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方法論記事

宿主-病原体応答とマウスでワクチンの有効性の評価

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DOI:

10.3791/58930

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2019年2月22日

 ,  ,  , 
1Department of Microbial Infection & Immunity, The Ohio State University, 2Department of Microbiology, The Ohio State University

この記事について

サマリー

ここで生体内でワクチンの評価のためのエレガントなプロトコルの有効性と宿主免疫応答を提示します。このプロトコルは、ウイルス、細菌、ワクチンのモデルまたは寄生病原体に対する適応ことができます。

要約

ワクチンは、20 のth世紀の医学の驚異です。罹患率と死亡率に激減感染症によって引き起こされ、世界の寿命の顕著な増加に貢献しています。それにもかかわらず、課題のままワクチンの有効性を決定します。出現の証拠には、百日咳(百日咳) の現在の無細胞ワクチン (aPV) が最適ではない免疫を誘導することが示唆されました。したがって、主要な挑戦 (wPV) 全細胞ワクチンの副作用なし防御免疫を誘導する次世代ワクチンの設計です。ここで保護 Th1/th17 細胞表現型に対する免疫応答を傾けます、マウスの気道から百日咳チャレンジの良いクリアランスを促進する、有望な新規アジュバントの有効性のテストに使用したプロトコルについて述べる。この資料では、マウス免疫、細菌の接種や組織の採取、免疫応答の解析のためのプロトコルについて説明します。私たちのモデルの中でこのメソッドを使用して、次世代の有望な無細胞百日咳ワクチンによって誘発される重要なメカニズムを解明した正常に。このメソッドは、ワクチンの有効性を決定するために、伝染病のモデルに適用できます。

概要

ワクチンは 20 世紀の最も偉大な公衆衛生の成果の 1 つを表すけれども、私たちまだ理解していない完全に、成功したワクチンは、防御免疫を刺激するメカニズム。分子生物学の同定 (e.g、細胞の活性化マーカー、細胞亜型の拡大、遺伝子発現のパターン) 誘発後予防接種を予測し、効果を生成するための情報の茄多を提供しています。免疫応答。宿主-病原体応答の複雑さは、体外で細胞培養システム1を使用して適切にレプリケートできません。生体内でワクチンのモデルは、付随してホスト内で複数の免疫細胞の種類を評価する設計されています。これはワクチン抗原処理とプレゼンテーション、各種サイトカイン分泌と免疫細胞の拡大を特性評価する際の利点を提供します。ここで説明したプロトコルでは、局所および全身の免疫反応の評価と関心の組織における病原体の負担の定量化をワクチンの有効性を決定するための詳細な方法を提供します。ここで紹介されている例は、百日咳(百日咳) 病原体の実験的ワクチンの有効性をテストします。

百日咳は、呼吸器疾患百日咳 (百日咳)2,3の病因は、グラム陰性菌です。感染した人 (症候性または無症候性) と密接な接触は感染、植民地化および疾患につながります。にもかかわらず、重要なグローバル ワクチン報道4百日咳は世界中多くの国で復調病と見なされます、予防可能な小児死亡5,6,7,の主な原因は、8.、2015 年に百日咳と百日咳に含まれていた国立研究所のアレルギーおよび感染症 (NIAID) 新興感染病原体のリストを与えるより良いワクチンの開発の必要性を強調長寿命の防御免疫。

現在、百日咳復活を制御する研究の活発な領域は、新規アジュバントと抗原全体細胞によって誘発される免疫応答を模倣するための最適な組み合わせを持つ次世代の無細胞百日咳ワクチン (aPV) の開発百日咳ワクチン (wPV)9。説明されたプロトコルを使用して、我々 は最近、現在 FDA 承認 aPV ボルデテラ植民地化因子 A の新規アジュバントの添加による (BcfA) の変更が百日咳細菌負荷のより効率的な削減の結果を報告しました。マウス肺10,11。この保護は、保護/th17 細胞 Th1 免疫プロファイル10ミョウバン誘起の Th1 ・ Th2 免疫応答の傾斜を伴っていた。このプロトコルは、詳細かつ包括的、ホストおよび様々 な病原体に対する免疫応答の同時評価を通じて最大の情報を取得する研究者を有効にすることです。

ここで説明したプロトコル最適な宿主免疫応答を確保するため、図 1に示す、代表的なワクチン スケジュールに従います。

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プロトコル

IACUC ガイドラインに従って、オハイオ州立大学 IACUC によって承認されたプロトコルに続く生きている動物で実験を行った。C57bl/6 マウスは、すべての予防接種や感染症で使用されました。男性と女性の両方のマウスは NIH のガイドラインに従って各グループで使用されます。グループごとのペット数は実験グループの転帰の予測の違いによる検出力の計算によって決定されました。たとえば、グループごとの 8 マウス α に 80% の電力になります = 0.05 (両面) 2 標本t- 1.33 の標準偏差 (SDs) の関心の結果の違いを検出する検査。

