蛍光抗体法を用いたマウス脳内シナプス蛋白質の不均質分布の定量化

Summary

ここでは、蛍光染色を使用してマーカー蛋白質、共焦点顕微鏡、コンピューターによる解析を基準にしてシナプス蛋白質の分布を決定する定量的アプローチについて述べる。

Abstract

有無または特定のシナプス蛋白質のレベル、重度なシナプス伝達に影響を与えます。蛋白質の機能を解明、に加えてまたその分布を決定することが重要です。ここでは、蛍光抗体法、共焦点顕微鏡、シナプス蛋白質 (TPRGL または SVAP30 とも呼ばれます) の発動機の分布を決定するためのコンピュータ ベース解析を用いたプロトコルについて述べる.我々 はシナプス小胞の豊かさに対する定量的方法で発動機の分布の決定によりシナプス小胞タンパク質シナプトフィジンの発動機の分布を比較します。特に、このメソッドは、異なる研究内または異なる抗体または顕微鏡を用いたタンパク質の分布の比較を許可する実装潜在的可能性があります。本手法は、絶対蛍光レベルではなく、比率を生成することによって蛍光染色の固有の変動を回避できます。また、述べるメソッドにより、さまざまなレベルでのタンパク質の分布を分析する研究者: 海馬のまたは感覚の異なるレイヤーなどの一つの脳領域で異なるサブ領域に脳を全脳スライスから野。Mover は、シナプス小胞に関連付けられている脊椎動物に固有のタンパク質です。この方法では、頭脳区域、扁桃体、中隔核、腹側フトゲツツガムシとまた海馬の異なる層などの単一の脳領域内で高レベルの分散不均一の発動機を紹介します。

Introduction

ニューロン間の通信は、シナプスと呼ばれる特殊な接触部位で発生します。シナプスには、無数組み合わせによって、シナプス伝達の異なった蛋白質にはが含まれています。それらの蛋白質のいくつかは神経系全体の不均質分布を示しシナプス¹には存在しません。そのような蛋白質のための 1 つの例は Munc13 は、シナプス小胞のプライミング プロセスに関与しています。²脳全体に分散不均一、Munc13 の異なるアイソ フォームがあるし、特定のアイソ フォームの存在の有無に影響を与える短期シナプスとシナプス小胞ダイナミクス^3,4,5します。 したがって、極めて重要な脳の領域間で異なるシナプス蛋白質の存在を識別することができるためです。

シナプス蛋白質の - 今のところ - 定量化のための選択の方法は、質量分析法とウエスタンブロットというよりも、免疫組織化学^6,7,8,9。量と (すなわち、ヴィルヘルムら特定の蛋白質の局在化の両方を評価するためにお互いを補完するためにいくつかのケースでいくつかのメソッドを使用します。¹⁰). ここで述べる手法によりローカリゼーションと単に蛍光染色を用いて、生化学的方法を使用を必要とせず興味の蛋白質の定量。ここでもう一つの利点は小さい領域上の定量化を行うことができ、したがって、それらよりも、具体的、他の方法で達成します。ただし、信頼性の高いリファレンス タンパク質が興味の蛋白質の分布を評価するために必要なことを考慮する必要があります。

免疫組織化学的蛍光染色異なる神経細胞コンパートメント内にあるだけでなく、脳の領域にわたって日常的にタンパク質の局在を識別することができます。別のコンパートメントを識別するために特定のマーカーが使用されます。通常、synapsin、シナプトフィジン¹¹に対する抗体はファゴット抗体ラベル シナプス前ターミナル¹²のアクティブ ゾーン間シナプス小胞のラベルに使用できます。小胞性の GABA トランスポーター vgat (ノックアウト)、小胞グルタミン酸トランスポーター (vGluT) などの小胞輸送は、それぞれ興奮¹³と¹⁴抑制シナプス前ターミナルをラベルに使用されます。シナプス後側、シナプス ターミナルとシナプス後密度タンパク質 95 (PSD95)^15,16,17または gephyrin¹⁸に対する抗体をマークするホーマー タンパク質に対する抗体を用いることができます。^,19,興奮性、抑制性シナプス ターミナルにそれぞれラベル²⁰を使用できます。関心と上述のものなどのマーカー蛋白質に対する抗体を使用して、このようなタンパク質の局在を決定できます。これまで多くの研究は、質的方法²¹でこれを行っています。ただし、特定のシナプス蛋白質の特異的分布を確実に判断するには、いずれかの必要がありますのみ決定その存在または不在だけでなく、その相対濃度。サイズの不均一性と密度シナプスのシナプス マーカーと興味の蛋白質の比率を確立することが重要になります。海馬の非錐体層、小脳分子層などのシナプスの豊富な地域がシナプス蛋白質、その蛋白の強い存在のためにないが、シナプスの密度が高いためだけの高密度が表示されますそれ以外の場合、それぞれのシナプスは (例えば、Wallrafen および Dresbach の¹)。(例えば、TGN38²²) 神経細胞体でタンパク質、海馬錐体細胞層や神経細胞の細胞体の高濃度のため海馬や小脳顆粒細胞層で強力なプレゼンスを通常表示する一方、それらの領域。したがって、構造、この非均一に分布はこの場合、シナプス、自体興味の蛋白質の分布の偽の推定につながることができます。さらに、免疫組織化学的染色のサンプル間で強度を染色に本質的な可変性があります。ここで説明されているプロトコルはこれを考慮し、免疫組織化学的方法から生じるその他の注意事項と同様に、そのようなバイアスを回避できます。

