ステンレス高品質レーザーからの RNA の隔離のプロトコルをキャプチャ人間死後小脳 Microdissected プルキンエ細胞

サマリー

このプロトコルは、視覚化し、キャプチャ レーザーマイクロダイ死後人間小脳から新鮮凍結組織におけるプルキンエ細胞を分離する染色無料のアプローチを使用します。このプロトコルの目的は、RNA 配列のため質の高い RNA の十分な量を生成することです。

要約

レーザー キャプチャ レーザーマイクロダイ セクション (LCM) は、細胞診および/または表現型に関連する細胞または異種組織からの領域のコレクションでは、有利なツールです。さまざまな蛋白質のための分子方法でキャプチャされた製品を使用できます DNA または RNA の分離。しかし、死後の人間の脳組織からの RNA の保全は特に挑戦的です。LCM の標準的な可視化技術、組織学的またはさらに免疫組織化学的染色手順 RNA を低下します。したがって、LCM の死後ひと脳組織の RNA の整合性を維持する目的で可視化のためステンレスのプロトコルを設計しました。小脳のプルキンエ細胞は、ステンレスの可視化, その大きさと特徴的な場所のための良い候補です。小脳皮質には、細胞密度、高倍率顕微鏡を識別する良い原型を作るそれらの異なる個別の層があります。プルキンエ細胞は大型ニューロンの小型ニューロンの特性の密度の高い携帯電話ネットワークは、顆粒細胞の層と細胞体の中に疎である分子の層の間に位置しています。このアーキテクチャのためステンレスの可視化の使用は可能です。この表現型を模倣する他の臓器や細胞システムは、適当でしょう。ステンレスのプロトコルはエタノールで新鮮凍結組織を固定し、高倍率光学顕微鏡形態学的可視化改善のためキシレンと脂質を除去する設計されています。このプロトコルは、他の固定方法については考慮しませんし、uv (紫外線) を使用してキャプチャした新鮮凍結組織サンプルは専用-LCM システム。ここでは、断面および後続の RNA 配列の RNA の品質を維持しながら UV LCM のプルキンエ細胞から新鮮な冷凍死後ひと小脳組織との RNA の浄化を修正する完全なプロトコルを提案する.私たちの手でこのプロトコルは染色試薬を必要とせず細胞可視化の例外的なレベルを生成し、転写プロファイリング実験に必要な高い RNA 整合性数字 (≥8) で RNA が得られます。

概要

レーザー キャプチャ レーザーマイクロダイ セクション (LCM) は、その後分子駆動評価の病理組織学的に関連する細胞の分離を可能にする貴重な研究ツールです。これら異種組織標本の病理組織学的および臨床的データとの相関分子生物学的解析の使用は、生物学的研究¹の並進運動の意義を評価する際に必要なステップです。RNA による遺伝子発現データを解析するとき凍結するティッシュ セクションの使用それは RNA の優れた品質のことができますようお勧めと同様数量²を最大化します。それが RNA シーケンス³から意味のあるデータに不可欠な高品質・ RNA 量も確立されています。ただし、最小公倍数の新鮮な冷凍事後組織からの RNA を使用している場合 RNA の劣化は大きな課題が、それが死亡時にすぐに発生してその程度は組織コレクション メソッド^{4,5 に関連するさまざまな要因によって仲介されます。}.さらに、RNA の劣化が悪化する染色技術組織の詳細や細胞の識別を認識する必要がある場合。染色技術、ヘマトキシリン ・ エオシン、ニッスル染色などで専門的な蛍光抗体法および免疫組織化学周囲の間質から細胞の鑑別に有用が RNA を低下し、転写産物発現の変更が示されています。プロファイル⁶。したがって、当研究室では、死後人間の小脳のプルキンエ細胞の LCM 分離後の RNA シーケンスのため RNA を維持するために特別に設計されたステンレス プロトコルを作成しています。