1. マウスの免疫

  1. 生理食塩水などの滅菌生理バッファーでワクチンのマスター ミックスを調製や DPS。
    注: ミックスの総量よりもグループ全体の予防接種の必要な 10% を含める必要があります。ワクチン成分の濃度は、1.1.1 と 1.1.2 の手順で記載しています。氷の上のビバリウムにアイテムを転送します。
    1. 百日咳研究、次のワクチンのグループが含まれます: aPV、aPV + BcfA。また、対照群としてミョウバン、ワクチン抗原だけで (FHA と Prn) と素朴な (非免疫) マウスを使用します。
      注: aPV は 1/5thは破傷風トキソイド、減らされたジフテリア、百日咳トキソイド (PT)、繊維状赤血球凝集素 (FHA)、pertactin から成る FDA 承認 aPV の人間の線量 (Prn) アルミニウム塩に吸着します。現在百日咳 aPV の 1 つの人間の線量は 0.5 mL、したがって、投与量の 1/5thは 0.1 mL。APV + BcfA のボリュームは、0.1 mL aPV (1/5th人間の線量) + BcfA の 0.046 mL (30 μ g) マウスあたり。1 つの筋肉に安全に配信できる最大量は 0.1 mL です。APV + BcfA ワクチン量が 0.1 mL を超える、ワクチンを安全に投与するために均等に大別、両肩に配信する必要があります。
    2. 実験的ワクチンを準備するために一回の投与 FHA の 1 μ g と Prn の 0.5 μ g を組み合わせて滅菌 PBS の水酸化アルミニウムの 50 μ g。部屋の温度 (RT) で 15 分の所ローラーでミックスする実験の aPV を許可します。その後、4 ° C で 5 分間 18,000 × g でチューブをスピンします。上澄みを除去し、1 mL の滅菌 PBS で内容を再懸濁します。
  2. ビバリウムの麻酔器 (図 2) を設定します。
    注意: 必ず酸素および使用する前に彼らのそれぞれのタンクにイソフルランの十分なレベルがあります。イソフルラン スカベン ジャー容器の重さし、50 g で、体重が増えるときに置き換えます。
  3. 徹底的にきれいに生物学的安全キャビネット (BSC)、BSC 内クリーン誘導室を配置します。麻酔器から誘導室に麻酔とスカベン ジャーの線を接続します。酸素タンクを介して酸素を確保するためのレギュレータが流れて開き、レベル 1.5-2 L/分に設定します。
  4. 誘導室に必要な年齢 (6-12 週) のマウスを置きます。軽くマウスを麻酔するために 2.5-3% にイソフルランを入れます。彼らが商工会議所で動いていないと、呼吸が鈍化しているまでは、動物を監視します。
  5. 誘導のレベルをテストするには、つま先つまんで反射的動きを観察します。存在しない場合は、マウスが注入する準備ができています。
    注: この実験で動物の全体のケージ麻酔導入し, 一度に。個別に注入のための動物の麻酔、麻酔なし動物を注入を選択できます。これらのメソッドのいずれかが適しています。
  6. 一方、インスリンは注射器 (28 1/2) の各ワクチン 0.1 mL を 1 mL を準備します。動物は完全に誘導、商工会議所から 1 つの動物を削除し、腹タオルやベンチのパッドにマウスを置きます。
  7. ワクチンの筋肉内管理します。45 ° の角度で注射器と上向き傾斜面、マウスの三角筋に注射器 〜 5 mm を挿入し、ワクチンを注入します。
    注: 後肢四半期/側面は三角筋ではなく注射部位として使用されるかもしれない。
  8. 注入後、針を 5 〜 10 秒のために筋肉に挿入を保ちます。いったんボリュームを提供すると、傾斜面にシールを作成し、ワクチンの漏れを防ぐため離れて直面しているので、180 ° で注射器を回転します。その後、注射部位から針をゆっくりと引き出します。
  9. マウスをケージに戻ります。指定されたグループのすべての動物と手順を繰り返します。
  10. イソフルランを切りマウスの次のケージを麻酔する前に酸素チャンバー内に誘導をフラッシュします。
  11. 彼らは、すべての警告と移動ケージまで動物を監視します。住宅の場所にケージを返します。
  12. モニター動物ごとの 12 h ポストの予防接種をラフ/ボサボサ コートなど合併症の臨床症状のための 48 時間の遅い歩行や呼吸をこじつけ。症状が持続する場合機関の獣医師に相談して必要な場合の研究から、マウスを削除します。
  13. 初期接種後 4 週間は、麻酔して以前与えられた同じワクチン接種の公式でマウスの右の三角筋に筋肉内注射を管理するマウスを高めます。
  14. 再度、任意の臨床症状の動物を監視します。追加 2 週間の動物を収容し、感染を続行します。