私たちの最近の研究は、我々 は 16 異なる脳領域¹にわたって Mover (TPRGL²³または SVAP30²⁴とも呼ばれます) の差分式を記述するこのメソッドを使用しています。発動機は脊椎動物に固有のシナプス蛋白質シナプス小胞との関連で見つけることができますし、神経伝達物質のリリース^25,26,27に影響を与えます。シナプス小胞の豊かさに発動機式シナプス小胞参照マーカーとしてシナプトフィジンの染色関連ている。特に中隔核, 腹側フトゲツツガムシと扁桃体に発動機の高レベルを見つけた。海馬はわかった海馬内計算と入力と出力層の低レベルに関連付けられているレイヤーのレベルが高い、Mover の不均質分布

Protocol

このプロトコルは、生きている動物実験を行いません。脳サンプルを入手するために動物の安楽死させる実験は、承認番号 T 10/30 の下でローカル動物保護当局 (Tierschutzkommission der Universitätsmedizin ゲッティンゲン) によって承認されました。

注: このプロトコルの 3 の成人男性 c57bl/6 マウスが使用されました。

1. サンプル準備

1. 定着剤および 0.1 M のリン酸バッファー (PB;テーブル 1を参照) を準備します。
2. ゲージらで説明されているように transcardial 潅流によって動物を修正します。²⁸。 最初 0.9 と血を洗い流す %、食塩を、30 ml の 4% パラホルムアルデヒド (PFA) の灌流。
3. ハサミで頭蓋骨を開き、慎重に組織を損傷しないように鈍端のスプーンを使用して脳を分離します。
4. 定着剤を 50 mL の反応管を記入し、4% で脳を後置 4 ° c 一晩 PFA。
5. 定着剤を取り外して 30 分間シェーカーで 0.1 M PB の 50 mL の脳を洗います。
6. 洗浄後、0.1 M PB 48 h またはそれに対する凍害保護作用のための 4 ° C でチューブに沈むまでに 30% ショ糖で 50 mL の反応管で脳をインキュベートします。
7. 鋭い刃を持つ cryoprotected 脳をトリム、cryomold に配置し、最適な切削温度 (OCT) 化合物を埋め込みます。泡を避けるため。脳の向きし、-80 ° C のフリーザーで cryomold をフリーズします。
8. 区分のための凍結するティッシュをマウントします。区分する前に少なくとも 15 分 cryomicrotome 温度に組織を平衡します。
9. 25 μ m の厚切りコロナに脳をセクションします。脳の組織に触れることがなくガラスのフックで慎重に 10 月をタップします。24 well プレートのウェルあたりの 3 つの隣接するスライスを収集し、染色まで 4 ° C で 0.1 M の鉛にそれらを保管します。
   注: プロトコルは、2 週間ここで休止できます。長い保存期間は、組織の品質を妨げるでき、従って実験の結果に影響を与えます。

