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カンジダを使用してリアルタイム細胞フラックス解析のバイオ エネルギー調査

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DOI：

10.3791/58913

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2019年3月19日

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1Department of Microbiology, Biochemistry and Molecular Genetics, New Jersey Medical School, Rutgers, The State University of New Jersey, 2Public Health Research Institute, Rutgers, The State University of New Jersey

* These authors contributed equally

この記事について

サマリー

ここでは、余分なフラックス アナライザーを使用してミトコンドリア呼吸とカンジダで解糖系の機能を調査するための段階的なプロトコルを提示します。

要約

ミトコンドリアは、細胞の代謝と生存の重要な細胞内小器官です。ミトコンドリア細胞呼吸、酸素代謝、シグナル伝達、アポトーシスなどのさまざまな主要なイベントが起こる。その結果、ミトコンドリア機能障害とされる抗真菌薬耐性と病原菌の病原性に重要な役割を果たします。最近のデータは真菌の病原性に重要な貢献としてミトコンドリアの重要性の認識にもつながっています。真菌の生物学におけるミトコンドリアの重要性にもかかわらずその機能を理解する標準化された方法の発達は悪い。基底酸素消費量 (OCR) ミトコンドリア呼吸の測定と細胞の酸性化率 (ecar と)、 C. albicans系統における解糖系機能の測定を研究するための手順を紹介します。記載方法は、そのまま真菌細胞からミトコンドリアを浄化することがなく任意のサーベイランス。系統に適用できます。さらに、このプロトコルをカスタマイズすることができますc. アルビカンス菌のミトコンドリア機能阻害剤の画面に。

概要

侵襲性真菌感染症は、世界中で毎年以上 150 万人を殺します。この番号は、侵害された免疫は、高齢者、未熟児、移植、癌患者1などとともに生きる人々 の数の増加による上昇には。C. アルビカンスは人間の細菌叢の一部である日和見人間真菌の菌です。また、粘膜の表面や消化管が共生生物として生息します。C. アルビカンスは、免疫不全症、手術を受けている人や長期の抗生物質のコースと扱われている人を持っている人に深刻な全身疾患を生成します。院内感染症 (NID) 人間2,3,4,5,6、7のトップ 3 〜 4 原因のうちカンジダ種のランク。カンジダ血流感染症の年間の世界的な数は、~ 400,000 症例 46 751の関連付けられている死亡すると推定されます。カンジダ症のための年間死亡率はほぼ単独で米国で 10,000 です。菌類が原因で NID の程度も、天文学的な患者費用5に反映されます。アメリカ合衆国では、侵襲性真菌感染症の治療のための年次費用は $ 20 億、すでに負担医療システムに大きな負担を追加するを上回っています。現在、利用可能な標準的抗真菌治療は毒性、ますます普及している薬剤耐性、および薬物-薬物相互作用により制限されています。したがって、ハイリスク患者に対するより良い治療の選択肢になります新しい抗真菌薬のターゲットを識別するために緊急の必要性があります。しかし、菌は真核生物であるために、真菌ターゲットに作用する新薬の発見は複雑です。これは大きく真菌特定薬剤ターゲットの数を制限します。

最近の研究は、ミトコンドリア細胞呼吸、酸素代謝、シグナル伝達、アポトーシス8 の重要なので、ミトコンドリアが耐性抗真菌薬と真菌の病原性に重要な貢献こと示されています。 ,9,10,11。解糖系と非解糖系代謝は、哺乳類のホスト12,13,14,,1516 C. albicansの生存に不可欠です。さらに、Goa1 などのミトコンドリア蛋白質に欠けているいくつかのc. アルビカンス変異 Srr1 Gem1 Sam37 等が示されている粘い、 C. albicans17,の重要な病原因子の欠陥18,19,20,21,22しますさらに、これらの変異体も示したマウス モデルにおける病原性播種性カンジダ症17,18,19,20,21 の減衰させる。 ,22。つまり、菌のミトコンドリアは、創薬のための魅力的なターゲットを表します。ただし、 C. albicansは小柄な負23、それがミトコンドリアのゲノムことがなく生き残ることはできませんを意味するためにC. albicansのミトコンドリア機能に関する研究が困難します。

ここでは、ミトコンドリアを浄化するために必要とせずC. albicansのミトコンドリアと解糖系の機能を調査するために使用することができますプロトコルについて述べる。このメソッドは、 C. albicansのミトコンドリアと解糖系の経路の遺伝的操作や化学物質の変調器の効果を調べるためも最適化することができます。

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プロトコル

注: は、アッセイの詳細な段階的なプロトコルには、以下、スケマティック プロトコルは図 1に示します。

1 C. albicans菌株と成長条件。

  1. 一晩 30 °C インキュベーター シェーカーで液体酵母エキス ペプトン ブドウ糖 (YPD) 媒体のc. アルビカンス菌を育てます。
    注: 凍結する在庫としてカンジダ菌を維持し、YPD 寒天 (酵母エキス 1%、2% ペプトン、2% ブドウ糖と 2% 寒天培地) で育ちます。