2. 成長百日咳菌の感染菌の準備

  1. ・ ボルデ Gengou (BG) 寒天の13に百日咳を連勝添加 10% 脱フィブリン羊のフリーズされた在庫 [-80 ° c で 15% のグリセロール、テナー Scholte (SS) メディア12浮遊性成長から凍結, 凍結保存] から血と 100 μ g/mL ストレプトマイシン (10 %bg + Sm) 選択します。4 日間の 37 ° C でプレートを孵化させなさい。
  2. プレートから系統の 8 〜 10 個々 のコロニーをピックアップし、SS 培地 22.8 mM L システイン、3.6 mM 硫酸第一鉄、ナイアシン 3.3 mM、48.8 mM グルタチオン、227 mM アスコルビン酸、1 mg/mL heptakis、100 μ g/mL ストレプトマイシンの 3 mL を接種します。16-24 h の 60 rpm でローラー ドラムの 37 ° C で文化を育てます。
  3. 次の日、希釈培養 1:600、1: 300、1:120、1: 60、1:30、および 1:15 mL の補われた SS 培地 3 で。16-24 h 60 rpm でローラー ドラムの 37 ° C で文化を孵化させなさい。
  4. 光学密度計測 600 nm (外径600) 細菌文化のため。液体文化の 0.1 mL を滅菌 PBS の 0.9 mL に追加することによって、文化 1:10 を希釈分光光度計のキュベットを使用します。
  5. 外径600≈ 0.8 1.2 を使用したカルチャを選択します。1 OD (図 3) を取得するために必要量を計算します。スピン ・ 25 ° C で 5 分間 6000 x g で 1.5 mL 遠心チューブにボリューム ダウン上清を吸引し、1 mL の 1 OD/mL の密度を得るため滅菌 PBS で細菌の細胞ペレットを再懸濁します [10 x 1 39コロニー形成単位 (CFU)/mL]。
  6. 5 〜 10 倍の菌を準備する 1.5 x 105 6 CFUs/マウス 40-50 μ L で渦直列 (ステップ 2.5) から細菌のソリューションを 100 倍希釈し、1 ml 1 〜 3 × 107 CFUs/mL (図 4A) を達成するために滅菌 PBS の。氷の上のビバリウムに接種を輸送します。

3. マウスの鼻腔内感染モデル

  1. 1.3 と 1.4 の手順の説明に従って、ビバリウムの酸素と麻酔の条件を設定します。1.5 の手順で説明するよう、麻酔する商工会議所にマウスを配置します。麻酔が有効になるまでは、動物を監視します。
  2. マウスを麻酔するときは、誘導室から一度に 1 つの動物を削除します。肩甲骨と首の後ろに、背側の胸郭の首筋をマウスを拾います。鼻にアクセスするマウス直立を位置します。
  3. マウス (各ナレで 20-25 μ L) の鼻孔に細菌の接種の 40-50 μ L を適用 200 μ L ピペット チップを使用して、ゆっくりと。全体の接種は動物に吸入されてまでマウスを押したまま。場合いくつかのうち接種泡、泡を収集し、鼻孔にふたたび。マウスの 1 つのグループに陰性対照として滅菌 PBS の同量を提供します。
  4. 1.10 1.12 の手順で実行彼らのおりに接種した動物を返す、彼らが警告、移動まで動物を監視します。ラックにオリジナルの住宅スペースにケージを戻ります。次の一連の動物の麻酔前に残留のイソフルランを削除する酸素チャンバー内に誘導をフラッシュします。感染後 48 時間のための動物を監視します。
  5. 研究室で滅菌 pbs は、実際 CFUs を確認する、菌の希釈液をシリアル プレートはマウスに配信されます。10 %bg + Sm プレート (図 4A) の希釈液の 0.1 mL をプレートします。37 ° C の定温器でプレートを置き、4 日間の成長します。カウントし、接種マウス (図 4B) に配信から CFUs を計算します。