LCM の新鮮凍結するティッシュを処理固定方法は必ず RNA と組織の両方の整合性を影響することができます。ホルマリン固定は形態学的保全のための標準が、架橋する原因かもしれない RNA のフラグメントし RNA 増幅⁷を妨げます。架橋¹を誘発しない凝固定着剤として、エタノールの固定は RNA の隔離のためのより良い代替手段です。組織形態の可視化を高めるためには、キシレンは、最良の選択では、それは組織からの脂質を削除します。しかし、組織が乾燥し、レーザー キャプチャ⁷脆性の原因となる組織断片化になる、lcm、キシレンを利用する場合、制限知られています。キシレンはまた、揮発性の毒素と発煙のフードで正しく処理する必要があります。それにもかかわらず、キシレンは⁸RNA の整合性を維持しながら組織の可視化を高めるために示されています。したがって、我々 のプロトコルは 70% のエタノールの固定のエタノール脱水、キシレン潜伏形態の明快さのために続いて使用中心します。

彼らは、速度、精度、および RNA の品質が異なるに示されている異なったタイプのレーザー ベース レーザーマイクロダイ セクション システムに注意してくださいすることが重要です。赤外線 (IR) レーザーはレーザーマイクロダイ セクションと紫外線 (UV) レーザー マイクロビーム レーザーマイクロダイ セクション システムをキャプチャし、ほぼ同時に登場した⁸小説 LCM プラットフォームは両方でした。IR LCM システムは組織切片上に直接配置透明熱可塑性フィルムを使用して「コンタクト システム」を採用しています、興味のセル選択してフィルムに付着、集光によって IR レーザーから。また、UV LCM システムは「非接触システム」という集光レーザビームを切り取った細胞や組織興味の地域倒立か正立顕微鏡デザインのいずれかを使用して、2 つの現在利用可能な商用プラットフォームの構成に応じて組織が重力に逆らってカタパルト レーザー誘起圧力波による回収装置に取得または組織がそれぞれ、重力によって収集されます。UV LCM システムの重要な利点には、高速細胞捕捉、非接触アプローチと多く小さいレーザー ビーム直径⁹によるより正確な解剖汚染無料コレクションが含まれます。このプロトコルは、UV LCM システム用に設計されました、IR LCM システムでテストされていません。いずれかの UV LCM システム設計におけるコレクション キャップに蓄積細胞、観察の使用を高めるとき顕微鏡で細胞の明快さは適していません、セルはコレクション キャップに入ることになります。したがって、組織の可視化を高めるためには、我々 は液体充填コレクション キャップに対して UV LCM システムで可視の観察として設計されている不透明なコレクション キャップの使用をテストしました。液体蒸発され、顕微鏡で働いている間頻繁に交換する必要があります、液体充填コレクション キャップに挑戦することができます。時間には、キャプチャされた組織はすぐに⁷を溶解する RNA の安定性の重要な要因がようになります。

当研究室は、(ET) 本態性振戦患者の小脳・小脳の関連神経変性疾患の死後神経病理学的変化を研究します。我々 は仮定する私たちをリード ET ケースとプルキンエ細胞の数の減少などのコントロールを区別プルキンエ細胞を中心とした形態学的変化増加樹状回帰とさまざまな軸索の変化を示しているそのプルキンエ細胞の変性は、ET 病態^{10、11,12,13}コアの生物学的機能です。転写プロファイルは細胞退行性変化の基になる分子基盤を探索する多くの神経疾患で使用されています。ただし、脳組織などの異種のサンプルから転写プロファイル効果的低豊富な転写産物の発現をマスクしたり、分子の変更の影響を受ける小集団でのみ発生するの検出を減少させる小脳皮質のプルキンエ細胞などの細胞。例えば、プルキンエ細胞が大幅に劣勢小脳皮質で豊富な顆粒細胞で約 1:3000;したがって、効果的にターゲットへのトランスクリプトームこれらのニューロンの特定の分離が必要です。小脳皮質は、細胞密度とセルのサイズが異なる別個の層で区切られます。この細胞アーキテクチャは、染色試薬の色素添加せず新鮮凍結組織サンプルの可視化に最適です。このプロトコルは、理論的には、同様の特徴的な組織を持つ他の組織型にも適用できる組織。

このプロトコルは、仕事人間死後の小脳プルキンエ細胞の可視化のために特別に設計されました。固定は、赤外線と紫外線の両方 - LCM の目的のための可視化と組織の多くの種類の RNA 保全を染色のため多数のプロトコルが存在します。UV LCM の実験的デザインを考えて、個人はニーズと開始と終了の材料の要件に合わせてプロトコルを調整すべき。ここでは、我々 はトランスクリプトームの高品質 RNA を準備する染色試薬を含む色素を必要とせず死後人間の小脳プルキンエ細胞を可視化するための拡張メソッドを提供するために別の LCM のプロトコルの多くの側面を組み合わせるシーケンス。

