方法論記事

一般的なセットの全皮質のシェットランドシープドッグ配列の慢性注入

DOI：

10.3791/58980

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2019年2月1日

 ,  ,  , 
1Laboratory for Molecular Analysis of Higher Brain Function, RIKEN Center for Brain Science, 2Laboratory for Marmoset Neural Architecture, RIKEN Center for Brain Science, 3Department of Physiology, Keio University School of Medicine, 4Department of Ultrastructural Research, National Center of Neurology and Psychiatry

この記事について

サマリー

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

コモンマーモ継続的に、一時的な後頭極、前頭極からの皮質のほぼ全体の外側面をカバーするため全体皮質シェットランドシープドッグ アレイを開発しました。このプロトコルでは、マーモセット脳の硬膜外腔の配列の慢性注入手順を説明します。

要約

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下角 (ECoG) は、高時空間解像度の大脳皮質から電場電位を監視できます。薄型で柔軟な ECoG 電極の最近の開発は、大規模な皮質活動の安定した録音の伝導を可能にしました。共通のマーモセットの全体皮質皮質アレイを開発しました。配列は継続的に、一時的な後頭極、前頭極からの大脳皮質半球のほぼ全体の外側面をカバーし、ワンショットで全皮質の神経活動をキャプチャします。このプロトコルでは、マーモセット脳の硬膜外腔の配列の慢性注入手順を説明します。マーモセットは、ECoG 録音、1 つはヒトとマカク、頭骨、頭頂部, と側頭部のコンプレックスの解剖学的構造の相同の組織に関して 2 つの利点を持っています。その他の利点は、マーモセット脳が lissencephalic れ、複合体は、脳の表面にさらされている ECoG とニホンザルのアクセスが難しく、数が多いです。これらの機能は、脳の表面の下にほとんどの皮質への直接アクセスを許可します。このシステムは、グローバル皮質情報サブミリ順序時間と空間におけるミリ波順序で高解像度で処理を調査する機会を提供します。

概要

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認知では、広範な脳ネットワーク、特にヒトでよく発達し高い認知行動に関与すると考えられている大脳皮質ニューロン集団の調整が必要です。ただし、新皮質がこの認知行動をどのように達成するのかは、神経科学分野における未解決問題です。薄型で柔軟なシェットランドシープドッグ (ECoG) 電極の最近の開発は、大規模な皮質活動1から安定した録音の伝導できます。藤井と同僚は、ニホンザル サル2,3全皮質皮質配列を開発しました。配列は継続的に時間と前頭極に後頭極から、ほぼ全体外側皮質をカバーし、ワンショットで全皮質の神経活動をキャプチャします。我々 はさらにコモン マーモセット4、5のアプリケーション、遺伝可6、7の小さな、新しい世界猿のシステムを開発しました。この動物は、他の種に比べていくつかの利点を持っています。視覚、聴覚、体性感覚、運動、そしてこの種の前頭皮質以前マップされ、ヒトとマカクザル8,9,の同じ領域に基本的な同種組織を有することが報告10,11,12,13,14,15,16. 自分の脳は滑らかであり、最も外側の皮質は ECoG macaques、マカク属のアクセス困難である大脳皮質の表面にさらされています。これらの機能に基づき、マーモセットは、シェットランドシープドッグ研究に適しています。さらに、マーモセットは社会的行動を展示し、人間の社会的行動17の候補モデルとして提案されています。

このプロトコルでは、コモンマーモ セットで皮質全体の外側面上 ECoG 配列の硬膜外注入手順について説明します。霊長類大脳皮質神経、感覚、運動などの大規模な皮質活動を監視する機会を提供しています高い認知・社会のドメイン。

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プロトコル

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コモンマーモ セット 6 で行われたこのプロトコル (男性 4、女性 2; 体重 = 320 470 g; 年齢 = 14 53 ヶ月)。すべてのプロシージャは、ケアと実験動物の使用のための国家機関の健康の指針の推奨事項に基づいて行われました。理化学研究所倫理委員会 (第号で承認されたプロトコルH28-2-221(3))。すべての手術は、麻酔下で行った、すべての努力の不快感だけでなく、使用される動物の数を最小限に抑えるために行われました。