4. 動物組織の感染後の収穫

  1. マウス解剖と組織の収穫のための準備します。
    1. 滅菌オートクレーブ内組織を処理するために必要なすべてのツール (粗・微動のはさみ、曲線はさみ、微細鉗子、ペレットの乳棒および三角形を撒き散らす)。社製殺菌パウチでツールをシールします。ガラスの dounce ホモジナイザーをホイルで包むし、不稔を示すオートクレーブ テープを追加します。
    2. 寒天プレート 1 または 2 日確実に使用する前に凝固板に組織収穫前の準備します。百日咳、鼻中隔、気管と肺の各実験のため、経験的に決定、目的の希釈でそれぞれのマウスの 10 %bg + Sm. ラベル プレートを使用します。
    3. 塗りつぶしとラベルの CFU 希釈チューブ。0.9 mL の滅菌 1.5 mL 遠心チューブに滅菌 PBS 基づくプロセスおよび希薄臓器ごとに臓器の数を追加します。
    4. 記入し、組織の採取用のラベルします。
      1. 鼻中隔、気管: PBS の生殖不能の 1% カゼインの 0.3 ml 滅菌 1.5 mL 遠心管を埋める (Ca2 +と Mg2 +-無料)。4 ° C でのストア
      2. 肺: 滅菌 15 mL の円錐管および 4 ° C でストアに PBS で 2 mL 滅菌 1% カゼインを追加します。組織学のための肺を収穫、10% 中性緩衝ホルマリン (NBF) 2 mL を追加し、室温保存
      3. 脾臓: 追加 RPMI + 5 %3 mL 15 mL の円錐管に FBS。4 ° C でのストア
      4. 血液: ラベル、滅菌 1.5 mL 容マイクロ チューブ、全血と血清の 2 つのセットです。
    5. 新鮮な 70% エタノールをビーカーを埋めるし、郭清のためのボトルをスプレーする準備されるべき。
  2. 収穫の日にカートのビバリウムにすべての材料を輸送します。BSC をきれいにし、1.3 と 1.4 の手順で麻酔マシンを設定します。
  3. 誘導室で解剖し、酸素が流れると 5% にイソフルランを有効にマウスを置き、動物が意識するまで待機します。一度に、1 つのマウスを削除し、占拠の死を確認する第 2 の方法として動物を脱臼します。頚部転位、続いて呼吸レートの不在や逃避反射 (つま先ピンチ テスト) の不在によって安楽死を確認すべき。
  4. 腹側を郭清基板の上、マウスを位置決めし、ピンの腕と足を開いて。70% エタノールを使って、マウスの体にスプレーしてください。
  5. 鉗子を使用すると、腹部、骨盤の中心の下の皮膚を組みます。鋭いはさみを使用して、下顎まで垂直カットをします。次に、2 つの層を離れて押すことによって腹腔の壁から皮膚を解剖、はさみで小動きを使用して閉じた。場所の死体の側に皮膚無菌臓器収穫の遮るもののないフィールドを作成します。
  6. そのまま腹膜や肝臓の周りの肋骨の下をつかんで胸郭に向かってそれを切り開きます。下部消化管を公開し、コロンを脾臓を明らかに左に移動します。カーブタイプ鉗子を使用すると、脾臓をつかんで、はさみで離れて結合組織を解剖します。場所 RPMI + 5 %fbs と氷の管の場所の 3 mL を含む 15 mL の円錐管に脾臓。
  7. 剣状突起で胸郭を安定化し、横隔膜を切開鉗子を使用します。肺が収縮、背骨に向かって落ちる。カット オープン胸郭胸プレートを除去する側面で。
  8. 分離し、右肺の14、肺動脈と静脈を切断優れた葉を削除します。組織を修正する 10 %nbf と少なくとも 24 時間常温管の場所を含む 15 mL の円錐管に、葉を配置します。右肺と左肺の残り葉を分離します。2 mL の PBS で 1% カゼインを含む 15 mL の円錐管に葉を配置し、氷の上に置きます。
  9. 肺静脈と肺を解剖マウスとして血でいっぱいに胸腔を許容し、動脈を切断した後に exsanguinates します。1 mL pipetman のヒント、使用血液を収集し、あらかじめラベル付き 1.5 mL 遠心チューブに転送。氷の上には、チューブを配置します。
  10. その後、首から気管を覆う軟組織 (リンパ節、耳下腺、舌下腺、顎下腺) を削除します。開き、気管を取り囲む保護膜を取り除きます。微妙、微細鉗子、はさみを使用して、食道から、他の結合組織、鎖骨の上から顎の下に気管を区切ります。
  11. 鉗子を使用すると、気管にしがみつくし、鎖骨の上部気管をカットします。弾力性を最大化し、気管喉頭、可能な限り分離すること (~ 1 cm) の右上顎の下部をカットする気管をプルダウンします。0.3 ml の PBS で 1% カゼインの事前ラベル付き 1.5 mL 遠心チューブ内器官を置き、氷の上に置きます。
  12. マウスの固定を解除して、腹側に, 鼻に明確なアクセスの研究者が直面しているマウスでそれを置きます。70% エタノール スプレー マウスの頭と、手を使って、骸骨の後ろに直接マウスを把握します。
  13. はさみを使って、鼻、鼻の下から始まってと上方に移動の柔らかい肉を切り取る。また、毛、皮膚、および鼻の周りひげを削除します。曲線はさみと鉗子で、鼻孔にその曲線外側に指すし、V のような形成を作成する目に向かって鼻の通路を開いてカットとはさみの先端を挿入します。
  14. 微細鉗子を使用すると、鼻中隔と作成された形成内の軟組織を収集します。0.3 ml の PBS で 1% カゼインの事前ラベル付き 1.5 mL 遠心チューブにティッシュを置き、氷の上に置きます。
  15. バイオハザード バッグで死体を処分します。次の動物を解剖する前に脱イオン水でツールを洗浄した後、70% エタノールが入ったビーカー。ツールを削除、余分なエタノールを振り払うし、次の解離を続行
  16. 次の手順 4.3 4.14 各マウスを解剖します。
  17. 下記のとおり、組織を処理します。

