フルオレセインイソチオシアネート-ポリスクロースを用いたマウスにおける糸球透過性の高感度測定 70

サマリー

ここでは、高感度で非放射性トレーサーを用いてマウスの糸球体透過性を試験するプロトコルを提示する。この方法は、小さな尿量で反復的な尿分析を可能にします。

要約

尿中のアルブミンの損失(アルブミン尿)は、心血管の結果を予測します。生理学的条件下では、少量のアルブミンを糸球体で濾過し、吸収限界に達するまで管状系で再吸収する。病理学的アルブミン濾過の早期増加は、したがって、アルブミン尿を分析することによって見逃されがちである。したがって、糸球体パーマ選択性をテストするためにトレーサーを使用することは有利と思われる。蛍光標識標識フッ素イソチオシアネート(FITC)-ポリスクロース(すなわち、FITC-Ficoll)は、糸球体透過性を研究するために使用することができる。FITC-ポリスクロース分子は糸球体によって自由に濾過されるが、管状系では再吸収されない。マウスおよびラットにおいて、FITC-ポリスクロースは、技術的に複雑な手順(すなわち、放射性測定、高性能液体クロマトグラフィー[HPLC]、ゲル濾過)を用いて糸球体透過性のモデルで調査されている。我々は、マウスにおけるFITC-ポリスクロース70(アルブミンのサイズ)に対する糸球透過性の早期および小さな増加をテストするために、FITC-ポリスクローストレーサーベースのプロトコルを改変し、促進した。この方法は小さい尿容積(5 μL)の反復的な尿の分析を可能にする。このプロトコルは、トレーサーFITC-ポリスクロース70が静脈内に適用され、尿が単純な尿カテーテルを介して収集される方法に関する情報を含む。尿は蛍光プレートリーダーを介して分析され、尿濃度マーカー(クレアチニン)に正規化され、技術的に複雑な手順を回避します。

概要

糸球体濾過バリア内の機能的または構造的欠陥は、アルブミンに対する糸球透過性を増加させ、尿中のアルブミンの検出(アルブミン尿)をもたらす。アルブミン尿は心血管の転帰を予測し、糸球体^損傷1の重要なマーカーである。アルブミン尿の低レベルでさえ、正常範囲内に横たわって、増加した心血管リスク1に関連している。

生理学的条件下では、アルブミンは糸球体を通して濾過され、管状システム2、3でほぼ完全に再吸収される。マウスでは、尿中のアルブミンの検出は、通常、尿採取の24時間からアルブミン酵素結合免疫吸着アッセイ(ELISA)によって行われる。24時間の尿採取またはスポット尿からの尿を使用すると、アッセイ感受性の問題のためにアルブミン濃度の小さな違いが見逃される可能性があります。したがって、ほとんどの研究者は、毒素、薬物、腎外科による強い腎損傷によってアルブミン尿が誘発される動物モデルを使用する。

したがって、糸球体透過性の小さくて一過性の変化を検出する敏感な方法の発見は、フィールドにとって非常に重要である。Rippeらは、蛍光標識トレーサー、すなわちFITC-ポリスクロース70(すなわち、FITC-Ficoll 70)をアルブ^ミン4の大きさで適用することにより、糸球体透過性を試験するラットモデルを提示した。トレーサーアプリケーションは、糸球体透過性(数分以内)の短期的な変化のテストを可能にし、非常に敏感な4.2つの研究は、マウス5、6でトレーサー法を使用している。その利点にもかかわらず、この方法は、残念ながら、欠点を持っています:それは技術的に非常に複雑で、放射性、および侵襲的です。尿のさらなる分析は、ゲル濾過またはサイズ排除HPLC5、6を用いてのみ行う。

本論文では、蛍光標識FITC-ポリスクロース70を用いてマウスの糸球体透過性を測定する代替的、敏感、非放射性、および高速方法を提示する。経尿道カテーテルを導入することにより、尿採取は膀胱穿刺、尿道切除術、および上腹部カテーテル塗布よりも侵襲性が低く、少なくとも30分毎に尿採取が可能である。蛍光プレートリーダー。尿中のトレーサー濃度は、酵素クレアチニンアッセイを使用して尿中のクレアチニン濃度に正規化される。