プロトコル

このプロトコルで利用される人間のすべてのサンプルは、インフォームド コンセントを得られているし、コロンビア大学とイェール大学で内部審査委員会 (IRB) によって承認されています。

注:このプロトコルの全体取扱指針、厳密な RNA を従う必要があります常に手袋をはめた手が使用、RNase decontaminator ですべての面がきれいに、すべての作業資材、RNA ・ DNA/ヌクレアーゼ フリーという。

1. LCM の開始の前に組織の RNA の整合性をテストします。

注:RNA の品質をテストは、多くの方法で行うことができます。サンプルの代表的な RNA の整合性数 (鈴) を提供するために全体のセクションからの RNA がテストされていることを確認します。

1. 実験的なデザインのパラメーター内に収まる包含のための組織サンプルを慎重に選択します。クリオスタットで切断手順 1.2 に移動します。そうでない場合は、組織を適切に処理し、ステップ 1.11 に移動します。
2. ドライアイスの 2 つのコンテナーを取得します。サイズはサンプルの数によって異なります。
   1. ドライアイスの最初のコンテナー、組織コードが空の場合、ラベル付きの 2 mL 管を配置します。
      注:10 分を凍結する管です。管する必要がそれらに組織を配置する前にフリーズします。そうしないと、組織は、管表面に溶融されます。
   2. ドライアイスの第二の容器で RNA チェックを必要とする-80 ° C のフリーザーからティッシュを置きます。
3. クリオスタットをクリーンアップします。洗浄手順の詳細については、ステップ 4.7 を参照してください。
4. ドライアイスから、組織を除去し、染 RNase かみそりの刃を持つ組織の小さなセクションをカットします。組織は、約 1 cm × 1 cm サイズをする必要があります。
5. クライオスタット「チャック」に最適な切削温度 (10 月) の約 3 mm の高いマウンドの化合物を置き、部分的に凍結することができます。OCT の上にティッシュを入れ、10 月にプッシュしないで、単に上に残りの部分にそれを許可します。
6. 10 月は硬く、一度クライオスタット切削アームとクライオスタット ブレードの前の位置にマウントされた組織とチャックを配置します。
7. 組織までも 30 μ m のセクションでトリミングします。
8. 組織と冷凍 2 mL 管の場所の 300 μ m をカットします。ドライアイスにチューブを配置します。
9. 「チャック」から組織を取り外しドライアイスに離れて配置する準備ができるまで。
10. すべての組織、手順 1.4-1.9.
11. すべてのサンプルが完了したら、RNA 抽出キットを提供 (材料表#15) を使用して RNA を抽出します。詳しいプロトコルは、RNA 抽出キットで提供されます。コレクション チューブ膜と DNase 消化 (材料表#16) にオプションのステップを乾燥する省略可能な手順を含めたすべての命令に従ってください。
12. 品質評価バイオアナライザー¹⁴を介して抽出した RNA の整合性をテストします。

2. LCM をセクショニングを開始する前に準備します。

1. LCM のティッシュの各ラウンドの前にスライド ホルダーをきれいに。一晩乾燥完了を許可する使用する前に一日掃除の手順を実行します。
   注:スライド ホルダーはエタノールでティッシュ セクションの固定およびキシレンの清算用します。
   1. スライド ホルダー洗浄手順: RNase decontaminator ジエチル pyrocarbonate 処理 (DEPC) 水の順ですすいでください。任意のほこりや他の空輸の汚染の回避の RNA、DNA、ヌクレアーゼ自由表面に逆さま一晩乾燥させてください。
      注意:DEPC は非常に有毒と処理および EH & S の有害化学物質の標準的なプロトコルを使用して破棄する必要があります。
2. きれいな RNase と断面のブラシは decontaminator し、一晩乾燥することができます。任意のほこりや他の汚染物質を避けてください。
3. 膜の場所は、室温で 30 分間の紫外線の下でスライドします。さらさないで uv スライドよりも 1-2 日前までに使用をしないでください。これは膜のスライドに組織の結合を向上します。
   注:ステップ 2.3 は、スライドの組織断面 (参照手順 4.4) と同じ日に発生する紫外線治療を可能にするステップ 4 と組み合わせることができます。