5. 脾臓の処理

  1. 脾臓を分離するに 60 mm 細胞培養用ディッシュに 70 μ m の細胞ストレーナーを配置します。脾臓とそれに伴うメディアを 3 mL シリンジのプランジャーを使用して、フィルターに注ぐ。それが完全に解離し、セル ストレーナー濾過まで慎重に器官をマッシュ アップします。
  2. 3 ml RPMI + 5% のフィルターを洗浄培養皿に FBS。細胞懸濁液を収集し、その元の 15 の mL の管にそれを置きます。細胞のペレットへの 4 ° C で 5 分間 450 x g でチューブを遠心します。
  3. 吸引や、上清をデカント アンモニウム塩化カリウム (ACK) バッファー (150 mM 塩化アンモニウム、炭酸水素カリウム 10 mM、0.1 mM ナトリウム EDTA) の 2 mL にペレットを再で赤の血液細胞を溶解します。室温 (25 ° C) で 3 分間インキュベートします。
  4. チューブを埋める RPMI + 4 ° C で 5 分間 450 x g で 5 %fbs と遠心チューブで最大 8 mL吸引または、上清をデカントします。再懸濁します細胞ペレットを 5 mL RPMI + 5 %fbs とカウントの検定と顕微鏡を使用して脾細胞。
  5. 2.5 倍の井戸あたり 10 の6セルを刺激するために必要な細胞量を計算します。48 ウェル プレートで T 細胞 RPMI 1640 + 10 %fbs、メディア 10 μ G/ml ゲンタマイシン、50 μ M β-メルカプトエタノール) ウェルあたりの 0.5 mL の細胞を播きます。
  6. 新鮮な管および 4 ° C で 5 分間 450 x g でペレット細胞に細胞懸濁液の必要量を配置上記計算に基づき、
  7. T 細胞メディアの必要量にペレットを再懸濁します。百日咳感染症モデルのワクチン抗原に対する抗原特異的サイトカイン応答をテスト: pertactin (Prn) と接着性繊維状赤血球凝集素 (FHA)。3 治療が必要なため、: 1) の刺激 (NS、ネガティブ コントロールとして)、2) Prn、および FHA 3)。アッセイの T 細胞メディアの 1.5 mL の 10 の6セル × 7.5 は必要 (0.5 mL あたり 10 の6セル × 2.5) です。
  8. 48 ウェル プレートに細胞懸濁液の分注 0.5 mL。
  9. 細胞を刺激するため、2 回 T 細胞メディアで必要な濃度で抗原を混ぜます。Prn と FHA の最終濃度 1 μ g/mL と 0.5 μ g/mL をそれぞれ =。したがって、2 μ g/mL Prn または 0.5 mL に 1 μ g/mL FHA をミックスします。その後、分注希釈 1 mL 各ウェルの最終巻で 1 x 抗原処理、指定各刺激媒体の 0.5 mL。
  10. 5% CO2の 37 ° C で版を孵化させなさい。事前にラベル付きマイクロ遠心チューブ用に 7 日目清と培養上清の分注 0.5 mL を収集します。-20 ° C で (図 6) elisa 法による抗原特異的サイトカインをテストする準備が整うまでのサンプルを格納します。

6. 肺の処理

  1. 滅菌は、15 mL dounce ホモジナイザーに (PBS で 1% カゼイン 2 mL) で肺を転送します。使用杵で組織をホモジナイズしてください。組織の大きな粒子がなくなるまでを切り離して考えます。元の 15 の mL の管に戻って均質懸濁液を配置します。
  2. 0.3 mL CFUs のメッキの分注を削除し、4 ° C で 5 分間 450 x g でホモジネートを遠心分離因数を収集して事前ラベル付き遠心に 0.5 mL 因数の上澄みはチューブします。Elisa 法によるサイトカインの解析まで、-20 ° C にサンプルを格納します。
  3. 連続希釈チューブ (滅菌 PBS の 0.9 mL) で均質化肺懸濁液の 0.1 mL を希釈して選択した希釈液を準備します。プレート済みラベルの 10% の BG に経験的に選択した希釈液の 0.1 mL + Sm 板と滅菌三角形スプレッダーを使用して拡散。
  4. 4 日間部屋の空気で 37 ° C で版を孵化させなさい。
  5. カウントし、CFUs/肺 (図 6) を計算します。簡単に言えば、プレートの希釈倍率によってそしてまた器官が処理された合計ボリュームで回復 CFU の数を乗算します。CFU の計算はそれぞれの動物のログ10値に変換し、グラフ化します。
    1. 30-300 植民地板が簡単かつ正確にカウントされます。以来、このような低コロニー数紹介エラー15計算未満 6 植民地板を使用しないでください。検出下限値を得るためには、器官は均質化した総量は原液の磨砕液から板にスポットを使用するボリュームで割った値 (e.g、原液の磨砕液を 0.1 mL で割った 2 mL 容量の下限に等しい。20 CFUs 検出)。