したがって、この新しい方法は、糸球体透過性の増加と早期糸球体損傷を研究するための敏感なツールを提供しています。

プロトコル

調査は、実験動物のケアと使用に関するガイド(米国国立衛生研究所第85-23号、1996年改訂)に記載されたガイドラインに従って実施されました。すべての動物実験は、関連する機関の承認に従って行われました(州政府ランデサムト・フュル・ナチュラル、ウムウェルト・ウンド・ヴェルブラウチャーシュッツ[LANUV]参照番号84-02.04.2012.A397)。

1. 機器、ソリューション、機器の準備

1. 0.9%の滅菌塩化ナトリウム(NaCl)でFITC-ポリスクロース70を10mg/mLの最終濃度(すなわち、NaClの10mLで100mg)に再構成する。
2. 透析FITC-ポリスクロース70溶液は、4°Cで一晩フリーFITC分子を除去する(分子量遮断[MWCO]10,000)。一定の撹拌下でFITC-ポリスクロース70の10mL当たり0.9%の無菌NaClの1Lを使用してください。光から守る。透析FITC-ポリスクロース70をアリコートし、-20°Cで保存する。
3. FITC-ポリスクロース70ボルスの場合は、10mg/mL FITC-ポリスクロース70溶液の4 μLを0.9%NaClの996 μL(FITC-ポリスクロース70:40 μg/mL)に加えます。
4. 平衡注入液の場合、10mg/mL FITC-ポリスクロース70溶液の20 μLを0.9%の無菌NaClの9.98 mLに加え、最終的な濃度20μg/mLにします。
5. 実験溶液の場合、注入液に薬物または物質を添加する(例えば、アンジオテンシンII[Ang II][100 ng/kg/min])を25gマウス用に、1mM溶液のAng IIの3 μLを添加する。
6. 手術のために、1つの剃り具、2つの外科クランプ、外科はさみの1組、2つのピンセット、2つの細かいピンセット、1組の細かいはさみ、および綿棒を準備する。ライゲーション手順のために2本の10cmシルク糸(4-0~6-0)を準備します。
7. 中央静脈カテーテルの配置のために、21 G針で10 mLシリンジを準備する。針の先端を長さ30cmのカテーテル(内径[ID]0.58mm)に入れておきます。0.58 mm カテーテルを 10 cm カテーテルに接続します(ID は 0.28 mm)。小さいカテーテル斜めの先端を切り、頸静脈に導入される鋭い先端を作成する。
8. 麻酔を調出す(すなわち、経皮麻酔ケタミン、体重100mg/kg、キシラジン、体重5mg/kg)を調出す。
9. 針を捨て、先端からカテーテル1cmをマーキングすることにより、22Gアンジオカテーテルを準備します。加熱パッドを37°Cに予熱します。
10. 血圧装置を準備し、必要に応じて血圧測定膜を変更します。

