体外養殖人間の腸内細菌を研究する技術を適用する高度な

サマリー

ここでは、胃腸管の生理的条件をシミュレートするバイオリアクターの一連を使用して体外のコロン,の腸内細菌を培養するためのプロトコルを提案する.

要約

人間の腸内細菌は、人間の健康と病気の両方で重要な役割を果たしています。生体内でモデルを用いた腸内微生物叢を勉強して、その複雑な自然や多様な哺乳類のコンポーネントのために困難です。このプロトコルの目的は、in vitro における腸内細菌叢ダイナミクスの研究は、哺乳類の環境の貢献を考慮することがなく、感情的な microbiota の文化です。体外培養技術を使用して、pH、温度、嫌気、通過時間などのパラメーターを含む胃腸管の生理的条件はシミュレートされます。結腸の腸の表面は粘液コーティング キャリアを追加する、粘膜のフェーズを作成、さらに次元を追加することでシミュレートされます。腸内細菌は人間の糞便材料の接種によって導入されました。異なる縦方向 (昇順、横断および下向きコロン) で濃縮され特定微生物細菌のこの複雑な混合物で接種時に、in vitro のモデルの横 (内腔と粘膜) 環境。コミュニティと生成される代謝物の安定したまま安定した状態に到達するためのシステムを許可することが重要です。本稿では実験の結果は、接種の腸内細菌叢のコミュニティが時間をかけて安定した社会に開発する方法を示します。定常状態が達成されればシステムは細菌の相互作用およびコミュニティ機能を分析したり、腸内細菌、食品、食品成分、医薬品などの任意の添加物の効果をテストするために使用できます。

概要

腸内細菌は、人間の消化管 (GIT の) 内に存在する微生物のコミュニティです。 このコミュニティでは、コロン、コロン環境^1,2との共生に住んでいる 500 1,000 種から、10 の¹³-10¹⁴細菌を保持するために推定される最大濃度に達する。組成と腸内細菌の機能は遠位^2,3,4、5が見つかりましたほとんどの多様性と地域の特定のコミュニティを形成、GIT に沿った空間的変更します。解剖学的地域ごとに別々 の微生物群集は内腔の粘膜内層⁶を存在します。ルーメン コミュニティは、基板を通過内腔コンパートメント⁷栄養素を直接アクセス。それにもかかわらず、いくつかの細菌は、優先的にエネルギー ソース^1,5,8としてコロンの細胞によって生成される粘液を利用した粘液層に存在します。内腔と粘膜の段階の微小の違いは、発散と相の特定のコミュニティの開発の結果します。栄養代謝やビタミンの生産などの代謝機能と免疫機能、人間の病原体^1,3,の植民地化を防止するなど、一緒にこれらのコミュニティを提供します。⁹. 腸内細菌はまた、人間のコロンの細胞³との抱合の機能的動作します。

人間の GIT の重要な部分としては腸内細菌が両方ホスト健康と病気の状態^{3,9,10、11,12}に貢献する知られている驚くべきとしてます。腸内微生物群集の変化は GIT 腸腸疾患 (IBD) と腸腸症候群 (IBS) も自閉症、循環器疾患、肥満などの他の疾患のような疾患を含む複数の人間の病気に関連付けられています。^3,9,10,11,12. 代謝物の腸内細菌は腸^12,13から離れた位置に達するグローバルな効果を持っています。たとえば、腸と脳のつながりは¹⁴不安や抑うつなどの精神障害に関連付けられます。したがって、腸内細菌の研究は重要な研究では、複数のフィールドに、であっても、GIT にはしばしば関連付けられている多くの病気に適用されます。

腸内細菌の研究が重要であることは広く認識されて、それは複雑な試みです。複数の動物モデルが猿と豚の^15-19のような大きなものにゼブラフィッシュ, ラットおよびマウスのような小動物から、利用可能です。ただし、これらの動物は、ユニークな細菌に基づいて、コミュニティに進化している環境と食事を持っているので、人間の腸内微生物叢の面でこれらの動物のアプリケーションは簡単ではないと彼らは解剖学的人間²⁰とは区別されます。^,21. 被験者の使用の妥当性の問題が削除されますまだ課題の別のセットが導入されています。人間研究、高価な時間のかかるで、倫理的制約付き¹¹です。また、交絡因子年齢や発達段階、環境、ダイエット、薬、および遺伝的要因^2,4,22を含む人間の研究で腸内細菌に影響を与えます。 また、何が人間でテストできます、サンプルの種類は、⁴回で収穫できる制限があります。

