ゼブラフィッシュ幼虫における食品媒介感染症のための車両として原虫ゾウリムシを使用してください。

ゼブラフィッシュ共有形態学的および機能的保存顆粒球系統 (好中球など)、単球/マクロファージのような細胞、Toll 様受容体、炎症性サイトカイン、抗菌ペプチド^{1 を含む哺乳類の機能}.ゼブラフィッシュの腸管が完全に 6 日間ポスト受精 (dpf) で開発および哺乳類の消化管、腸管上皮細胞における保存された転写制御などの形態的, 機能的省を示しています²。 これによりゼブラフィッシュ、腸内微生物の定着と病原性に優れたモデル。ゼブラフィッシュ モデルでは、腸管出血性大腸菌³、コレラ^4、5、サルモネラ⁶、腸内微生物の広い範囲を研究されている、ゼブラフィッシュ叢^7、8、および腸管免疫⁹でプロバイオティクスの役割。ゼブラフィッシュ モデルの明確な利点は、それは混合微生物集団^3,のコンテキストで微生物の行動の調査を可能にする内因性細菌叢を中断させることがなく多くの微生物によって植民地⁶. 現在、胃腸の植民地化および病気のほとんどのゼブラフィッシュ モデルは一定時間¹⁰の細菌懸濁液のゼブラフィッシュを培養する場所、浸漬法による微生物の管理に依存します。ただし、これは投与し、細菌の正確な投与量の決定が難しく、非病原性細菌、特にいくつかの微生物と限られた植民地化に 。また、細菌懸濁液は経口¹¹を介して魚に投与されるが、これは技術的に挑戦的より古い幼虫と大人の魚に限定。

このプロトコルでは、単細胞の原生動物ゾウリムシのゼブラフィッシュ幼虫の消化管への微生物の食品媒介配信するための手段としての使用について説明します。ゾウリムシは簡単かつ安価に維持するために、様々 な藻類、菌類および細菌は、口部の繊毛溝^12,13,14を通して彼らを内面化をはじめとする、微生物の供給が可能です。内面、細菌は空胞で開催されます一度最終的に酸性し、目次はいくつかの時間¹⁵時間をかけて溶かされます。ゼブラフィッシュ稚魚キャプチャ ゾウリムシ自然の獲物として孵化後すぐに約 3-4 dpf 温度¹⁶、によって異なり、高効率でそれらを取る。獲物捕獲のプロセスは、検出から平均 1.2 の¹⁷をキャプチャして、内面化された細菌が腸管³に解放されるようにキャプチャされたゾウリムシ、ゼブラフィッシュ前腸で消化されるすぐに。その結果、ゾウリムシは、ゼブラフィッシュの消化管に細菌の高と一貫した線量を提供する速く、簡単な方法として使用できます。配信された細菌は、前述のように、mCherry などの蛍光蛋白質を表現するか変換ことができますまたは、事前内で可視化できるように蛍光色素で染色できる遺伝的難治性細菌の場合、消化管。

このプロトコルを記述する腸管病原大腸菌食中毒配信 (腸管出血性大腸菌[EHEC] 付着性と侵襲性大腸菌[AIEC]) とサルモネラssp ネズミチフス菌。病原性大腸菌、サルモネラ送信経由で糞便口頭ルート^18,19, と取得を介して汚染された食品では、肉、野菜、乳製品などをすることができます。ゾウリムシを使用すると、車両として、エシェリヒア属大腸菌およびサルモネラ正常に植民地化ゾウリムシ車両と共同の孵化の 30-60 分以内ゼブラフィッシュ幼虫。達成の細菌負荷は、植民地化を視覚化し、組織ホモジネートをメッキすることによって負担を決定する十分な堅牢です。

ゼブラフィッシュ飼育、繁殖、, ここで説明実験ケアおよび実験動物の使用のためのガイドに従い、およびプロトコルであるテキサス大学健康科学センターの機関の動物福祉委員会によって承認されています。番号 AWC-16-0127。