2. 準備段階

1. 尿カテーテル
   注: セクション 2.1 は、Reis ら 7.で説明したプロトコルに従います。図1および補足図1は、雌マウスにおける尿カテーテルの配置を示す。
   1. ケタミン/キシラジンでマウスを麻酔する(ステップ1.8参照)。適切な麻酔を確認するためにつま先ピンチテストを使用してください。麻酔を維持するために、60分後に麻酔(例えば、投与量の半分)を繰り返し、つま先のピンチテストが反射的な引き出しをもたらさない場合に適切な麻酔が確認される。
      注:このプロトコルではメスFVBマウスが使用される。
   2. マウスを37°Cの加熱パッドに後膜の再組み立てに置きます。下腹部を締め、尿道骨(例えば、顕微鏡下)を見つける。
   3. 22Gアンジオカテーテルのカテーテルのプラスチック部分を使用し、キシロカインゲルで潤滑します。遠位尿道軸を平行にしながら尿道骨に3mm入れ注意深く導入する(図1A)。
   4. 尿道骨内に先端を保ち、尿道の軸を維持することにより、アンジオカテスター180°の上部を回します(図1B)。
   5. カテーテル7mmをさらにマウスに入れ、膀胱内に入れられるようにする(図1C)。カテーテルを抵抗を超えて強制しないでください。抵抗が感じられた場合は、最初からカテーテルの位置を修正します。尿カテーテルの位置が正しい場合、尿は既にカテーテル内に現れる可能性があります。
   6. 1.5 mLの茶色のチューブをアンジオカテレータの上に置き、尿を採取します。尿の生産を高めるために皮下に0.9%NaClの1 mLを適用する。
2. 中央静脈カテーテル
   1. マウスの首を剃り、外科医に向かって頭で満たして置きます。テープでマウスの頭部をハイパーエクステンドします。
   2. 70%イソプロパノールで首を消毒する。つまみとはさみを使って、顎の下に小さな皮膚切開(5mm)を作ります。胸骨の真ん中に達するまで、胸骨の方向に約1cmの皮膚をカットします。
   3. はさみを使って、首の右側の皮膚を慎重に解剖します。マウスの右側に皮膚の長方形の切開を行い、首の軟部組織を露出させます。はさみとツイザーを使います。2つのクランプでスキンフラップを固定します。
      注:頚静脈は甲状腺の左側に沿って走るか、甲状腺の右葉によってわずかに覆われている。この手順の後、手術のために顕微鏡を使用してください。
   4. 細かいインテッツァーの先端を使用して、鈍い準備によって慎重に頚静脈を露出させる。静脈枝の損傷を避けてください。
      注:細かいはさみで組織を取り除く必要があるかもしれません。はさみを使用して組織を除去する場合は、出血のリスクが高まるので注意が必要です。
   5. 目に見える頚静脈(マウスの頭部に向かって)の遠位部分にシルク糸(4-0~6-0)で合字を置き、閉じます。糸をテープで固定して合字に張力を入れ、頸静脈にわずかな張力を確保します。頸静脈の近位部分の周りに合字を準備します。
   6. カテーテルを平衡注入液(ステップ1.4参照)で充填し、カテーテルが頚静脈を整列するようにテープでカテーテルを固定します。空気塞栓症を避けるために気泡のための制御。
   7. 挿入部位で細かいピンセットで頚静脈を持ち上げます(挿入部位は合字の1~2mm近位です)。チューブを頚静脈に平行に合わせます。内膜を目指して頸静脈を穿刺し、約2~4mmの挿入を行い、頸静脈の軸を平行にする。活発な動きを避けてください。
   8. 合字を閉じてカテーテルを固定します。顕微鏡を通して注意深く見ることによって合字の堅さのための制御。手術の現場に湿った綿棒を置きます。
3. 血圧測定
   1. マウスが後部のリカムに横たわっている間、マウスの尾の下部にテールカフを置きます。測定を開始し、1時間あたり10倍繰り返します。測定値から平均を作成します。
   2. 血圧測定が正しくないと思われ、誤ったデータが生成される場合は、テールカフの位置を調整します。

3. 平衡化段階

1. 平衡化段階が始まる前に尿採取管を変更し、氷の上に置きます。
2. 21G針と大きなカテーテル(0.58mmのID)でFITC平衡相溶液で満たされた10 mLシリンジ(ステップ1.4参照)を導入し、シリンジポンプに入れておきます。
3. 綿棒を折りたたみ、頚静脈に導入される小器のカテーテル(0.28 mmのID)のまわりでそれを置く。綿棒の中にカテーテルを置きます。逆行性血流または空気塞栓症を廃止するために綿棒の上にクランプを置きます。27 G 針を FITC ボーラスで満たされた 1 mL の注射器で小容器カテーテルの端に接続します。
4. クランプを開き、FITCボーラス(100 μL)を適用します。クランプをもう一度閉じ、より大きなカテーテルを小さいカテーテルに接続します。シリンジポンプを0.008 mL/min(0.480 mL/h)で起動します。注入を60分間続けます。