2. 蛍光抗体法

1. ブロック バッファー、抗体バッファー、バッファー 1、および洗浄液 2 (表 1参照) を洗浄を含むソリューションを準備します。
2. 一度余分な 10 月を削除する PB とスライスをすすいでください。
   1. 脳スライスの吸引せずプラスチック ピペットとソリューションを削除します。1000 μ L ピペットと新鮮な PB の 250 μ L を追加します。
      注意: スライス乾燥しない、だから削除し、水分もを追加します。
3. プラスチック ピペットで PB を削除し、250 μ L 1000 μ L ピペットで井戸あたりのブロック バッファーを追加します。シェーカーに室温 (RT) で 3 時間孵化させなさい。
4. 培養時間の間に抗体の反応管内のバッファーに一次抗体を希釈します。ウェルあたり 250 μ L 抗体バッファーを使用し、抗体の適切な量を追加 (表 2参照) で 2 μ L ピペットを使用してソリューションに直接ピペッティングします。上下に数回軽くピペッティングして混合します。適切な混合を確実にその後まもなく渦。
   注: 背景の蛍光性を決定するには、染色も対象となる一次抗体を追加せず。そのため、プロトコルに従って一次抗体に抗体溶液でスライスをインキュベートします。
5. 培養時間後プラスチック ピペットのブロック バッファーを削除し、250 μ L/ウェル一次抗体を含む抗体溶液を追加します。シェーカーで 4 ° C で一晩一次抗体とスライスを孵化させなさい。
6. 次の日、洗浄バッファー 1 3 ウォッシュ スライス シェーカーで RT で 10 分の x。
   1. プラスチック ピペットで培地を取り除き、洗浄液 1 ウェルあたりの 300 μ L を追加します。10 分を繰り返して 3 回 RT で孵化させなさい。
7. 洗浄のステップの間に抗体の反応管内のバッファーに fluorophore 共役二次抗体を希釈します。ウェルあたり 250 μ L 抗体バッファーを使用し、抗体の適切な量を追加 (表 2参照) で 2 μ L ピペットを使用してソリューションに直接ピペッティングします。上下に数回軽くピペッティングして混合します。適切な混合を確実にその後まもなく渦。
   注意: 抗体光に敏感なので、この時点からのすべてのステップを暗闇の中で実行する必要があります。
8. 洗浄ステップの取り外し洗浄バッファー プラスチック ピペットを 250 μ L/ウェル二次抗体を含む抗体溶液を追加後。暗闇の中で RT で 90 分の二次抗体とスライスを孵化させなさい。
9. 洗浄液 2 3 とスライスを洗って室温 10 分 x
10. 洗浄のステップ中 4 ', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) 配分の濃度 0.1 M pb を希釈します。
11. プラスチック ピペットの洗浄バッファー 2 を削除し、250 μ L/ウェル DAPI 溶液を追加します。シェーカーの RT で 5 分間インキュベートします。
12. プラスチック ピペットの DAPI ソリューションを削除し、500 μ L 1000 μ L ピペットとウェルあたり 0.1 M PB を追加します。
13. 顕微鏡のスライドには、スライスをマウントします。
    1. 株分け業顕微鏡スライドを配置します。細かいブラシでスライドに 0.1 M PB の別 3 が値下がりしましたを追加します。顕微鏡スライド ドロップあたり 1 つのスライスを配置します。
    2. 細かいブラシを使用して、平らにし、顕微鏡のスライド上のスライスを方向づけます。
    3. すべてのスライスが正しく配置、ティッシュで余分な鉛を削除し、スライドを慎重に乾燥します。
       注意: は、脳スライスを完全に乾燥を避けます。
    4. 埋め込みスライドに媒体の 80 μ L を追加します。脳スライスのそれによって埋め込みスライドに coverslip へ慎重に置きます。
    5. 発煙のフードに 1-2 時間で乾燥するスライドを残す (光の露出を避けるためにそれらをカバー)、4 ° C で顕微鏡スライドのボックスに保管
       注: プロトコルはここで一時停止することができます。

3. イメージング

1. 埋め込みメディアを完全に硬化した後は、共焦点顕微鏡顕微鏡スライドを配置します。
   注: デコンボリューション ソフトウェアと落射蛍光顕微鏡は、同様の画像品質を得られるはず。
2. グレー値の最大分布を確保するためにいくつかのピクセルが露出するようにすべてのチャネルのレーザー強度を強めたり弱めたりレーザーの設定を調整します。
3. 別のチャネルの全脳スライスの仮想組織を取得します。
   1. イメージング ソフトウェアで (材料の表を参照)、タイルオプションを選択し、手動でタイル領域セットアップと脳スライスを描きます。
   2. タイル地域全体のサポート ポイントを配布し、確認タイル領域/位置.を押すことによってさまざまなサポート ポイントのフォーカスを調整
   3. 結果として得られる画像の解像度とファイル サイズによるとアクイジション ・ モードの設定を調整し、スキャンを開始します。
4. スキャンが完了したら、仮想組織を処理するのに合成関数を使用します。画像エクスポート機能付き .tif としてファイルをエクスポートします。

4. コンピューター ベースの分析

1. フィジー²⁹にファイルをクリックして 1 つのイメージのすべての単一チャネルを読み込む |オープン。
2. フリーハンド選択ツール、DAPI チャネルで 1 つの半球を描きます。編集をクリックすると、選択範囲のマスクを作成 |選択 |マスクを作成する。
3. 分析をクリックして単一のチャネル (発動機およびシナプトフィジン) の平均蛍光強度を決定 |メジャー。
   注: 各チャンネルの平均蛍光強度値を決定する別のチャネルを選択するを確認します。
4. 単一チャネルの平均蛍光強度をスプレッドシートにコピーします。
5. 関心のある領域の単一チャネルの平均蛍光強度を確認するには、フリーハンド選択ツールでも領域の輪郭を描きます。マウスの脳アトラスを参照として使用します。
6. すべての半球および興味のすべての領域に対して、手順 4.1 4.5.
   注: 後で半球の関心の領域の値を比較するために、各半球の値を個別に確認 (5.2 を参照)。