7. 鼻中隔や気管の処理

  1. 組織をホモジナイズしてください 1 %0.3 mL の PBS/カゼイン ペレットと乳棒コードレス モーター ホモジナイザーです。0.5 - 1 組織を均質化組織に主として分離されるまでの分。細菌は、懸濁液に落とす必要があります。
  2. 準備選択された 10 x 0.9 mL の滅菌 PBS を含む希釈チューブで均質化された懸濁液の 0.1 mL のシリアル希釈して希釈。ドット 0.1 mL にそれぞれの希釈済みラベル 10 %bg + Sm 板し 70% のエタノール洗浄と炎によって滅菌されている三角形の拡散機を使用して懸濁液を広げます。
  3. 4 日間部屋の空気で 37 ° C で版を孵化させなさい。
  4. カウントし、ステップ 6.5 (図 6) のように CFUs/オルガンを計算します。検出下限値を得るためには、器官は均質化した総ボリュームは使用量で割った値原液の磨砕液から皿の上の点に (例えば.、0.3 mL の総数で割った原液 equals の 0.1 mL 3 CFUs detecta の下限ble)。

8. 血の処理

  1. 赤い血液細胞のペレットへの 4 ° C で 30 分間 18,000 × g で孤立した全血を含むチューブを遠心します。
  2. 慎重に血清の上澄みと事前ラベル付きの血清微量遠心チューブにピペットを脱ぐ。さらに下流解析の準備ができるまで、-20 ° C でチューブを格納 (すなわち。、総および特定の Ig ELISA)。

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結果

説明モデルは、宿主-病原体相互作用中にワクチンの効率性と免疫反応を評価する方法を示しています。図 1は、免疫マウスに感染して解析のためのティッシュを収穫に使用する代表的なワクチン スケジュールを示しています。図 2は、予防接種や細菌の乳酸菌を提供する捜査官を有効にするマウスを誘導するために用いられる麻酔システムのセットアップを示します。図 3は、例外径600測定とマウスに配信される 100 希釈菌の準備 1 OD 菌浮遊を達成するために計算を示しています。図 4感染症に使用される接種材料の準備を示しています、めっき方式連続希釈、CFUs の列挙に使用例の計算のシリアル希薄をめっきに基づいてマウスに配信。図 5は、抗原特異的リコール誘発刺激ワクチン抗原 FH...

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ディスカッション

百日咳感染症ワクチン誘発される免疫を研究するここで説明した包括的なプロトコルも様々 な他の病原体に対するホスト評価が許可されます。プロトコルは、予防接種を提供、次のワクチンの有効性を確認する方法をについて説明します病原体の挑戦、そして免疫機能の並列の郭清。他の病原体を研究するために、プロトコルに適応させる、いくつかのパラメーターは変更する必要があります。これらが含まれますが、動物麻酔、ワクチン成分、投与量、投与経路のモードに限定されません。また、投与量および興味、収穫では、選択した組織の挑戦の病原体と免疫応答の下流の評価管理のルート興味の病原のため変更可能性があります要因もあります。

百日咳感染症のマウス モデルは広く使用されて、病態とワクチン学研究16,17,18,19,

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開示事項

著者が明らかに何もありません。

謝辞

この作品は、オハイオ州立大学から 1R01AI125560-01 とスタートアップの資金によって支えられました。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
2L 誘導チャンバーVet Equip941444
FlurisoVet OneV1 501017どのブランドも適切です
Bordet Gengou 寒天基BD バイオサイエンス248200
カゼインSigmaC-7078
カサミノ酸VWRJ851-500Gストレーナー ショルテ (SS) メディアコンポーネント
L-グルタミン酸研究製品 IntG36020-500
L-プロリン研究製品 IntP50200-500
塩化ナトリウムフィッシャーBP358-10
リン酸カリウム 一塩基性フィッシャーBP362-1
塩化カリウムフィッシャーP217-500
塩化マグネシウム六水和物フィッシャーM2670-500G
塩化カルシウムフィッシャーC75-500
トリスベースフィッシャーBP153-1
L-システイン HClフィッシャーBP376-100SS 培地供給
硫酸第一鉄七水和物シグマF-7002
ナイアシン研究製品 IntN20080-100
グルタチオン研究製品 IntG22010-25
アスコルビン酸研究製品 IntA50040-500
RPMI 1640サーモフィッシャー サイエンティフィック11875093
FBSシグマF2442-500mL 任意の米国源、非加熱不活
化ゲンタマイシンThermoFisher Scientific15710064
B-メルカプトエタノールフィッシャー BP176-100
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3mLシリンジBDバイオサイエンス309657
15mLコニカルチューブフィッシャー 
1.5mLマイクロチューブDenvilleC2170
70umセルストレーナーフィッシャー 
60mm プレートサーモフィッシャー サイエンティフィ130181
48 ウェル組織培養プレートサーモフィッシャー サイエンティフィック08-772-1C
1mL インスリン シリンジ 28G1/2フィッシャー サイエンティフィック/Excel Int.14-841-31
マウスIFN-γ ELISA Ready-SET-Go!キット Invitrogen / eBioscience50-173-21
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マウス IL-5 ELISA Ready-SET-Go!キットInvitrogen / eBioscience50-172-09
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参考文献