4. 実験段階

注:この段階では、糸球体パーマ選択性に対する薬物の影響を調べることができる。

1. 尿管(時時点0分)を別の1.5 mL茶色の管に変更します。小さい容器のカテーテルのまわりで綿棒を置き、ステップ3.3に示すようにクランプを閉じる。
2. 大きなカテーテルを小容器カテーテルから取り外します。注射器を実験段階ソリューションに変更します(ステップ1.5を参照)。大きいカテーテルが平衡溶液で満たされるように注入ポンプを動かしてみましょう。
3. 空気塞栓症を避けながらカテーテルを再接続し、クランプを再び開きます。シリンジポンプを0.008 mL/minで起動します。
4. 注射器ポンプを60分間動かし続け、その後尿管内に尿を回収する(尿60分)。尿管を氷の上に置きます。
5. 麻酔中に頸部脱臼によってマウスを犠牲にする。処分する前に、マウスが死んでいることを確認するために5分間観察されます。

5. 尿分析

1. 蛍光測定
   1. 尿プールを解凍し、リン酸緩衝生理食生(PBS)で1:10に希釈します。
      注:尿プールは、代謝ケージ内の12-24時間の尿コレクションで健康なマウスから収集された尿のプールです。
   2. 蛍光測定の基準を準備します。10個の茶色の1.5mLチューブを取り、ブランク(1:10希釈尿プール)と次のFITC-ポリスクロース70濃度(0.625、1.25、2.5、5、10、20、40、80、および160 μg/mL)にラベルを付けます。
   3. 希釈尿プールのピペ246 μLを1.5mLブラウンチューブに入れ、FITC-ポリスクロース70ストック濃度の4μLを加え(ステップ1.1参照)、最終的な濃度を160μg/mL FITC-ポリスクロース70に得る。希釈された尿プールのピペ状100 μLを他のすべてのチューブに入れます。
   4. 160 μg/mL FITC-ポリスクロース70チューブの100 μLを80 μg/mLチューブにピペッティングして1:2を希釈し、他の濃度を継続します。希釈された濃度の適切な混合物を保証する(例えば、継続する前にチューブを渦にすることによって)。
   5. 希釈された尿プールでマウス尿サンプル(0分、60分)1:10を希釈します。
   6. 各標準的なFITC-ポリスクロース70濃度のピペット5μLと、黒の384ウェルプレートに三重としてマウス尿サンプルの。気泡を避けるために、1,000 x gでプレートを15sで遠心分離します。
   7. プレートリーダーの384ウェルプレートを分析します。496 nmで励起を行い、525nmで蛍光を測定します。
2. クレアチニン測定
   1. 製造元の指示に従ってください。簡単に言えば、100 mMクレアチニン標準溶液の10 μLを990 μLのクレアチニンアッセイバッファーで希水ミン標準溶液を希釈して10μLを希水ミン標準溶液を調べて、1mM標準溶液を調用します。
   2. 1 mMクレアチニン標準溶液の0、2、4、6、8、および10 μLを96ウェルプレートに加え、それぞれ0、2、4、6、8、および10nmol/ウェル規格を生成します。各ウェルにクレアチニンアッセイバッファを追加し、体積を50μLにします。
   3. クレアチニンアッセイバッファーの42-44 μL、クレアチニンの2μL、クレアチニン酵素ミックスの2μL、クレアチニンプローブの2μLを加えて反応ミックスを調製します。ブランクの場合は、クレアチニンアッセイバッファーの44 μL、クレアチニン酵素ミックスの2μL、クレアチニンプローブの1-2 μLを使用します。
   4. 96ウェルプレートの各ウェルに適切な反応ミックスの50 μLを加え、37°Cの水平シェーカーで60分間インキュベートします。インキュベーション中にプレートを光から保護します。プレートリーダー上の570 nmで吸光度を測定します。
   5. すべての読み取り値から空白の値を減算してクレアチニン濃度を計算します。結果は単位ナノモル/マイクロリットルを有する。クレアチニンの濃度にクレアチニンの分子量(113.12 ng/nmol)を掛け、単位ナノグラム/マイクロリットルを受け取ります。

6. データ分析

1. 標準曲線からFITC-ポリスクロース70尿濃度を計算します。
2. 代表的な尿試料中のクレアチニン濃度にFITC-ポリスクロース70尿濃度を参照してください。
3. 尿60分サンプルを対照および処置されたマウスの尿0分サンプルに参照する。