2. 試薬の調製

  1. 次のとおりアッセイ培地を準備します。
    1. ミトコンドリア機能の試金のため溶解 1.04 g ロズウェル パーク記念研究所 (RPMI) 1640 パウダーと 2 グラムのブドウ糖 (2%)90 mL の滅菌水と暖かい 37 ° c. にメディアで5 M NaOH を使用して 7.4 に pH を調整し、滅菌水で 100 mL にボリュームを構成します。
    2. 解糖系のストレス分析のため 1.04 g RPMI 1640 パウダーだけでは 90 mL の滅菌水に溶解、37 ° C にメディアを暖かく、pH 7.4 に調整。滅菌水で 100 mL にボリュームを構成します。RPMI 1640 粉末は、アッセイの中に解糖作用の指標として pH 変化を監視する重要な炭酸を持ちません。
  2. インジェクションの化合物。
    1. 滅菌水、-20 ° C で店で 1 M グルコース ストックを準備します。
    2. ジメチルスルホキシド (DMSO)、小さなボリュームで分注のオリゴマイシン株式 100 mM を準備し、-20 ° C で保存
    3. DMSO、小さなボリュームで割り切れるで 100 mM アンチマイシン A 株式を準備し、-20 ° C で保存
    4. アッセイの日に 100 mM のエタノールにシャム (サリチルヒドロキサム酸) 株式を準備します。
    5. アッセイの当日 1 M 滅菌水で KCN を準備します。

3 アッセイ プレートのコーティング、ポリ-D-リジン (PDL) と

メモ: 実行すべて、層流フードの手順以下。

  1. 50 μ G/ml の最終的な集中させる組織培養グレードの水にポリ D リジンを溶解します。よく、分注 1.5 mL 遠心チューブに混ぜるし、長期的に-20 ° C で保存します。
    注: 50 μ L/ウェルが必要であり、24 ウェル ・ 1.2 mL 必要です。したがって、因数少なくとも 1.3 mL 遠心チューブ/。
  2. ウェルあたり 50 μ L を追加し、1-2 h 対応ふた付け室温で孵化させなさい。
  3. ソリューションを吸引し、500 μ L 滅菌組織培養グレードの水との 1 時間をすすいでください。
  4. 蓋を開き、乾燥空気に井戸を許可します。2-3 日間の最大値の同じ日または 4 ° C でストアにプレートを使用します。

4. センサー カートリッジの水和

注: は、1 日、実験の前にこの手順を実行します。

  1. 余分なフラックス測定キットを開き、内容を削除します。逆さまユーティリティ プレート (図 2) の横にあるセンサー カートリッジを配置します。
  2. 塗りつぶしの各 1 ml calibrant のユーティリティ板のよく、バック センサー カートリッジを配置します。(酸素と pH を測定) に蛍光物質を含んだセンサーは、calibrant に沈んでいることを確認します。
  3. 37 ° C で非 CO2インキュベーターで一晩センサー カートリッジを孵化させなさい

5. 成長と歯根膜被覆板の細胞を播種

  1. C. アルビカンスYPD スープを接種して 200 rpm でシェーカーの 30 ° C で一晩成長します。
    注: は、試金のデザインと関心に基づき、YPG または最小媒体で、 c. アルビカンスに育てることができます。
  2. 試験の日、最終濃度 100 μ L あたり 10万個のセルを生成するためのアッセイ培地での細胞の適切な数を希釈します。
  3. A1、B4、C3、D6、追加のバック グラウンド補正 (図 3) のためのアッセイ媒体のみ 100 μ L の井戸を除くアッセイ プレートの各ウェルに 100 μ L の希薄化後のセルを追加します。
  4. 37 ° C で非 CO2インキュベーターにプレートを転送し、プレート表面に付着細胞をできるようになる 60 分間インキュベートします。