3. RNase 自由水と高品質のエタノール固定ソリューションを準備します。

注:すべてのソリューションは、すべての実験、新鮮な調理されます。スライド ホルダーの洗浄手順 1.1 から手順が完了したことを確認します。すべてのソリューションは、スライド ホルダーで用意しています。

1. 1 つのスライド ホルダーに 100% エタノール 30 mL を配置します。
2. RNase、DNase、ヌクレアーゼ フリー水とエタノールで希釈します。1 つの 95% のエタノールの場所 30 mL ホルダーをスライドさせて、氷の上に置きます。
3. RNase、DNase、ヌクレアーゼ フリー水とエタノールで希釈します。70% エタノールで 1 つの場所 30 mL ホルダーをスライドさせて、氷の上に置きます。
4. 2 つの 100% キシレンの場所 30 mL はスライド ホルダーを分離し、#1 と 2 としてラベルを付けます。

4. ティッシュ用クライオスタットを準備します。

1. エタノール溶液および組織のドライアイスとコンテナーの氷のバケツを取得します。
   注意:ドライアイスは非常に寒い、ので保護手袋を使用します。同じコンテナーには、氷やドライアイスを置かないでください。氷とドライアイスの異なる温度は中間温度で一緒に形成する原因になります。
2. クリオスタットに-80 ° C のフリーザーや輸送用ドライアイスの場所から組織を削除します。
3. クライオスタットの設定:
   1. 14 μ m の切片厚を設定します。
   2. 30 μ m 組織量を維持するためにトリムの厚みを設定します。
   3. デュアルチャンバーと試験片の温度を保持しているクリオスタット、チャンバー内温度 (CT) を-18 ° C に設定します。クリオスタット 1 つの設定で、-17 ° c. に温度を設定します。
   4. デュアルチャンバーと試料保持温度クリオスタット、設定オブジェクトの温度 (OT)-16 ° c.
      注:OT も切断できるように CT よりも暖かくする必要があります。組織はまだシュレッダー、OT は-15 ° C に増加することができます。、CT は-18 ° C を増やすことができます。
4. 最適な温度に来るようにすること、少なくとも 20 分用クライオスタットに組織を配置します。
   注:組織が最適な温度でない場合、切削時に細断処理されます。組織に置かないで-20 ° C 夜の前に RNA の整合性を維持するために、氷結晶の形成を防ぐために。できる限り組織にスムーズにカットに最適な温度平衡に必要な時間します。紫外線下でインキュベーションをスライドのオプションの実装は、(手順 1.3 参照) ここで発生します。
5. クリオスタットの温度に降りてくるように、少なくとも 20 分用クライオスタットの「チャック」を配置します。
6. クリオスタットの温度に降りてくるように、少なくとも 20 分用クライオスタットにクリーンなブラシを配置します。
7. クリオスタットをきれい
   1. ステージ上の凍結を防ぐために RNA、DNA、ヌクレアーゼ フリー水で希釈した RNase の decontaminator と 70% のエタノールの 1:1 混合物とステージをクリーンアップします。
   2. ステージに RNase decontaminator とブレード ホルダーの場所新しい使い捨てクライオスタット ブレードをきれい。クリオスタットの温度に来てクライオスタット ブレードの少なくとも 20 分を許可します。
   3. きれいに RNase decontaminator とアンチロール プレート、ステージに取り付けます。クリオスタットの温度に来てアンチロール プレートの少なくとも 20 分を許可します。
      注:アンチロール プレート切削には必要ありませんが、強くお勧めします。アンチロール プレートが利用できない場合、洗浄ブラシは代替として動作します。アンチロール プレートが適切な温度でない場合、組織は溶けるか、切削の際に固執します。