体内システムを使用しての腸内細菌を研究する 1 つの重要な欠点は、哺乳類のコンポーネントの存在です。腸内細菌とヒトの細胞は、相互に対話し、は生体内で設定、それは 2 つを区別することは。腸内細菌によって生成される代謝産物は、測定精度と計算できないので大腸細胞によってで撮影されます。したがって、任意の機構論的研究はエンドポイント測定¹¹に限定される必要があります。生体内での研究のもう一つの主要な欠点は縦 GIT のさまざまな地域からのサンプルを収穫できない²³。これは時間¹²大腸の微小で生じる変化の評価はできません。 多く生体内での研究、人間の研究などは、糞便の腸内細菌叢¹²への変更を検出するための解析に依存します。これは有益ではない、それは GIT にわたって腸内細菌に関するデータを提供せず、内腔と粘膜のコミュニティ^5,6,7、8を区別しません。

腸内細菌で、哺乳類のコンポーネントからの干渉なしの細菌群集の動態を研究するための in vitro法の適用が必要です。タイトな制御環境条件¹⁰、同時に、複数のパラメーターのテストと縦、サンプリング能力および大量¹¹体外メソッドを使用できます。機械装置とホストではなく、in vitro 法を使いこなしますので、年齢、環境、食事、遺伝的背景を考慮事項は必要ありません。これらのシステムはどちらか全体の腸内細菌叢のコミュニティをテストするため、生物、または単一の菌株を選択したのみ。重要なは、生体外で結果が再現可能なまだ体内研究^11,22に匹敵する多様性のレベルを保持します。

問題の仮説および目的の結果に応じて私n vitro研究はさまざまな方法で実行できます。 彼らは、単一容器系と糞便ホモジネート²⁴サンプルをインキュベート 24-48 h²⁵のコース上単一のバッチ文化の実行など、簡単な方法を利用できます。単一容器システムと安定した腸内微生物群集¹¹を生成するケモスタット システムを使用するなどのより複雑な方法を使用して行うこともできます。ただし、単一リアクターの使用過剰簡略化できます叢¹²コロンの 1 つのセクションのみを表すのでにもかかわらず、コロン、昇順、降順、横方向領域で構成されます。

コロン (昇順、降順、横方向領域) の様々 な地域で開発して腸内細菌叢のコミュニティを研究するために、多段階の複雑なシステムを用いることができます。これらのシステムで複数の船は昇順、降順、横方向領域の腸内細菌は独立して栽培されないので、コロンのさまざまな地域を模倣するように設定されます。これらの血管は接続されているポンプを使用して降順大腸領域に横行結腸の順で基板を移動する、GIT による栄養素の流れを模倣しました。

本研究の目的は、5 段階の培養システム (材料の表を参照してください) できます使用方法腸内細菌叢のコミュニティを育成し、安定性と組成の面で群集の動態を発揮を実証することでした。このシステムの 1 つの容器、胃を表し 1 つ小腸。コロンは、各地域の²⁶を表す 1 つの容器で (横を昇順、降順)、3 つの領域に分かれています。この実験装置では、2 つの完全なシステムは、並列で実行した、ユニット 1 ムチンのキャリアを含む表す粘膜と粘液のキャリアが含まれていないユニット 2。各地域の内腔および粘膜の段階で開発されたコミュニティは 16S rRNA 遺伝子配列と SCFA 解析を使用して時間をかけて、お互いに、糞便中の菌を比較しました。示された結果は、コミュニティ、両方の組成および in vitro システムのこのタイプから作り出すことができる機能の種類を示しています。