1. 準備

  1. それぞれの個々 の脳の構造の磁気共鳴画像 (MRI) を取得します。これは、マーモセットの脳アトラスとコンピューター断層撮影 (CT) で登録を介して電極の位置を識別するために使用されます。
  2. ECoG 配列の作製: カスタマイズされたマルチ チャンネル ECoG アレイ (図 1 a) を準備します。96ch ECoG 配列は、32 と 64 の電極を 2 つのシートで構成されます。脳の大きさの個人差に合わせて、ECoG 配列はフレキシブル アームです。腕は、個々 の脳の形状に応じて、時間のポールをカバーできます。ECoG 電極と同じ方向を向いて地面電極と反対に直面して参照電極を配置します。
    1. ECoG 配列コネクタ ケース (図 1 b) を行い、手術中に液体の流入を防ぐためにアクリル系接着剤を使用してコネクタ (図 1) のギャップをシールします。酸化エチレンガスの配列を滅菌します。
  3. 準備し、器具を滅菌します。
    注:すべての器械使用は、材料表に表示されます。

2. ECoG 配列の注入

注:食べ物や手術前に 4 h より大きい液体の摂取を撤回します。滅菌手袋と楽器を使用して無菌のすべての手術の手順を実行します。

  1. 前のインプラント
    1. アトロピン (0.08 mg/kg) を筋肉内投与後 5 分ケタミン (15 mg/kg) の筋肉 (筋肉) 注射によってマーモセットの麻酔を誘導します。
    2. 麻酔し、イソフルラン (1-3% 希釈酸素/窒素酸化物の混合物) を使用して麻酔を維持、動物の生理学的状態に応じてを継続的に監視してください。その心拍数が 130 180 BPM とモニターの体温、動脈血酸素飽和度 (SpO2) 継続的に動物の状態を判断するようにします。
    3. バリカンと脱毛剤の動物の頭の上を剃る。完全に湿らせたガーゼで肌から髪除去クリームをすすぐなったり、肌のダメージ。
    4. 抗生物質を管理 (セフォベシン; 16 mg/kg 皮下)、降圧 (フロセミド; イオ ミン 2.0 mg/kg) と抗出血 (カルバゾクロムスルホン酸ナトリウム水和物; イオ ミン 0.2 mg/kg)。
    5. 脳定位固定装置のフレームに動物を配置します。この時、耳バーおよび乾燥や術後の痛みを防ぐために目に眼軟膏を 2% リドカイン ゼリーを適用します。
    6. ヨード溶液による外科的領域を消毒し、滅菌ドレープでそれをカバーします。2% リドカイン ゼリーを皮膚切開の場所に適用されます。
  2. 注入の手順
    1. メスでは、頭皮の正中線から約 4 cm の皮膚を切開します。外科領域のすべてが公開されるまでは、キューレットで頭蓋骨から側頭筋をデタッチします。頭蓋骨表面の組織を一掃し、必要に応じて圧止血と骨ワックス、完全に出血を止めます。皮膚や筋肉を湿らせたガーゼの端を折り返します。手術中に湿らせたガーゼをしてください。
    2. 前頭極のエッジ上に配列の正面の端に配置します。滅菌鉛筆で開頭手術、スリット、頭蓋骨の穴に計画された領域をマークします。開頭の位置は、配列 (図 2) の設計に依存します。
    3. 図 2に示すように、マーク 1、に沿って開頭をドリルします。骨を掘削しながら、外科医のためクリアな視界を維持するために最先端の空気を吹き飛ばします。次に、骨の部分はまだセンターで硬膜に付けられるように骨マーク 2、周りのすべての方法をカットします。1 つの端から、ゆっくり作品を持ち上げ、ヘラで硬膜をはがします。ゆっくりと慎重に、このプロセスを実施する必要があります。 またはそれは簡単に硬膜を引き裂きます。
      1. 骨の部分から骨のヒントを削除し、配列を撫で下ろしたこの作品は返却、湿らせたガーゼでワンピースをラップします。
    4. 3 と 4 は図 2に示すように、開頭手術を行います。これらはそれぞれ眼窩前頭と後頭領域に電極を挿入できます。
    5. マーク 5の図 2に示すようにスリットをドリルします。これらのスリットは、それが正しく挿入されていることを確認する配列の検討を許可します。
    6. 硬膜を公開します。生理食塩水との区域を洗浄し、必要に応じて圧止血とゼラチン スポンジで出血を止めます。オープンの開頭手術のエッジはキューレットまたは骨の rongeur で洗浄する必要があります。
    7. 参照電極が配置されに (図 2の 6 をマーク) スリットを作る。コントラ水平感覚および後頭葉領域の硬膜外腔に参照電極を配置します。位置特定実験ニーズに応じて決定してください。
    8. ドリル 1.0 mm ネジ (図 2の十字) を持つコネクタの各茎の周り 4 点ネジ穴。硬膜問題に損傷を防ぐため、頭蓋骨の下のへらを挿入します。これらの穴は、頭蓋骨に対して直交する必要があります。その後、頭蓋骨にコネクタを固定するアンカーとしてピーク ネジ (1.4 x 2.5 mm) をインストールします。
    9. ECoG 配列を硬膜外腔に挿入します。使用マイナス鉗子配列を保持します。
      注:配列は、曲げなし挿入する必要があります。配列が曲がっている場合は、頭蓋骨と硬膜の間のヘラを挿入することによって適切なスペースを作成します。脳の比較的小さなサイズが原因で曲げ場合、は、電極の一部を遮断します。
    10. 歯科アクリルで参照および地上の電極を固定します。脳の表面の硬膜外腔に参照電極と接地電極を配置します。連絡先の両方は、頭蓋骨を直面する必要があります。
    11. 骨の部分を戻すし、歯科アクリル ネジで頭蓋骨にコネクタとヘッドの記事を修正します。
    12. 額と後頭部、6-0 ナイロンと皮膚を縫合し、皮膚クロージャを使用してコネクタの両側に皮膚を修正します。
  3. ポスト注入の手順
    1. 脳定位固定装置のフレームから動物を削除します。動物は以下の手順の中に、暖かいと酸素とに保持されているを確認します。
    2. 手術後すぐに術後の痛みを軽減するメロキシカム (イオ ミン 0.3 mg/kg) と動物を注入します。抗炎症ステロイド剤 (デキサメタゾン; イオ ミン 2.0 mg/kg) および (リンゲル液; 5.0 mL)、皮下輸液の管理、gastroprotectant としてファモチジン (0.5 mg/kg) を含みます。
      注: ステロイドと NSAIDs の併用胃腸副作用の可能性があります。
    3. 動物が回復後 (心拍数と SpO2 の確認)、バイタル サインの監視を削除し、2-3 日間 ICU に動物を転送します。