1. 成長とゾウリムシの維持

1. ゼブラフィッシュ国際リソース センター (ジルコニウム) などのソースからライブ ゾウリムシのカルチャを取得します。
2. ライブ成長文化からゾウリムシ文化、1 で再停止される大腸菌MG1655 文化 (外径₆₀₀ 1.0-2.0 光密度) の 1 mL の 1 mL を追加 x E3 (0.29 g/L の NaCl、KCl、13 mg/L 44 mg/L CaCl₂、81 mg/L MgSO₄、0.48 g/L HEPES、pH 7.0、滅菌)、1 の 8 mL と 10 mL の培養フラスコに x E3。軽く旋回し、22 ° C で保存
3. 文化を維持するために、2 週間ごと通路ゾウリムシ文化の 1 mL に新鮮な 1 x E3 培 10 の 9 mL と 10 mL の培養フラスコ⁸ CFU/mL 1 で再停止される大腸菌MG1655 の x E3。

2. ゼブラフィッシュに投与された細菌の用量の決定

1. ゾウリムシ内細菌の半減期を決定します。
   注:ゾウリムシ内細菌の半減期は、以下のとおり実行可能な大腸菌が治ったゾウリムシ、めっきによって決定されます。
   1. 次の細菌 (外径₆₀₀ 1.0) 22 ° C でゾウリムシの 2 時間培養、ゾウリムシと 50 mL の円錐管に細菌培養を組み合わせて、x、E3 とカウント 1 でゾウリムシを洗う (下記のとおりの手順では 1 ミリリットルあたりゾウリムシの数3.2.7 および 3.2.8)。
   2. ゾウリムシの数を数え、ゾウリムシと細菌培養 (暴露 6 h 後) のすべての時間の 50 μ L を削除し、新しい 1.5 mL チューブに各サンプルを追加します。
   3. 1% 非イオン性界面活性剤の場所 950 μ L (材料表参照) 各 1.5 mL チューブとゾウリムシを溶解する 1 分の渦にリン酸バッファー生理食塩水 (PBS) ソリューション。1:10 を実行 (すなわち、900 μ L、100 μ L) 希釈剤として滅菌 PBS を使用する各サンプルの希釈液です。
   4. 選択式ナンバー プレート上に各希釈の 100 μ L をプレート (LB テト媒体: 30 μ G/ml テトラサイクリン 1 g/L の NaCl, 0.5 g/L 酵母エキス 1 g/L トリプトン) と 16 h の 37 ° C で孵化させなさい。次の日はカウントし、のみ分離と異なる個々 のコロニーを数えることによってプレート (コロニー形成単位 CFUs) の細菌のコロニー数を記録します。30-300 CFU を与える希釈とプレートを識別します。
   5. 希釈を決定する係数を使用しています。たとえば、細菌文化の 1 μ L は 99 mL の滅菌 PBS と混合、これは (0.01) 1: 100 希釈です。この番号は、希釈 CFU の数になります。元のサンプル CFU を判断するためのすべての時間ポイントの下、計算を実行します。
      
   6. 計算し実行可能なエシェリヒア属大腸菌の数をグラフ/時間に対応するゾウリムシ ステップ 3.3.1 で計算されたゾウリムシの濃度を使用して露出を投稿し、ゾウリムシ (図 1) 内での半減期を決定します。
   7. CFU を使用して各時間ポイント数が計算される計算し、実行可能な大腸菌軸、y 軸、x 軸の時間ポスト インキュベーション対ゾウリムシあたりステップ 3.3.1 で計算されたゾウリムシの濃度を使用して、グラフに表す。ゾウリムシの半減期を決定します。
2. 細菌細菌の半減期からの投与と捕食率を決定します。
   注:細菌の量を判断するには、は、ゾウリムシの中の細菌の半減期とゾウリムシのゼブラフィッシュの捕食率を考慮する必要 (3.4 の手順を参照してください)。
   1. ゾウリムシ内細菌の崩壊を決定する次の数式を使用します。
      (1)
      N₀が 2 時間培養後初期ゾウリムシあたりの細菌数は、Nt は時間 t 後、残りの数量、τ はその後細菌数は半減、時間、k は崩壊定数。
   2. 分解実験から細菌の半減期を用いた減衰定数 k を決定する (つまり、実行可能な細菌/ゾウリムシの量が半減すた後時間)。
      (2)
      半減期の決意の言葉と
      (3)または
      (4)
      注:図 1に基づき、ゾウリムシのエシェリヒア属大腸菌の半減期は、約 2.3 時間です。したがって、式 (4)、減衰率、k を使用して、エシェリヒア属大腸菌のためです。
      (5)
   3. 細菌 (Nt) ゼブラフィッシュの幼虫によってとらの用量を見つけるため半減期実験から減衰率 (k) を決定 (P) が捕食率かゾウリムシ時速 1 匹の魚に食べられて数後捕食時間 (t)。
      ( 6)または
      (7)
      注:図 1初期ゾウリムシ (N₀) 2 時間培養 (t) 後あたりの菌量が 790 CFU。ムービー 1と図 2、捕食率 (P) が 1539 です。
   4. これらの値を使用して、式 (7) に代入、次として 2 時間インキュベーション ゼブラフィッシュによって消費される細菌の投与量を計算します。
      (8)