プロトコル

1. 材料と準備

注:粉末培地を購入 (材料の表を参照してください)。G/L の培地の組成は以下の通りです: アラビノガラクタン (1.2)、ペクチン (2.0)、キシラン (0.5)、グルコース (0.4)、酵母エキス (3.0)、特別なペプトン (1.0)、ムチン (2.0)、L システイン塩酸 (0.2)。

1. 培地を準備します。
   1. 二重蒸留水、脱イオン水 2 L と 4 L フラスコを入力します。
   2. 水に定義された培地粉末 29.2 g、ユニットの完全な均質化を混ぜます。
   3. 磁性攪拌器を追加し、蓋のネジを緩くします。
   4. 30 分のための 121 ° c のオートクレーブ。
   5. 冷却した後、定数撹拌 (マグネチックスターラー) で 4 ° C で冷蔵庫に準備された培地を格納します。
2. 膵液を準備します。
   1. オートクレーブ 121 ° C、30 分で、スターラーバーで 5 L の容器に蒸留水、脱イオン水 2 L を追加。
   2. 、オートクレーブから出した後、室温に冷却するために水を許可します。
   3. 12.5 g NaHCO₃、6 g の胆汁および 0.9 g パンクレアチンを追加します。マグネチックスターラーをミックスするに配置します。
      注:膵液で 2-3 日毎に新鮮な準備、攪拌した後に冷蔵します。
3. リン酸バッファー
   1. 磁性攪拌器で磁気スターラー バーを含む 1 L フラスコを配置します。0.5 L の蒸留水、脱イオン水を追加し、攪拌をオンにします。
   2. 次に、6.8 g KH₂PO₄、8.8 g K₂HPO₄、および 0.1 g ナトリウム チオグ リコール酸を追加します。水 1 L の最終巻で締めくくり
   3. コンポーネントが完全に溶解した後、NaOH を使用して 7.0 に pH を調整します。
   4. バッファーは、疎ではなく密閉スクリュー キャップ蓋と蓋にねじ止めされている 30 分確保のための 121 ° c のオートクレーブ 2 L 容器に注ぐ。
   5. オートクレーブから取り出したら、部屋の温度に冷却するソリューションを許可します。2 週間室温でバッファーを保存します。
4. ムチン寒天キャリアを準備します。
   1. オートクレーブ プラスチック ムチン キャリア (材料の表を参照してください)、鉗子、プラスチック メッシュ (管状形状)、ジップタイ 131 ° C で 30 分間。
   2. オートクレーブのダブル 300 mL 蒸留、重複使用するまで室温で 30 分店 131 ° C で水をイオン化します。
   3. バイオ セーフティ キャビネット層流、滅菌の鉗子を用いたプラスチック ムチン キャリアと滅菌シャーレを入力します。
      注:ムチン キャリアは、ムチン寒天で満ちている中空のプラスチック製サークルです。蓋を上に配置することができます一度いっぱいとこれらは脇に設定することができます。
   4. ムチン寒天培地を準備するには、オートクレーブ水 300 mL に細菌の寒天とブタのムチンの 15 g 3 g を追加します。
   5. 発煙のフード、このソリューションを沸騰、熱源から削除して、1 分繰り返す沸騰と合計 3 回の冷却のための冷却すること。
   6. ムチンの寒天液を入れたガラスの容器が触れないように十分なクールなバイオ セーフティ キャビネット流に移動します。
   7. 層流とキャビネットのバイオ セーフティにおける液体ムチン寒天をペトリ皿に置かれたプラスチック ムチン キャリアに注ぐ。すべてのキャリアがムチン寒天で完全に満ちていることを確認します。
   8. ペトリ皿の背面に蓋を置き、流の下で冷却するようにし、なさい。
   9. ムチン キャリアを組み立て、オートクレーブ養生プラスチック網を取る、シャーレの滅菌鉗子を使用してから凝固ムチン寒天を含むムチン キャリアを挿入します。
   10. 郵便関係を使用して、メッシュの端を閉じます。この方法ではムチンのキャリアを含む純関数はムチン寒天でいっぱい。使用するまで 4 ° C で保存します。

