 & micro;mメッシュスクリーンBDファルコン352340
塩化アンモニウム(NH4Cl)Sigma-Aldrich Co., LLC.11209ACK溶解緩衝液の成分
エチレンジアミン四酢酸二ナトリウム塩二水和物 (Na2EDTA)Carl Roth GmbH & Co.KG8043.2ACK溶解緩衝液の成分
重炭酸カリウム (KHCO3)Merck KGaA1,048,540,500ACK溶解緩衝液
CD90.2 MicroBeadsの成分、マウスMiltenyi Biotec GmbH130-049-101T 細胞枯渇骨髄細胞を単離するための磁石細胞分離
Pan T Cell Isolation Kit II, mouseMiltenyi Biotec GmbH130-095-130脾臓 T 細胞を分離するための磁石細胞分離
Alexa Fluor 700 抗マウス CD45.2 抗体 (クローン: 104; ロット: B252126;RRID: AB_493731)Biolegend109822
Pacific Blue anti-mouse CD3 抗体 (clone: 17A2; lot: B227246;RRID: AB_493645)Biolegend100214
FITC anti-mouse CD4 抗体 (clone: GK1.5; lot: B225057;RRID: AB_312691)Biolegend100406
PE/Cy7 anti-mouse CD45.1 抗体 (clone: A20; lot: B217246;RRID: AB_1134168)Biolegend110730
APC/Cy7 anti-mouse CD8a 抗体 (clone: 53-6.7, lot: B247008;RRID: AB_312753)Biolegend100714
濾過ウシ血清 Pan BiotecP40-47500FACSバッファーの成分 
96ウェルポリスチレンV底プレートGreiner Bio-One651201
ポリスチレン丸底チューブ (5 mL)Falcon352052
BD LSRFortessa II flow cytometerBD Bioscience Co.
インスリン注射器(滅菌内部付き)(30 G)BD324826
Oxy Vet Oxymat 3Eickemeyer酸素濃縮器  麻酔用
NarkoVet アイケマイヤー213062
プレキシガラスチャンバー アイケマイヤー214620
ストレートフォワード望遠鏡カールストルツ SE &Co KG64301 AA大腸内視鏡検査のための実験セットアップの一部
保護と検査シースKARL STORZ SE &Co KG61029 Cは、大腸内視鏡検査のための実験セットアップの一部
チャネル付き検査シースカールストルツSE &Co KG61029 大腸内視鏡検査
生検鉗子KARL STORZ SE &共同KG61071 ZJ 大腸内視鏡検査の実験セットアップの一部
 175ワットSCBキセノン光源カールストルツSE&Co KG20132120大腸内視鏡検査
光ファイバーライトケーブルKARL STORZ SE &Co KG495 NL大腸内視鏡検査の実験セットアップの一部
Image 1 S3 カメラヘッドKARL STORZ SE &Co KG22220030大腸内視鏡検査の実験装置の一部
Image 1 SCB Camera Control UnitKARL STORZ SE &Co KG22200020大腸内視鏡
用液晶モニターオリンパスOEV181H大腸内視鏡検査用実験装置の一部
Forane / IsofluranAbbVie Inc. B506
ホルムアルデヒド溶液 37 %Carl Roth GmbH & Co.KG7398.1
5.0 mL ディスペンサーチップ エッペンドルフAG30089456
硬化作業の実験セットアップの一部 の実験装置の一部です 検査

参考文献

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