3. ゼブラフィッシュの食品媒介感染症

1. ゾウリムシは細菌を孵化させなさい。
   1. ゾウリムシや大腸菌MG1655 の共培養感染前に夜を準備します。E3 メディア 8 mL、継続的なゾウリムシ文化の 1 mL と大腸菌MG1655 文化の 1 mL を組み合わせる (外径₆₀₀ = 1.0) 1 で再停止されるコート t25 フラスコ培養フラスコに x E3。室温 (RT) でフラスコを一晩インキュベートします。各処理条件のゾウリムシの 2 つのフラスコを準備します。
   2. 細菌の成長媒体を接種する (ポンド: 1 g/L トリプトン 0.5 g/L 酵母エキス、塩化ナトリウム 1 g/L) 細菌の感染株板から個々 の細菌のコロニーを選択することにより使用して滅菌接種ループ。37 ° C で液体培養をインキュベートし、110 回転/分 (rpm) 一晩で揺れを残します。
      注:(研究室コートと手袋) 保護具を着用してください、感染性病原体を取り扱う際、バイオ セーフティ レベル 2 の施設・設備を使用する必要があります。
   3. 次の日、一晩かけて培養の OD₆₀₀を測定します。1 mL の培地 11 で再停止されるときの外径₆₀₀を達成するために必要な文化の量を計算します。
   4. ゾウリムシの 6,000 x gで 5 分、各フラスコ 1 つのボリュームでの遠心分離を介してステップ 3.1.2 からの細菌の量を収穫します。上澄みを廃棄し、E3 メディアの 1 つの mL で細菌のペレットを再懸濁します。
   5. 必要に応じて、あらかじめ蛍光色素を細菌を染色します。
      1. FM 4 64FX 細菌染色 (5 mg/mL 原液) 1 μ L を追加します。カバー退色から保護し、回転オーバー エンド ・常温 15 分間インキュベートする箔管。
      2. 1 で洗浄することにより余分な染料を削除 x E3: 1.5 分間 6,000 × gで遠心分離を介して細菌をペレット、E3 メディアの 1 mL にペレットを再懸濁します。洗浄ステップを 2 回繰り返します。
      3. 6,000 x gで 5 分間破棄で汚された細菌を介して遠心上清を収穫し、E3 メディアの 1 つの mL で細菌のペレットを再懸濁します。
   6. それぞれ新鮮なゾウリムシの 2 つのフラスコの細菌懸濁液の 1 mL を追加します。2 時間室温で孵化させなさい。
      注:ステンド グラスの細菌を扱う場合は、2 h の RT で暗闇の中で孵化させなさい。
2. 洗って細菌/ゾウリムシ培養。
   1. 50 mL の円錐管にゾウリムシ/細菌培養の両方のフラスコの内容を結合します。300 x gで 10 分間の 15 ° c で遠心分離機サンプル遠心分離機はこの工程の前に予冷を確認します。
   2. 血清ピペットを使用して E3 清約 10 mL を削除し、新鮮な 1 の約 10 mL を追加円錐管に x E3。
      注:洗浄の手順をすべての時に、非常に迅速に、上澄みを取り外す際、ゾウリムシがペレットの泳いでいくと重要です。スピン時この段階で十分に速く処理できるように 1 つの管から上清を除去し、上澄みにゾウリムシの損失を防ぐ。
   3. 5 分削除血清ピペットを使用して E3 上澄みの約 10 mL の 15 ° C で 300 × g で遠心分離を介してサンプルをスピンし、新鮮な 1 の約 10 mL を追加し円錐管に x E3。この手順を 2 回繰り返します。
   4. 15 ° C、5 分で 300 × gで遠心分離機サンプルは、ペレットを妨害しないように世話 E3 清約 10 mL を削除します。
   5. E3 メディアの残り 10 mL にペレットを再懸濁し、懸濁液 500 μ L を新しい 1.5 mL 遠心チューブに転送します。ゾウリムシの数をカウントする 5 分間 300 × gで遠心分離によるゾウリムシの 500 μ L をペレットします。
   6. 500 μ L のサンプルから培養上清中の E3 の 400 μ L を削除します。ゾウリムシの残りの 100 μ L に 36.5% ホルムアルデヒド液 20 μ L を追加し、優しく再懸濁し、22 ° C で 5 分間インキュベート
      注:このステップを数えるためにゾウリムシを殺します。
   7. ピペットとレコードを使用して実際の総容積を測定します。ゾウリムシ懸濁液 1:1 v/v で 0.4% トリパン ブルー溶液を希釈します。
   8. ゾウリムシ/mL の死者の数をカウントするのにセル カウンターまたは検定を使用します。
      注:前固定ステップのためほとんどゾウリムシはこの時点で死んでいるだろうが、この数は共同培養実験のための生きているゾウリムシの数を反映します。著者は、これはここに要因として無視できるので細菌の共培養による重要なゾウリムシ死を発見していません。
3. 共同ゾウリムシやゼブラフィッシュの幼虫を孵化させなさい。
   1. ゾウリムシの濃度を計算します。
      