2. 接種とシステムの実行を設定

1. 養殖システムをセットアップします。
   注:人間の腸の微生物生態系のツイン シミュレータを用いたこの研究。
   1. 磁気スターラーで攪拌バーを含む 10 のバイオリアクターを置き、撹拌をオンにします。
      注:各ユニット 5 バイオリアクターので 2 台必要になります 10 バイオリアクターで構成されます。
   2. 5 バイオリアクターを蠕動ポンプ (図 1) を経由してシーケンスにシリコン チューブを使用して相互に接続します。コンテンツを使用して横断するポンプ、流体 1 バイオリアクターから次。
   3. 次のシーケンスでバイオリアクターのラベル: 胃、小腸、上行結腸、横行結腸、消化管の順序を表すために、コロンを降順します。
      注:バイオリアクターはすべて同じですが、することができます。 または胃および小腸バイオリアクターより小さいと比較できるコロン バイオリアクター彼らは以下のボリュームを保持するので。この方法でバイオリアクターの設定では昇順コロン地域は小腸からの栄養素を受け取る、横行結腸領域は上昇結腸領域から栄養素を受け取る、下降結腸領域からの栄養素を受け取る、横方向領域。これで、システムは腸管から栄養素の連続的な移動を模倣しました。
   4. 4 ° C で冷蔵庫に磁気スターラーを使用して一定の攪拌と培地、膵液を配置します。シリコン チューブを使用して、蠕動ポンプを介して胃バイオリアクターに定義された媒体を接続し、膵液を小腸蠕動ポンプを介してに接続します。
   5. 尿排液バッグに凝固剤を追加します。下行結腸を蠕動性ポンプを経由して尿排液バッグに接続します。固化処分実験中に生物学的廃棄物として。
   6. シリコン チューブを使用して、順番に各容器の水ジャケットと循環水のお風呂にそれぞれの端を接続します。蒸留水 (この量、循環使用水お風呂のタイプによって異なります) と 37 ° C に設定循環風呂の水を埋める
   7. シリコン チューブを使用して、蠕動ポンプを経由して各容器のふたに酸とベースを接続します。推奨濃度は、0.5 M 塩酸と 0.5 M NaOH をします。
   8. 蓋に指定したポートを通じて各容器に pH のプローブを挿入します。このポートは、pH プローブと蓋 (図 1) にネジを保持するために設計されています。地域ごとに pH を次のように設定: 胃、pH = 2;小腸、pH = 6.7 6.9;上行結腸、pH = 5.6 5.9;横行結腸、pH = 6.15-6.4;下行結腸、pH = 6.6 6.9。
      注:初期の段階では、コミュニティが地域 pH 値の差に基づいて区別するために。ただし、一度供給サイクルを開始、地域社会さらに栄養入力の違いに基づいて成熟します。
   9. 指定されたポートを使用して各容器のふたにシリコン チューブを用いた窒素線を接続します。窒素ラインが次の順序でフロー: 胃、小腸、上行結腸、横行結腸、大腸を降順します。各ユニットには交差汚染を避けるために独自のフラッシュを確認します。
      注:窒素は、システムから削除された酸素を使用し、実験中に嫌気を維持します。
   10. 指定されたポートを使用して各バイオリアクターの蓋を介して金属サンプル チューブを挿入します。金属管はバイオリアクターに下に伸びる、流体のサンプルを収集するために使用されます。
   11. サンプル チューブの上端にシリコン チューブの小片を追加し、サンプリング中に注射器の使用を可能にルアーロックを接続します。
2. システムの接種
   1. 次のボリュームを使用して定義された媒体で大腸領域を埋める: 500 mL 上行結腸、横行結腸で 800 mL と下行結腸の 600 mL。