6. 試金のプロトコル

注: ここで説明したプロトコルは、楽器の 24 ウェル フォーマットです。ボリュームは、別の形式を使用する場合に調整する必要があります。

  1. ミトコンドリア機能試金
    1. 化合物の調製
      1. ミトコンドリア機能の試金のための 10 倍の濃度で化合物を準備: 20 mM シャム、100 μ M を準備 100 mM KCN、オリゴマイシンおよび対応するアッセイ培地で 20 μ M アンチマイシン A。
      2. 50 μ l 添加 55 μ L ポート A に偽オリゴマイシン ポート B、62 μ C とポートに KCN ポート D に 68 μ L アンチマイシン A (図 4)。
  2. 解糖系の応力測定
    1. 化合物の調製
      1. 解糖系ストレスの試金のための 10 倍の濃度で化合物を準備します。100 mM のグルコース、100 μ M を準備オリゴマイシン、500 mM 2-デオキシ糖 (2 DG) と対応するアッセイ培地で 20 μ M アンチマイシン A。
      2. ポート A、55 μ L に 50 μ L のブドウ糖を追加 C とポート d. に 68 μ L アンチマイシン A ポートにポート B、62 μ L 2 DG にオリゴマイシン
  3. 余分なフラックス測定をできる酸素消費量 (OCR) および 24 ウェル プレート形式で生きた細胞の細胞の酸性化率 (ecar と) を採用してください。事前に試金のプロトコルを設定します。
  4. 余分なフラックス アナライザーを開くし、分析] タブを使用して試金テンプレートを設定セットアップ中に飛び出すすべての情報を記入するステップバイ ステップの指示に従ってください。図5 と同様にグループのレイアウトを生成します。表 1に示すように、プロトコルを設定します。アッセイの前に前もってこれらのレイアウトを設定し、コンピューターに保存します。試金の時に、[分析] タブ (図 5) にファイルを開くのオプションで対応するファイルを開き、保存されたプロトコルを復元します。
  5. 10 x 化合物、calibrant を含む水分センサー カートリッジのそれぞれのポートにし余分なフラックス アナライザーのキャリア トレイにします。画面のスタートボタンを押すことによって、校正を開始します。
  6. 450 μ L の最終巻をさせる細胞障害を最小限に抑えるために井戸の側面に沿って細胞板に優しくアッセイ中の 350 μ L を追加します。
  7. アッセイ プレートと calibrant を含むユーティリティ プレートを交換し、続けます。
  8. 分析が完了したら、センサー カートリッジとプレートを削除します。適切な保存先フォルダーにファイルを保存します。

7. データ解析

  1. 図 6に示すように、各パラメーター (OCR または ecar と) を選択してグループ間の差を計算するのにソフトウェアのカーブ-分散分析 (AUC ANOVA) 解析タブの下の領域を使用します。
  2. 比較する必要があるグループを選択します。
  3. 分散分析の分析グループに追加し、 [ok]をクリックします。
    注: この AUC ANOVA 分析は、AUC はグループごとに計算し、分散分析により両者比較ファイルに新しいシートが追加されます。これは、意義を示す p 値のテーブルを与えます。

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結果

このプロトコルの焦点c. アルビカンス余分なフラックス アナライザーによって評価の生物エネルギー関数を決定することです。ミトコンドリア蛋白質 Mam33 に欠けているC. albicansの変異体は、その補数のひずみ、 mam33Δ/Δ::MAM33 OCR と ecar とミトコンドリア蛋白質の削除の影響を研究すると共に含まれています。推定酸性ミトコンドリア蛋白質のMAM33をエンコードし、カンジダの機能は知られていません。

余分なフラックスの試金のための携帯番号
145 pmol/分 (図 7)、100-300 pmol/分任意細胞フラックスの試金のための最適な範囲内にある OCR を示した余分なフラックスのアッセイでウェルあたり 1 x 105

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ディスカッション

生体エネルギー酸化的リン酸化 (OXPHOS) を測定することによってミトコンドリアの機能を読み出すための優れたツールとして余分なフラックスの試金-リアルタイム依存酸素消費量。また、リアルタイム解析で同時に細胞の酸性化率 (細胞外 pH の変更) として測定される解糖系関数を調べることがもできます。

アッセイ プレートでC. albicansの成功したメッキは、ため、培養歯根膜コーティング プレートで細胞アッセイ プレートに付着する細胞アッセイで重要な手順の 1 つは。C. albicansの付着細胞の可視化は光学顕微鏡検査によって行われます。不適切な細胞接着細胞複製間の一貫性のない測定値と測定結果に影響を与えるが、井戸に浮いている可能性があります。同様に、この分析では 100-300 pmol/分、これは最適な範囲の OCR を取得する最初のステップとしてセル数滴定を行うことが重要です。また、最適な濃度を取得する化合物の滴定は最適な応答を達成するために重要なも。これは基底の培地組成の変化があるたびに実行する可能性があります。

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開示事項

著者がある何も開示するには

謝辞

NC ラボで研究をサポートするには、国立衛生研究所 (NIH) の助成金 R01AI24499 とニュージャージー州健康財団 (NJHF) の助成金、#PC40 18。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
RPMI 1640コーニングMT50020PB
アンチマイシン AシグマA8674
KCN
水戸ストレス キットアジレント103015-100
オリゴマイシンカルバイオケム495455
pH メーターアキュメットAR20
フェノール レッドシグマP5530
ポリDリジンシグマP6407
ロテノンサンタクルス203242
タツノオトシゴXF24フラックスパックアジレント100850-001
シャム
塩化ナトリウムアムレスコ 241
ヒドロキシ ナトリウム ペレットJ.T Baker3722
組織培養グレード水Gibco1523-0147
XF アッセイ キャリブラント ソリューションAgilent100840-000
酵母抽出物 ペプトン デキストロースフィッシャー scientific,BP2469
酵母抽出物 ペプトン デキストロース 寒天ΣA1296
酵母エキスペプトングリセロールシグマG2025

参考文献

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