5. 断面組織

1. 断面の組織 (~ 1 cm × 1 cm) の小さな部分をカットします。残りのティッシュをドライアイス/80 ° C のフリーザーに戻ります。
   注:ティッシュ セクションで 〜 95% 小脳プルキンエ細胞があることを確認します。
2. 「チャック」をカバーする 10 月の約 3 mm の高い小山を配置します。まず小さなマウンドがあるまで、ゆっくりと、円形の動きで上にレイヤーを構築します。
3. 10 月は部分的に凍結されているが、中心部のいくつかの液体はまだ、10 月の上にティッシュを置きます。10 月許可 10 月まで完全に凍結の上に坐る組織に組織を深く押さないでください。1-2 分かかります。
4. クライオスタット切削アームに冷凍 10 月を「チャック」と組織を配置します。組織を調整刃の端が揃うようにします。
5. 新しい温度に調整する 15-20 分間切削アームで座っている組織を許可します。
   注:組織の厚さに応じて温度順応時間が必要です。座っている限り、きれいにカットするために必要な組織を許可します。OT と CT 組織温度馴化に支援するために調整します。
6. ブレードに近い組織をゆっくりと移動します。組織に達するとブレード、トリムのプロセスを開始します。トリムの厚みは 30 μ m に設定する必要があります。
7. 皮質層が表示されるまでに 2-3 x をトリムします。
8. 置き、クライオスタット刃の真上アンチロール プレートを配置します。
   注:銀線は、ブレードとアンチロール プレートの界面クライオスタットで光から表示されます。アンチロール プレートがブレードのエッジの上を示します。
9. 開始 14 μ m の部分をカットします。正しくカット セクションは、アンチロール プレート下平らになります。
   注:組織が詰まっている場合は、アンチロール プレートが十分に寒いことを確認します。急速に (側舞台に触れていない) が外側に氷のドライの作品を配置する必要場合は、アンチロール プレートを冷やします。
10. 4-6 節を切り取ってクライオスタット ステージ間で水平方向に揃えること。
11. 同時に、組織のすべての部分を拾うスライドを釣りします。
    注:ブラシを使用すると、ピックアップ時にスライドより容易に利用できるように組織の両端を持ち上げます。一度に 1 つのセクションを持ち上げないでください。室温の空気への暴露は、RNA の整合性が低下します。
    注意:クリオスタットのステージに触れる膜をてはいけないです。ステージを膜に接触した場合は、スライド ガラスからデタッチするが開始され、LCM をしようとしたときにエラーが発生します。
12. すぐにステップ 6 に移動します。固定を遅延しないでください。

6. 組織/汚れのない可視化を修正

1. すぐにエタノール固定プロトコルに移動します。
2. 2 分の 70% エタノールでスライド ホルダーにスライドを配置-氷の上。
3. 45 の 95% エタノールでスライド ホルダーにスライドを配置 s-氷の上。
4. 2 分間 100% エタノールでスライド ホルダーにスライドを配置-室温
5. キシレン 1 でスライド ホルダーに 3 回スライドを浸し、室温
6. 5 分の 2 キシレンでスライド ホルダーにスライドを配置-室温
7. 少なくとも 30 分より長い乾燥時間は 60 分まで、最適な清潔に乾燥できるようにします。
   注意:ヒューム フードの乾燥にスライドに します。キシレンが揮発性です。産卵スライド フラットが暗くなる組織は、組織のセクションでプールにキシレンを発生します。

7. オプション-スライドの記憶

1. 7 日前までの個々 の 50 mL の管 (チューブあたり 1 つのスライド) と-80 ° C のフリーザーの場所で乾燥したスライドを配置します。
   注:スライドは-80 ° C のフリーザーに配置する前に乾燥する必要があります。微粒子が組織と膜に埋め込むチューブ内の乾燥剤は使用しないでください。チューブ キャップを確実にタイトです。ない場合は、使用するため解凍時スライドで結露が発生します。
   注意:RNA の整合性は 7 日後減少するように組織の可視化の品質。

8. 融解用スライドを保存

1. -80 ° C のフリーザー使用目的の前に 1 h から単一のスライド管を削除します。
2. チューブすぐに開かない。部屋の温度に来るチューブを許可します。だけのチューブの外側に結露が発生します。
3. 管、室温に来るし、すべての結露がなくなっている (約 30-40 分) はキャップをはずし、常温空気にスライドを公開します。
4. 15-20 分キャップとチューブ内スライドが削除されたまま部屋の温度に順応するためにスライドを許可します。
   注:スライドは、LCM の準備が整いました。