結果

図2に示すように、マウスにおける糸球体透過性を試験する方法は、3つの段階で構築されている。第1段階は、尿カテーテルと中央静脈カテーテルが置かれる調製段階と呼ばれる。第2段階は平衡化段階と呼ばれ、FITC-ポリスクロース70の静脈内ボーラス注入から始まり、続いてFITC-ポリスクロース70を60分間連続注入する。最後のフェーズは実験段階と呼ばれます。この段階では、FITC-ポリスクロース70の注入が継続され、薬物または他の物質が球体透過性に影響を与えるため試験することができる。尿は各段階の終わりに集される。

このトレーサーモデル内の糸球体透過性を調べるためには、粘膜を傷つけずに尿カテーテルを適切に配置することが不可欠です。女性のマウス膀胱への尿カテーテルの配置を図1で示す。カテーテルは尿道骨に3mm入れられ、頭蓋尿道軸と平行である(

ディスカッション

提示された方法は、研究者がトレーサーを使用して非常に敏感な方法でマウスの糸球体透過性をテストすることを可能にする。この方法では、糸球体透過性の短期的な増加は、少量の尿のみを使用して診断することができる。この技術をうまくマスターするための最も重要なステップは、1)マウス手術、特に中枢静脈のカナンテーションにおける手動専門知識の開発、2)粘膜に害を与えることなく尿カテーテルを配置すること、および3)取り扱いに関する手動の専門知識です。サンプルの小さい容積が付いている384ウェル版。

中央静脈カテーテルを配置する場合、カテーテルが頸静脈に浸透しないことが不可欠である。浸透を避けるために、遠位合字(ステップ2.2.7を参照)で頸静脈に緊張を置き、細かいピンセットで頸静脈を持ち上げて頸静脈の内気を拡張することをお勧めします。挿入部位を小さく保つために、カテーテルを挿入している間グロスの動きを避け、余分なティッシュを取除くことによって外科分野の最もよい眺めを常に保障しなさい。尿カテーテルの配置の最も重要なステップは膀胱への最終的な挿入である。抵抗が感じられた場合は、粘膜に誤った痕跡や損傷を引き...

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
Motic SMZ168 BL	マウス手術用	Motic	SMZ168BL
KL1500LCD	Pulch and Lorenz顕微鏡	手術用	150500
Microfederschere	Braun、Aesculap	FD100R	細かいはさみ
Durotip Feine Scheren	Braun、Aesculap	BC210R	首のカット
用 Anatomische Pinzette	Braun、手術用Aesculap	BD215R
PRäparierklemme	Aesculap	BJ008R	手術用
セラフレックス	セラグ ウィスナー	IC108000	絹糸
ケタミン 10%	メディスター		麻酔
ロンプン (キシラジン) 2%	バイエル		麻酔
ファインボア ポリエチレン チューブ ID 0.28mm OD 0.61mm	Portex	800/100/100	カテーテル
ファインボア ポリエチレン チューブ ID 0.58mm OD 0.96mm	Portex	800/100/200	カテーテル
ハーバード装置11プラス	ハーバード装置	70-2209	シリンジポンプ
BDインサイトオートガード	BD	381823	尿道カテーテル
マルチモード検出器 DTX 880	ベックマン・コールター		プレートリーダー
384ウェルマイクロタイタープレート	Nunc	262260	384ウェルプラット
クレアチニンアッセイキット	シグマ・アルドリッチ	MAK080	クレアチニン濃度を測定する
96ウェルプレート	Nunc	260836	クレアチニンアッセイ
FITC標識ポリサクロース 70	TBD コンサルタント	FP70	FITC-ficoll
アンジオテンシンII	Sigma-Aldrich	A9525	糸球体透過性の試験に使用
BP-98A	血圧測定用	ソフトロン
OTS 40.3040	Medite	01-4005-00	マウス手術用加熱プレート
Instillagel 6mL	Farco-Pharma GmbH		尿道カテーテル
Exacta	Aesculap	GT415	シェーバー