  1. Tacken, P. J., Figdor, C. G. Targeted antigen delivery and activation of dendritic cells in vivo: steps towards cost effective vaccines. Seminars in Immunology. 23 (1), 12-20 (2011).
  2. Kilgore, P. E., Salim, A. M., Zervos, M. J., Schmitt, H. J. Pertussis: Microbiology, Disease, Treatment, and Prevention. Clinical Microbiology Reviews. 29 (3), 449-486 (2016).
  3. Dorji, D., et al. Bordetella Pertussis virulence factors in the continuing evolution of whooping cough vaccines for improved performance. Medical Microbiology and Immunology. 207 (1), 3-26 (2018).
  4. Feldstein, L. R., et al. Global Routine Vaccination Coverage, 2016. Morbidity and Mortality Weekly Report. 66 (45), 1252-1255 (2017).
  5. Cherry, J. D. Epidemic pertussis in 2012--the resurgence of a vaccine-preventable disease. New England Journal of Medicine. 367 (9), 785-787 (2012).
  6. Celentano, L. P., et al. Resurgence of pertussis in Europe. The Pediatric Infectious Disease Journal. 24 (9), 761-765 (2005).
  7. McNabb, S. J., et al. Summary of notifiable diseases. Morbidity and Mortality Weekly Report p. 54 (53), 1-92 (2007).
  8. Sealey, K. L., Belcher, T., Preston, A. Bordetella pertussis epidemiology and evolution in the light of pertussis resurgence. Infection, Genetics, and Evolution. 40, 136-143 (2016).
  9. Warfel, J. M., Merkel, T. J. The baboon model of pertussis: effective use and lessons for pertussis vaccines. Expert Reviews of Vaccines. 13 (10), 1241-1252 (2014).
  10. Jennings-Gee, J., et al. The adjuvant Bordetella Colonization Factor A attenuates alum-induced Th2 responses and enhances Bordetella pertussis clearance from mouse lungs. Infection and Immunity. , (2018).
  11. Sukumar, N., Mishra, M., Sloan, G. P., Ogi, T., Deora, R. Differential Bvg phase-dependent regulation and combinatorial role in pathogenesis of two Bordetella paralogs, BipA and BcfA. Journal of Bacteriology. 189 (10), 3695-3704 (2007).
  12. Stainer, D. W., Scholte, M. J. A simple chemically defined medium for the production of phase I Bordetella pertussis. Journal of General Microbiology. 63 (2), 211-220 (1970).
  13. Bordet, J. Le microbe de le coqueluche. Annales de l'Institut Pasteur. 20, 731-741 (1906).
  14. Cook, M. J. The Anatomy of the Laboratory Mouse. , Academic Press. (1965).
  15. Sutton, S. Accuracy of Plate Counts. Journal of Validation Techniques. 17 (3), 42-46 (2011).
  16. Conover, M. S., Sloan, G. P., Love, C. F., Sukumar, N., Deora, R. The Bps polysaccharide of Bordetella pertussis promotes colonization and biofilm formation in the nose by functioning as an adhesin. Molecular Microbiology. 77 (6), 1439-1455 (2010).
  17. Cattelan, N., Jennings-Gee, J., Dubey, P., Yantorno, O. M., Deora, R. Hyperbiofilm Formation by Bordetella pertussis Strains Correlates with Enhanced Virulence Traits. Infection and Immunity. 85 (12), (2017).
  18. Andreasen, C., Carbonetti, N. H. Pertussis toxin inhibits early chemokine production to delay neutrophil recruitment in response to Bordetella pertussis respiratory tract infection in mice. Infection and Immunity. 76 (11), 5139-5148 (2008).
  19. Mills, K. H., Gerdts, V. Mouse and pig models for studies of natural and vaccine-induced immunity to Bordetella pertussis. Journal of Infectious Diseases. 209, Suppl 1 16-19 (2014).
  20. Dunne, A., et al. A novel TLR2 agonist from Bordetella pertussis is a potent adjuvant that promotes protective immunity with an acellular pertussis vaccine. Mucosal Immunology. 8 (3), 607-617 (2015).
  21. Denoel, P., Godfroid, F., Guiso, N., Hallander, H., Poolman, J. Comparison of acellular pertussis vaccines-induced immunity against infection due to Bordetella pertussis variant isolates in a mouse model. Vaccine. 23 (46-47), 5333-5341 (2005).
  22. Marr, N., et al. Protective activity of the Bordetella pertussis BrkA autotransporter in the murine lung colonization model. Vaccine. 26 (34), 4306-4311 (2008).
  23. Feunou, P. F., Bertout, J., Locht, C. T- and B-cell-mediated protection induced by novel, live attenuated pertussis vaccine in mice. Cross protection against parapertussis. PLoS One. 5 (4), 10178(2010).