   2. リアクターの容積に比例した量で、大腸にムチン寒天キャリアを追加します。この実験用原子炉あたり 60 のキャリアが使用されました。
   3. バイオリアクター内での流体のレベルを上げる、キャリアを追加するので、サンプル チューブと注射器を使用して任意の余分な培地を削除します。
   4. コンピューターを使用して各原子炉で pH を調整する pH プローブを入れます。
   5. 20 分間窒素フラッシュをオンにします。
      注:10% グリセリン溶液で均質化された 10% 糞便として接種に使用される糞便の磨砕液を購入 (材料の表を参照してください)。糞便のサンプルが次の条件を有するドナーのプールからランダムに選択: アメリカ平均の体容積指数 (18.5 〜 24.9) で、少なくとも 1 年間の無料 21 45 歳の抗生物質間 (ない菜食主義者や菜食主義者)、典型的な西部の食事療法を消費.このプロトコルでは、単一のドナーのみが使用されます。ただし、これは実験的なデザインのために変更できます。
   6. 接種前に製造元のガイドラインに従う糞便のホモジネートを解凍します。
   7. 60 mL シリンジ (上行結腸、横行結腸、下行結腸の 30 mL 40 mL、25 mL) を使って、サンプル ポートを介して原子炉量の 5% に等しい量の糞便の磨砕液を追加することによって各コロン原子炉を接種します。
   8. PH コントロールで一晩バイオリアクターでの文化を育てます。
   9. 一晩成長後 3 のセクションで下記のとおり各コロン地域から内腔液のサンプルを収穫します。サンプリングが完了した後、給餌を開始するコンピュータ プログラムを入れます。
3. 毎日のサイクルを給餌
   注:毎日の授乳サイクルが自動化されたコンピューター。
   1. 一日に三回胃バイオリアクターに定義された媒体の 140 mL を投入し、1 時間孵化させなさい。
   2. 1 時間培養後、胃の内容物を小腸にポンプします。同時に、小腸に 60 mL の膵液のポンプします。
   3. 小腸の ph 6.7 6.9, pH 調整および 90 分間インキュベートする混合物を許可します。、インキュベーション中に 10 分ずつの合計は、各システムの窒素フラッシュをオンにします。
   4. 90 分インキュベーション後、上行結腸、横行結腸、下行結腸と下行結腸の廃棄物は横行結腸、上行結腸、小腸からポンプで同時にターンします。
4. 実験のタイムライン
   注: 、ここで使用される生体外でシステムは長さおよそ 8 週間連続で運営されています。以下は推奨される実験のタイムライン、ただし、これは要件と実験の目的に応じて変更できます。
   1. 次の手順は手順 2.1 で示したシステムを設定します。
   2. 以下のプロトコルに従う一晩成長からサンプルを収穫します。毎日のサイクル、上記のプロトコルに従う一日三回の給餌を開始します。
   3. 安定させるために細菌を許可する 2 週間の合計のための実験を実行します。
      注:システムを実行するため、pH を維持、毎日供給サイクルは一日に三回続いている、粘膜のキャリアそれぞれが 2-3 回を変更が週。
   4. 安定化後に、、制御期間として 2 週間の実験を実行します。
   5. 制御期間後さまざまなコンポーネントや治療期間として知られている変数をテストするのにはシステムを使用します。
   6. 治療期間後コンポーネントまたは変数の追加を停止し、条件が正常に戻る。これはウォッシュ アウト期間と見なされます、コミュニティへの変更が永続的かどうかを決定する使用されます。