3. 術後の治療

注:通常、手術から完全に回復する動物のため 5 日間かかります。

  1. 脳腫脹を防ぐためには、手術後の最初の日に 1 日 2 回の抗炎症ステロイド剤デキサメタゾン (2.0 mg/kg) を管理します。その後、1.5 mg/kg 2 番目と 3 番目の日に 1 日 2 回、1 mg/kg 1 日 2 回 4 日目に投与量を減らします。
  2. 痛みの軽減 (メロキシカム; 0.1 mg/kg 経口 1 日 1 回) と、抗出血性を管理 (carbazochrome ナトリウム スルホネート水和物; イオ ミン 0.2 mg/kg 1 日 2 回) 手術後 5 日間。
    注:私たちのケースで、手術後 1-2 日いくつかのマーモセット (3 のうち 6) 少ないアクティブとなった吐いた。これは、血栓による頭蓋内圧亢進によって引き起こされた可能性が。マーモセットは、これらの症状を示し、我々 は頭を再開、全身麻酔 (alfaxalone) 血栓を削除されます。着床 ECoG 配列の曲げがない場合、アレイ間と骨片が返されたスペースで血の塊がみに。この場合、血の塊は、離れて実行することによって生理食塩水、カテーテルを用いた空間に洗浄できます。この手順は、通常、動物の回復につながります。
  3. 電極位置の同定
    1. 手術後、約 1 週間は、動物の頭部のコンピューター断層撮影 (CT) スキャンを実行します。
      注:これは、信号を正しく記録できるかどうかを確認する良い機会です。コネクタ ケースを開き、彼らが存在する場合、任意の血栓を削除します。
    2. AFNI ソフトウェア18 (https://afni.nimh.nih.gov) (図 3 a) を用いた定位座標に T2 強調 MRI を合わせます。AFNI (図 3 b) と解剖学的磁気共鳴の T2 強調画像に CT 画像を合わせます。AFNI とアリ19マーモセットの脳アトラスの MRI (図 3) に登録します。

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結果

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全体皮質皮質配列は、半球の全体からの神経細胞の活動を同時にキャプチャできます。図 4は、目を覚ましマーモセット複数の聴覚領域から聴覚誘発電位 (刺激) の例を示します。ECoG の録音は、受動的な聴取条件で行われました。各セットから成っていたランダム化された純粋なトーン周波数の 20 種類の聴覚刺激にさらされました。その後、トーンの初動に揃えて配置されますを平均することによって刺激を計算しました。異なる波形観察されたより低いからと高い聴覚領域、ECoG 配列の空間分解能が異なる皮質で処理別の情報をキャプチャできることを示す。

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図 1: ECoG 配列の準備。(A...