      
      注:この計算は、3.2.5 のステップから 50 mL の円錐管にゾウリムシの濃度を提供します。
   2. E3 の 3 mL の最終巻で 2 x 10⁵ゾウリムシ/mL の濃度に必要な洗浄のゾウリムシのボリュームを計算します。
      注:ゾウリムシの濃度は、最適化される目的の細菌量に基づいて調整できます。
   3. ゼブラフィッシュを (ステップで計算されたゾウリムシの適切な濃度を含む新鮮な E3 の 3 mL の容量に 6 ウェル プレートの各ウェルに 100 mM トリス ph 8.0 を最終濃度 100 MG/L 転送 10 ゼブラフィッシュの tricaine を追加することで麻酔します。3.3.2). 受信者も麻酔から回復できるように、液体の最小限の量で幼虫を転送することを確認します。
   4. 食い物の最適な照明条件を確保するため、日の光条件の下で昼間のインキュベーターで 2 h 30 ° C で孵化させなさい。
   5. 新鮮な E3 のたびに 100 mg/L tricaine を含むに対応する新しいも含む 3 mL に魚を移すことによって、少なくとも 5 回ゼブラフィッシュを洗ってください。
      注:洗浄工程中に、tricaine を省略しないでください。麻酔なしモバイル幼虫を転送する損害と動物に苦痛のリスクが高まります。
   6. 必要に応じて、黒壁 6 ウェル プレートで 1% 低溶解アガロースの 3 mL にゼブラフィッシュを埋め込むことによってイメージング用ゼブラフィッシュを準備: 低溶解アガロースは 1xE3 で作り上げた、電子レンジで加熱します。一度溶融、160 mg/mL の最終的な集中に tricaine を追加します。確実な頭の左右の尾の先端を読み込むクリップされたゲルを用いた顕微鏡下位置魚は右側 (図 3)。設定する、agarose のため 5 分間待機し、1 x E3 含む 160 mg/mL tricaine イメージングのための埋め込まれた魚をオーバーレイします。
4. 捕食率を決定します。
   注:別の実験を捕食率を決定するように設定する必要はありません。むしろ、この行うことができます段階 3.3.4、以下のとおり。
   1. 3.3.4 のステップ中に獲物捕獲の実体顕微鏡とキャプチャ映像の食い物ゼブラフィッシュを表示します。
   2. ビデオ映像をスコアします。獲物捕獲獲物に向かってゼブラフィッシュの顕著な特徴です。これは単なる目安ですが 1 つの獲物捕獲イベントとして各ストライクをカウント (ディスカッションを参照してください)。
   3. それぞれ異なるゼブラフィッシュ幼虫 (図 2) を表す複数のビデオ クリップから 1 時間あたりの獲物捕獲イベント数の平均値を計算します。