3. システムからのサンプルの収穫

注:実験では、サンプル収穫できる、いつでも任意の地域の内腔または粘膜の段階から次の以下のガイドライン。

1. 内腔のサンプルを収穫
   1. 培養液の中に拡張サンプル ポートを通じて内腔液サンプルを収穫します。70% のエタノールまたは小さいアルコール パッドでサンプル ポートのルアーロックをクリーニングを開始し、乾燥することができます。
   2. 30 mL シリンジからすべての空気を削除することを確認し、サンプル ポートに接続します。上下に 3-5 回を描く船舶部品の適切な混合を確実します。後、文化の 30 mL の合計を描きます。
   3. 内腔のサンプルとして必要な滅菌隼の管と氷上店の約数。サンプリングが完了した後は、-80 ° C のフリーザーにこれらを転送します。
   4. SCFA 分析内腔サンプル 15 mL は 4 ° c、5,000 × gで 10 分間スピンします。上清は注射器 PES 0.2 μ M フィルターを使用してフィルターされます。-80 ° C でフィルター処理された上澄みを格納します。
      1. DNA 分析、スピン 4 ° C で内腔液 1 mL、5,000 × gで 10 分間の上澄みを廃棄し、-80 ° C でペレットを格納
      2. バックアップとしてほとんどの実験-80 ° C で内腔液 10 mL を格納します。
2. 粘膜サンプルを収穫
   注:粘膜キャリアを 2-3 日毎に変更します。
   1. 削除し、冷蔵庫から準備されたムチン キャリアを引き出します。
   2. 窒素フラッシュをオンにし、原子炉の蓋をすばやく開きます。ムチンのキャリアの 50% を削除し、新しいものを追加します。
   3. シール蓋を迅速かつ窒素の別の 20 分間のフラッシュを維持します。
   4. DNA 抽出、分注 0.25 0.5 g の寒天培地 2 mL チューブに必要になるまで-80 ° C で保存と。

4. DNA 抽出、シーケンシング、および分析

注:DNA は、ヒューム フード²⁹で物理的な均質化を用いた CTAB DNA 抽出法抽出されます。次の抽出、分光光度計を使用して、各サンプルの DNA 量を定量化します。

1. CTAB バッファーを準備します。
   1. 4.2 g K₂HPO₄および脱イオン、蒸留水とし、30 分のための 121 ° c のオートクレーブの 200 mL の 4.09 g 塩化ナトリウムを溶解します。
   2. 部屋の温度に冷却するソリューションを許可します。
   3. 撹拌で 60 ° C に 10 グラム臭化ヘキサデシルトリメチル アンモニウム (CTAB) と熱を追加します。
   4. すべての CTAB が解散した後は、部屋の温度に暑さとクールからソリューションを削除します。
2. PEG 6000 ソリューションを準備します。
   1. ポリエチレング リコール 6,000 と 93.5 g 脱イオン、蒸留水 1 リットルに食塩の 300 g を溶解します。
   2. すべての粒子が溶解すると、オートクレーブ 121 ° C、30 分で解決。
   3. オートクレーブ後、使用する前に室温にソリューションをクールします。
3. DNA の抽出を実行します。
   1. 2 mL サンプル チューブと均質に渦に CTAB バッファーの 500 μ L とフェノール ・ クロロホルム ・ イソアミル アルコールの 500 μ L を追加します。
   2. (材料の表を参照) をチューブ mm 物理均質化 0.1 サンプル チューブの内容全体を転送します。
   3. 20 チューブをホモジナイズしてください物理的なホモジナイザーを使用しての間に、20 s の一時停止で 2 回を設定最高で s (材料の表を参照してください)。
   4. 3,000 x g 5 分で均質化されたチューブを遠心します。
   5. きれいな、1.7 mL チューブに上清の 300 μ L を転送し、元管に CTAB バッファーの 500 μ L を追加します。
   6. 再び 3,000 x gで 5 分手順 4.3.2-4.3.3 と遠心分離機でメソッドを使用このチューブをホモジナイズしてください。
   7. 遠心分離の後 600 μ L を含む新しいチューブに上清の別の 300 μ L を転送します。
   8. 上澄みの 600 μ L を含むチューブに 600 μ L のクロロホルム ・ イソアミル アルコールの合計を追加します。
   9. ミックス、簡潔に遠心分離してチューブを反転します。きれいな 1.7 mL の管に上部の段階の 500 μ L を転送します。上のフェーズにのみを確認します。
   10. 次に、ミックス、その後、2 時間室温でインキュベートしてチューブを反転、Peg 6000 ソリューションの 1000 μ L を追加します。
   11. インキュベーション後、18,200 × g、10 分のための 4 ° C でチューブを遠心します。
   12. 上澄みを廃棄し、氷冷 70% エタノールでペレットをきれい。
   13. 18,200 × g、4 ° C で再度チューブを遠心分離機 10 分上澄みを廃棄し、流の下安全キャビネットの乾燥ペレットを許可するため。
   14. ペレットの乾燥後は、各チューブに 75 μ L の滅菌水無料 DNAse、RNAse フリーを追加します。
   15. 分光光度計によって再懸濁の DNA を定量化し、16S rRNA 遺伝子配列の送信。