9. レーザー キャプチャはプルキンエ細胞のレーザーマイクロダイ セクション:

注:プロトコルのこのセクションはのみ後続の RNA シーケンスのプルキンエ細胞をキャプチャに関連する詳細を説明します。このセクションでは、ユーザーが UV レーザー キャプチャ顕微鏡および関連ソフトウェアに精通していることを前提としています。

1. きれいな顕微鏡ステージとキャップ コレクション RNase decontaminator との腕します。
2. 手袋をはめた手でコレクション腕に顕微鏡のスライドと 500 μ L 不透明キャップを置きます。
   注:常に RNase decontaminator で作業領域を洗浄により適切な RNA 技術を確保し、スライドまたは不透明なキャップに触れる中で、手袋をはめた手を使用します。手袋は、スライドとキャップは、場所とレーザーのキャプチャを開始した後に削除できます。
3. 低倍率でキャップが目の部分で視覚化される全体の区域をカバーすることを確認して、小脳組織に不透明なキャップを合わせます。
   注:顕微鏡の目の部分だけがかどうか不透明キャップは中央に表示されます。キャップは組織の中央にかどうか、このカメラは表示されません。レーザー キャプチャ範囲の設計によって不透明なキャップを可視化にある目の部分のみまたはアイピースとカメラの両方で可視化しました。
4. 5 倍 - 10 倍の対物レンズと小脳のレイヤーを視覚化して、分子層と顆粒細胞層 (プルキンエ細胞層) が交差する部分にカーソルを配置します。
5. 40 X に移動し、プルキンエ細胞を可視化します。
   注:ビジュアル化の例では、図 1と図 2を参照してください。
6. プルキンエ細胞のキャプチャを開始します。
   注:少なくとも 5 RNA 塩基配列解読を実行する RNA の ng が必要。約 1600-2000年プルキンエ細胞の配列のため十分な RNA の材料の結果します。RNA は顕微鏡で 8 h までの安定になります。UV エネルギーとコレクション レベルが正しいことを確認する前に UV フォーカスをテストします。時間をかけて、ティッシュが乾く続けます、紫外線のエネルギーと UV のフォーカスを変更する必要があります。

10. RNA コレクション ポスト LCM

1. セル換散バッファーを準備 (たび新鮮な準備)
   1. 2-メルカプトエタノールで 1: 100 の換散バッファーで希釈 (10 μL:1 mL、それぞれ)。(RLT) 換散バッファーは、材料表(#14 や 15) で提供されます。
2. 不透明なキャップ、キャップ上向きにセル換散バッファーの 50 μ L を追加します。慎重にチューブをキャップを閉じます。
3. 逆さまに 1 分の管を残します。
4. 渦 30 管の管の底に換散バッファーをすぐにスピン。
5. チューブを再度開き、10.2-10.4 の手順を繰り返します。
6. すべてのサンプルが完成し、RNA の抽出 (材料表#14) の準備ができてまで、-80 ° C のフリーザーからの RNA そして換散バッファーの 100 μ L を含む管を配置します。

結果

このプロトコルは、UV LCM の新鮮な冷凍死後人間の脳組織を準備するための手順を説明します。徹底した仕様と注釈は、精度の高い、新鮮な冷凍脳組織をカットすることは困難することができますクライオスタット切断するため与えられています。考慮すべき最も重要な点は新鮮凍結するティッシュが非常に寒いし、かなりのクライオスタットの暖かい温度に順応するまで時間が必要です。この手順を急がせることができない、どのようにセントラルこの手順は、このプロトコルの成否で誇張できません。組織は、クリオスタットでは適切に準備されませんが、細胞または関心領域を識別するのすべてのそれに続く試みは不可能ではない場合、非常に困難になります。

クライオスタット切片と割り当てられた乾燥時間、組織が LCM の準備ができて。顕微鏡下で組織を視覚化するとき小脳の細胞の層は 5 倍と 10 倍の対物レンズで簡単に表示されます。キシレン (図 1