5 データ処理

1. 蛍光バック グラウンドが高い場合 (ディスカッションを参照)、背景差分が必要になる場合があります。そのためプライマリ参照蛋白抗体なしで処理されるスライスの平均蛍光強度を決定する (ここで: シナプトフィジン) と脳領域と半球で得られたすべての値から値を減算します。
2. すべての半球におよび興味のすべての領域の単一チャネルの平均蛍光強度が決定されているとき (表 3を参照)、シナプトフィジン (値 Mover の値で割ってシナプトフィジンに発動機の比率を計算します。表 3では黄色)。別に興味のすべての半球とすべてのこの操作を実行します。
3. 半球に関心のある分野の比率を決定する対応する半球 (表3 オレンジ) の比率の関心の 1 つの領域の取得比率に分割します。
4. Mover 個体を決定するには、(表 3に赤) 1 からの偏差を決定することによってパーセンテージに 5.2 で得られた比を変換します。1.25 の比率は上記の平均 25% の相対的な発動機の豊かさを与えるだろうしたがってと 0.75 の比率が平均以下 25% の相対 Mover の豊かさをもたらすでしょう。

Results

染色パターンの別のマーカーの代表は、図 1に見ることができます。パターンは、タンパク質の分布に応じて異なります。5 つの吻尾側レベルの例の列 (A)-(E)。最初の行に示すように、代表的な DAPI 染色: DAPI は細胞の DNA に付着し、従って核が染色します。点状のパターンでこの結果します。高細胞密度の領域は、低細胞密度の領域よりも明るい。不均一分散蛋白質の例は、2 番目の行で見ることができます。染色 Mover は、明るいホット スポット領域と調光器の分野で、脳全体の差分分布を明らかにします。3 番目の行でより均一分散参照マーカー シナプトフィジンの例を示します。2 つの蛋白質のオーバーレイ (4 行目)、差分の分布を示す Mover (赤) マーカー タンパク質シナプトフィジン (緑) と比較して。

Discussion

メソッドは、既知の分布とマーカー蛋白質の豊かさに対する興味の蛋白質の分布の定量化を目指すを紹介しました。免疫蛍光染色染色強度の異なるスライスの間の高い可変性を示すことができます。ここで説明した定量化手法半球間なかに興味の蛋白質の比率を決定することによってこの問題を回避できます。したがって、スライス全体染色強度の違いキャンセルされ、定量的な説明を可能にします。

すべての蛍光抗体のプロトコルと同様質的または量的、いくつかの要因が成功に影響を与える、それにより分析を混同します。したがって、特別な注意はプロトコルの重要なステップに支払われる必要があります。まず、組織の適切な固定が必要です。この固定は、成功 transcardial 潅流によって通常達成できます。灌流の品質は、血を洗った後まもなく肝臓をチェックすることによって確認できます。正常な血流のため最初のインジケーターは肝臓と四肢の²⁸のクリアです。灌流が遅すぎるかもしれないが、次回より高速に実行する必要があります血栓の存在を示したりできます。いくつかのタンパク質は、PFA で化学固定は...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
1.5 mL 反応チューブ	Eppendorf	30120094
50 mL 反応チューブ	Greiner Bio-One	227261
マルチウェル 24 ウェル	Fisher Scientific	087721H
プラスチックピペット (使い捨て)	Sarstedt	861,176
1000 mL ピペット	レイニン
2 ml ピペット	Eppendorf	3123000012
Vortex Genius 3	IKA	3340001
Menzel顕微鏡スライド	Fisher Scientific	10144633CF
ステレオスコープ	ライカ
LSM800	ツァイス		共焦点顕微鏡
凍結ミクロトーム	ライカ
PBS (10X)	ロシュ
11666789001 PFA	シグマ	P6148-1KG
NaCl	BioFroxx	1394KG001
ショ糖	neoFroxx	1104KG001
ティッシュ テック	さくら	4583	OCT
Na2HPO4	BioFroxx	5155KG001
NaH2PO4	メルク	1,063,460,500
正常なヤギの血清	メルク ミリポア	S26-100ML
正常なロバの血清	メルク	S30-100ML
トリトン X-100	メルク	1,086,031,000
ウサギ アンチムーバー	シナプス システム	RRID:AB_10804285
モルモット抗シナプトフィジン	シナプス系	RRID:AB_1210382
ロバ抗ウサギAF647	Jackson ImmunoResearch	RRID:AB_2492288
ヤギ抗マウスAF488	Jackson ImmunoResearch	RRID:モ
	Calbiochem
ZEN2 blueソフトウェア	Zeiss		Microscopy software
FIJI	ImageJ		Analysis software
Microsoft Excel	Microsoft