ゾウリムシは容易にストレージの液胞に細菌の広い範囲を内部します。細胞内細菌密度菌と共培養だけでなく、使用される細菌種ゾウリムシの密度に依存します。時間をかけて、液胞の酸性し、細菌の劣化はすさまじい。低下の割合は、全供によって決められます。病原性大腸菌、初期の細菌密度は 790 細菌/ゾウリムシ、および細菌は、約 2.3 時間 (図 1) の半減期と分解されます。

図 1: ゾウリムシの細菌の半減期の測定。(A) 次の 2 h 共同培養感染性大腸菌、ゾウリムシは洗浄し、細菌なしメディアに転送します。番号が指定された時点で実行可能なエシェリヒア属大腸菌のセルは、選択寒天培地で希釈めっきを定められました。結果は手段の平均値 ± 標準誤差 (SEM; n = 3)。(B) ゾウリムシを運ぶの典型的なイメージは細菌、明るいフィールド (Bi)、蛍光菌 (Bii) を内面化し、チャンネル (Biii) を合併します。スケール バー = 20 μ m。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。

さらに、捕食率、ゼブラフィッシュは、どのゼブラフィッシュ レート共同培養細菌ロード ゾウリムシを内面化、調べた。それが分かった、30 ° C で発生すると、幼生は加速され、動物表示 4 dpf から捕食動作が、ゼブラフィッシュ稚魚は狩りし、5 の dpf の20日からライブ獲物をキャプチャを開始します。行動20 (図 2 a)、印象的な特性と一緒に伴われる食い物と捕食率の決定は各ストライクが 1 つゾウリムシの内面化につながることを前提に基づいて、これはだけみなすことができるが、近似 (ディスカッションを参照してください)。H (図 2 b) あたり約 1,539 ゼブラフィッシュ幼虫を捕食のここに記述された観測に基づく、ゾウリムシの吸収率です。

図 2: ゼブラフィッシュ捕食率の定量します。(A) 示すゼブラフィッシュ飼育幼虫 (5 dpf) 蛍光細菌を運ぶゾウリムシの捕食捕食ビデオから静止画像。時間 [秒] です。矢印は、殴打の間に動きの主要な軸を示します。捕食率 (時間あたりゾウリムシ摂取量) の (B) の定量化による n = 10 動画完全 2 h 露出時間をかけて撮影します。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。

ゾウリムシの内面化、次、ゼブラフィッシュは効率的に前腸、消化器系に伝染性の細菌を放出で獲物を低下します。ゾウリムシ劣化進む、すぐに前述の本と腸管で食い物の 30 分以内無料細菌を検出できます。細菌を無料し、前腸から半ばと後部の腸に移動、彼らが検出された食い物 (図 3) の初めの後約 1-2 時間。種、線量の範囲に依存する腸内細菌の永続性大腸菌と米由来の場合いくつかの日にいくつかの時間から。上皮 (図 3) に好中球の浸潤につながるいくつかの上皮の侵入 (図 3 D) と、小腸の粘膜を中心に米由来をローカライズします。

図 3: ゼブラフィッシュ細菌の植民地化します。5 dpf でゼブラフィッシュ感染していない (A) を左または mCherry (B)エシェリヒア属大腸菌あるいは (C)米由来の表現で植民地化します。感染実験は、野生型 (AとB) の魚や形質転換線で行われるかもしれない (ライン Tg (MPO::EGFP) 例えば、私114 (C) に示すように緑色の蛍光好中球を表現します。直腸の開口部は、矢印で示されます。(D) 全体マウント組込幼虫サルモネラ感染症に感染しているから腸のセクションの高倍率。(ディ) 青 = ヘキスト (Dii) 紫の核をマーキング マーキング (Diii) 赤 F アクチン ファロイジンを = = サルモネラ (Div) マージ。スケール バー 5 μ m を =。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。

映画 1: 獲物捕獲の映像。このビデオをダウンロードするにはここをクリックしてください。

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