5. 短いチェーン脂肪酸 (SCFA) の検出と分析

1. 30 分の 40 ° C で凍結試料を融解し、2:1 (v: v) 比にジエチル エーテルを用いた短鎖脂肪酸を抽出します。
2. 列、30 m、0.25 mm 装備 GC/MS (材料の表を参照) を有機相を転送 ID、0.25 μ m (材料の表を参照してください) 10 μ L が注入されます。
3. それぞれ噴射ポート温度や初期カラム温度を 260 ° C、125 ° C に設定します。1 分の初期温度を保持し、250 ° c、列 1 mL/分の流量で 11.5 分以上これを増やします。
   注:イオン源の MS 温度は 220 ° C およびインターフェイスの 250 ° C です。
4. 内部標準として標準曲線と 2-methylhexanoic 酸を使用して各 SCFA の量を定量化します。

結果

上記のプロトコルでは、接種と大腸の腸内細菌を研究する 5 段階の生体外でシステムの実行を設定について説明します。DNA の抽出の後、以下に示すデータを生成するには、V1V2 地域の 16S rRNA マーカー遺伝子 DNA の配列を行った小児病院でマイクロバイ センターで (例えば, MiSeq イルミナ プラットフォーム) をシーケンス処理スループットを使用してフィラデルフィア²⁷。QIIME (微生物生態学を定量的に把握) バージョン 1.9²⁸は、シーケンス データを処理する使用され、統計計算²⁹R 環境に関する統計分析を行った。分類の割り当ては、Greengenes 16S 参照データベース^30,31を使用して生成されました。乙相対的な豊かさを算出した割って、我妻がサンプルの読み取りの合計...

ディスカッション

体外培養システムは、大腸の腸内細菌を研究して開発されています。器具コロン³³の地域ごとの成熟した腸内微生物群集の成長を促進、胃消化器官の生理学的条件をシミュレートするように設計を使用します。腸内細菌を研究する体外培養システムの実際の実行の概念は、論理的でわかりやすいですが、精度と信頼性の高い結果を生成すると予想し、が何必要の理解を必要があります。

In vitro における腸内細菌叢実験に必要な要素は接種後、コミュニティが安定性に到達する必要があります、それが糞便菌の微生物の多様性を維持する必要があります。実験を正しく実行すると場合、これら 2 つの必要な要素を容易にし、予想通り実現します。システムの安定性と多様性に影響を与えるプロトコルで重要な手順次のとおりです: 培地や膵液の準備は正確である必要があります、これらの基板上の配信は同じでなければなりません。嫌気的条件は、実験中に維持されなければなりません。腸地域の pH は、時間をかけて正確に維持されなければなりません。人口変動および変数代謝産物生産実験中にこれらの 3 つのパラメー...

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
TWINSHIME	Prodigest	NA
Defined Medium (Adult M-SHIME growth medium with starch)	Prodigest	NA
Masterflex tubing	cole Parmer	NA
Urine Drainage bag	Bard	NA
Labsorb	Sigma-Aldrich	NA
糞便サンプル	Openbiome	NA
シリンジ	ベクトン ディクソン	NA
定義培地	プロダイジェスト	NA
オックスガル 胆汁	ベクトン ディクソン	NA
膵臓	シグマ アルドリッチ	NA
ガラス器具	エー	ガラス NA
ブタ ムチン	シグマ アルドリッチ	NA
細菌寒天	シグマ・アルドリッチ	NA
滅菌ポーチ	VWR	NA
ビーズバグ	ベンチマーク サイエンティフィック	NA
トリプルピュア ハイインパクトジルコニウム 0.1 mm ビーズビーターチューブ	ベンチマークサイエンティフィック	NA
RNAseフリー、DNAseフリー、滅菌水	ロシュ	NA
島津製作所 QP2010 Ultra GC/MS	島津製作
Stabilwax-DA カラム、30 m、内径 0.25 mm、0.25 µm	Restek	NA
プラスチックムチンキャリア	Prodigest	NA