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ディスカッション

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成功した注入の前に、手術後に十分な栄養動物を提供されなければなりません。短時間も動物の回復を最適化するために重要です。準備手術する前に、少なくとも 1 日を終了する必要があります。営業時間を減らすためには、他の実験のために終了した動物に電極配列挿入以前の開頭術トレーニングをお勧めします。表 1は、このプロトコルの時間のコースの例を示します。

ケースバイ ケースに基づいて麻酔の手順と術後治療を変更しました。プロトコルではこのビデオ、動物は麻酔をかけられました、イソフルランと気管挿管を通じて提供される酸素の混合物を使用して維持されます。セボフルラン、イソフルランを置き換えることができ、気管挿管は、マスクと置き換えることができます。他のケースでは、ケタミン、メデトミジンの混合物の筋肉内注射と動物を麻酔しました。この場合、動物いた最初とブトルファノール (0.2 mg/kg イオ ミン)、鎮静、麻酔のケタミン (イオ ミン 30 mg/kg) およびメデトミジン (イオ ミン 0.35 mg/kg) の混合物で達成されました。

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開示事項

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MK は彼女はこのプロトコル (品番 2018-210975) で使用している全皮質の ECoG 配列に特許申請中。

謝辞

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我々 は動物のケア、トレーニング、および目がさめている録音を提供を百合篠本をありがちましょう。ECoG の配列は、Cir ハイテク (www.cir-tech.co.jp) によって製造されました。さらに、英語編集 Editage (www.editage.jp) に感謝したいと思います。この作品は、疾患研究 (脳/心)、医学研究開発 (アメッド) (JP18dm0207001) の小説科学イニシアティブ (センターの脳科学プロジェクト研究機構統合 Neurotechnologies によって脳のマッピングによって支えられました。CNSI)、国立衛生研究所日本学術振興会 (JSPS)、自然科学研究機構) (BS291004、m. k.) の科研費 (JP17H06034、m. k.)。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
ビーカー (100 cc)Outocrave
コットンボールOutocrave
吸収三角形Fine Science Tools Inc.18105-03Outocrave
コットンスワブ(先端の細いクリーンクロス株式会社HUBY340 BB-013Outocrave
ガーゼOutocrave
タオル鉗子Outocrave
メスハンドルOutocrave
ニードルホルダーOutocrave
アイリスハサミOutocrave
マイクロ蚊鉗子Outocrave
Adson、1x2歯Outocrave
骨キュレットOutocrave
マイクロスパチュラファインサイエンスツール株式会社10091-12Outocrave
ニードルホルダー、12.5 cm、湾曲した滑らかな顎World Precision Instruments14132Outocrave
血管拡張器、12 cm、0.1 mm チップFine Science Tools Inc.18131-12Outocrave
血管拡張器、12 cm、0.2 mm チップFine Science Tools Inc.18132-12Outocrave
Fine-tiped rongeurサイエンスツール株式会社16221-14Outocrave
脳定位固定装置マ
ニピュレーターガス滅菌
コネクタガス滅菌
歯科用アクリルガス滅菌
シリコンカップ hlderガス滅菌
絵筆ガス殺菌
ペンシルガス殺菌
マイクロスクリュー 1.4mm×2.0mm日本化学スクリューPEEK/MPH-M1.4-L2ガス滅菌
マイクロスクリューガス滅菌
ドリルガス滅菌
ステンレス鋼バリ、1.4 mmガス滅菌
ステンレス鋼バリ、1.0 mmガス滅菌
ドリルビット、1.2 mmガス滅菌
ゴム製送風機ガス滅菌
) ファインフレームのマニピュレーター 用ガス滅菌レンチ 用手作り固定具 用シリコンカップ 用ドライバー のマイクロモーターハンドピース

参考文献

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