ディスカッション

ここで提示されたプロトコルは特に UV LCM の形態的に異なる組織の可視化にステンレスのアプローチに変更されます。このメソッドは、組織の可視化の強化されたレベルを維持しながら、その後直接 RNA 配列の RNA の整合性を最大化するために設計されています。ヒト組織の¹⁵の異なる分子プロファイルを理解するためのキャプチャ、可能であれば、セルの純粋な人口を作成する異なったセルタイプを区別する能力が欠かせません。このプロトコルのコンテキスト内で組織の選択が最優先、抗原の使用としてまたは染料特定試薬は使用されません、したがってこのような分化を必要とする研究に適したはありません。これは、このプロトコルの制限は、結果組織の可視化と RNA 整合性はかなり優れているし、他の実験的デザインの関連性を維持します。また利用する代替染色法具体的の UV ・ IR-LCM 維持する RNA を意図して他の多くのプロトコルが存在します。しかし、他のほとんどのメソッドの少なくとも 1 つ汚すか、または抗原特定試薬^6,

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
MembraneSlide NF 1.0 PEN	Zeiss	415190-9081-000	組織用メンブレンスライド。スライドガラスの使用はお勧めしません。
AdhesiveCap 500 Opaque	Zeiss	415190-9201-000	不透明なキャップは、倒立スコープの視覚化を強化するために使用されます
RNase Away	Molecular BioProducts	7005-11	他のRNase除染製品も適しています。作業前にすべての表面を清掃するために使用します。
200 Proof Ethanol	Decon Laboratories	2701	代替エタノールを使用する場合は、高品質を確保してください。組織固定に必須です。
キシレン(認定ACS)	フィッシャーサイエンティフィック	X5P-1GAL	代替キシレンを使用する場合は、高品質を確保してください。組織の可視化に必須です。
UltraPure Distilled Water	Invitrogen	10977-015	その他のRNA/DNA/ヌクレアーゼフリーウォーターも適しています。エタノール希釈でのみ使用されます。
スライドフィックススライドジャー	エバーグリーン	240-5440-G8K	どんなスライドホルダー/ジャーも適しています。使用前に清掃する必要があります。セクショニング後の固定に使用されます。
アンチロールプレート、Assy. 70 mm 100 μm	ライカバイオシステムズ	14041933980	アンチロールプレートの種類は、クライオスタットの種類とステージ上の取り付け位置によって決まります。すべてのクライオスタットには異なる要件があります。
ジエチルピロカーボネート (DEPC)	Sigma Aldrich	D5758-50mL	DEPC は、どのベンダーからでもかまいません。水処理の指示に従ってください。
キムワイプ	フィッシャーサイエンティフィック	06-666A	キムワイプは、どのベンダーからでも注文でき、どのサイズでも使用できます。キムワイプは、顕微鏡やクライオスタットの洗浄に使用します。
ティッシュプラス O.C.T. コンパウンド	フィッシャーサイエンティフィック	23-730-571	OCTのどのブランドでも構いません。OCTには組織が埋め込まれません。「チャック」に組織を取り付ける
Edge-Rite Low-Profile Microtome Blade Thermo	Scientific	4280L	ブレードの種類は、クライオスタットの種類によって決定されます。すべてのクライオスタットには異なる要件があります。
ライカマイクロシステムズ 3P 25 + 30MM クライオスタットチャック	フィッシャーサイエンティフィック	NC0558768	チャックのタイプは、クライオスタットのタイプによって決まります。すべてのクライオスタットには異なる要件があります。どちらのサイズも適切です。
RNeasy マイクロキット (50)	Qiagen	74004	LCM後のRNA抽出に必要です。不透明なキャップから捕捉された細胞を収集するために不可欠なRLT溶解バッファー。
RNeasy Mini Kit (50)	Qiagen	74104	片調製のRNA抽出に必要で、LCMの前に開始組織のRNA完全性を試験するために実施されます。
RNaseフリーDNaseセット	Qiagen	79254	DNaseは、純粋なRNA集団を可能にするために任意のDNAを除去します。Dnaseが新鮮であることを確認してください。
2-メルカプトエタノール	Sigma Aldrich	M6250-100ML	購入量はユーザーの判断で。細胞溶解のためのRLTバッファーへの添加に必要です。RNase活性を防ぎます。
グローブ・サイエンティフィック Lot Certified Graduated Microcentrifuge Tube (2 mL)	Fisher Scientific	22-010-092	RNaseフリー、DNaseフリー、ヒトDNAフリー、パイロジェンフリーの2 mLチューブなら何でもOK