  24. Mills, K. H., Ryan, M., Ryan, E., Mahon, B. P. A murine model in which protection correlates with pertussis vaccine efficacy in children reveals complementary roles for humoral and cell-mediated immunity in protection against Bordetella pertussis. Infection and Immunity. 66 (2), 594-602 (1998).
  25. Higgs, R., Higgins, S. C., Ross, P. J., Mills, K. H. Immunity to the respiratory pathogen Bordetella pertussis. Mucosal Immunology. 5 (5), 485-500 (2012).
  26. Alving, C. R. Design and selection of vaccine adjuvants: animal models and human trials. Vaccine. 20, Suppl 3 56-64 (2002).
  27. Ipp, M. M., et al. Adverse reactions to diphtheria, tetanus, pertussis-polio vaccination at 18 months of age: effect of injection site and needle length. Pediatrics. 83 (5), 679-682 (1989).
  28. Fessard, C., Riche, O., Cohen, J. H. Intramuscular versus subcutaneous injection for hepatitis B vaccine. Vaccine. 6 (6), 469(1988).
  29. Bergeson, P. S., Singer, S. A., Kaplan, A. M. Intramuscular injections in children. Pediatrics. 70 (6), 944-948 (1982).
  30. Zhang, L., Wang, W., Wang, S. Effect of vaccine administration modality on immunogenicity and efficacy. Expert Review of Vaccines. 14 (11), 1509-1523 (2015).
  31. Ross, P. J., et al. Relative Contribution of Th1 and Th17 Cells in Adaptive Immunity to Bordetella pertussis: Towards the Rational Design of an Improved Acellular Pertussis Vaccine. PLoS Pathogens. 9 (4), 1003264(2013).
  32. Warfel, J. M., Zimmerman, L. I., Merkel, T. J. Acellular pertussis vaccines protect against disease but fail to prevent infection and transmission in a nonhuman primate model. Proceedings of the National Academy of Sciences USA. 111 (2), 787-792 (2014).
  33. Allen, A. C., et al. Sustained protective immunity against Bordetella pertussis nasal colonization by intranasal immunization with a vaccine-adjuvant combination that induces IL-17-secreting TRM cells. Mucosal Immunology. , (2018).
  34. Solans, L., et al. IL-17-dependent SIgA-mediated protection against nasal Bordetella pertussis infection by live attenuated BPZE1 vaccine. Mucosal Immunology. , (2018).
  35. Miller, M. A., et al. Visualization of murine intranasal dosing efficiency using luminescent Francisella tularensis: effect of instillation volume and form of anesthesia. PLoS One. 7 (2), 31359(2012).
  36. Sato, Y., Izumiya, K., Sato, H., Cowell, J. L., Manclark, C. R. Aerosol infection of mice with Bordetella pertussis. Infection and Immunity. 29 (1), 261-266 (1980).
  37. Warfel, J. M., Beren, J., Merkel, T. J. Airborne transmission of Bordetella pertussis. Journal of Infectious Diseases. 206 (6), 902-906 (2012).
  38. Scanlon, K. M., Snyder, Y. G., Skerry, C., Carbonetti, N. H. Fatal Pertussis in the Neonatal Mouse Model Is Associated with Pertussis Toxin-Mediated Pathology beyond the Airways. Infection and Immunity. 85 (11), (2017).
  39. Martinez de Tejada, G., et al. Neither the Bvg- phase nor the vrg6 locus of Bordetella pertussis is required for respiratory infection in mice. Infection and Immunity. 66 (6), 2762-2768 (1998).
  40. Higgins, S. C., Jarnicki, A. G., Lavelle, E. C., Mills, K. H. TLR4 mediates vaccine-induced protective cellular immunity to Bordetella pertussis: role of IL-17-producing T-cells. Journal of Immunology. 177 (11), 7980-7989 (2006).
  41. Mahon, B. P., Brady, M. T., Mills, K. H. Protection against Bordetella pertussis in mice in the absence of detectable circulating antibody: implications for long-term immunity in children. Journal of Infectious Diseases. 181 (6), 2087-2091 (2000).
  42. Karlsson, A. C., et al. Comparison of the ELISPOT and cytokine flow cytometry assays for the enumeration of antigen-specific T-cells. Journal of Immunological Methods. 283 (1-2), 141-153 (2003).
  43. Hagen, J., et al. Comparative Multi-Donor Study of IFNgamma Secretion and Expression by Human PBMCs Using ELISPOT Side-by-Side with ELISA and Flow Cytometry Assays. Cells. 4 (1), 84-95 (2015).
  44. Raeven, R. H. M., et al. Molecular and cellular signatures underlying superior immunity against Bordetella pertussis upon pulmonary vaccination. Mucosal Immunology. 11 (3), 1009(2018).

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