方法論記事

ヒトP53を研究する機能アッセイを開発するシャーシとしての酵母

DOI：

10.3791/59071

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2019年8月4日

 ,  ,  ,  ,  , 
1Mutagenesis and Cancer Prevention Unit, Ospedale Policlinico San Martino, 2Department CIBIO, University of Trento, 3LAQV/REQUIMTE, Laboratory of Microbiology, Faculty of Pharmacy, University of Porto

* These authors contributed equally

この記事について

サマリー

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ここでは、ヒトP53トランス活性化の可能性、その様々な癌関連変異の影響、共発現相互作用タンパク質、および酵母サッカロマイセスセレビシエレポーター株を構築し、利用するための4つのプロトコルを示します。特定の低分子の効果。

要約

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

よく知られている哺乳動物P53タンパク質が酵母S.セレビシエにおける転写因子(TF)として作用し得ることを知ることは、1)結合部位(すなわち、応答元素(RE)の影響を研究するための異なる機能的アッセイの開発を可能にした。P53トランス活性化特異性または2)TP53変異、共発現共起因子、またはP53トランス活性化活性上の小分子に関する配列変異。異なる基礎研究および翻訳研究アプリケーションが開発されました。実験的に、これらのアプローチは酵母モデルの2つの主要な利点を利用する。一方、ゲノム編集の容易さは、特定のP53-REのレベルでのみ異なるアイソジェニック株を利用して、P53依存性の配列特異性を調べることにより、定性的または定量的レポーターシステムの迅速な構築を可能にします。トランスアクティベーション。一方、異所性P53発現に対する調節システムの利用可能性は、広範囲のタンパク質発現におけるトランス活性化の評価を可能にする。この報告書でレビューされているのは、カラーレポーター遺伝子、ルシフェラーゼ、酵母の成長に基づく広範に使用されるシステムであり、その主な方法論的ステップを説明し、その予測力を批判的に評価する。さらに、これらのアプローチの極端な汎用性は、TP53遺伝子ファミリーの他のメンバーであるP63およびP73を含む異なるTFを研究するために容易に利用することができる。

概要

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

転写は、転写因子(TF)の動的、空間的、時間的組織を含む非常に複雑なプロセスであり、特定の刺激に応答してクロマチン領域におけるRNAポリメラーゼンの募集および変調のための共因子である1.ヒトP53腫瘍抑制剤を含むほとんどのTFは、単一(または複数の)ユニークなモチーフから成る応答要素(REs)と呼ばれるDNA配列の形で特定のシス作用要素を認識し、単一(または複数)のユニークなモチーフから成る〜6〜10ヌクレオチドを長くする。これらのモチーフの中で、個々の位置は、様々な程度の変動性2を示し、通常、位置重量行列(PWM)またはロゴ3、4によって要約される。

酵母S.セレビシエは、補体アッセイ、異所性発現、および機能アッセイを通じてヒトタンパク質の異なる側面を研究するための適切なモデルシステムであり、たとえ外来酵母遺伝子が存在しない場合でも5、6,7.転写系8の基底成分の進化的保存により、多くのヒトTF(酵母細胞で異所発現した場合)は、導約されたプロモーターを介して作用することによってレポーター遺伝子の発現を調節することができる。適切な R が含まれています。ヒトP53のためにここに提示された転写モデルシステムは、効果を変調することができる3つの主要な変数によって特徴付けられます:1)P53の発現とタイプのモダリティ、2)P53依存転写を制御するRE配列、および3)のタイプレポーター遺伝子(図1A)。

P53発現のモダリティに関して、S.cerevisiaeは、誘導性、抑圧性、または構成的プロモーター9、10、11の選択を可能にする。 特に、誘導性GAL1プロモーターは、酵母におけるTFの発現(炭素源としてラフィノースを用いる)または可変(培地中のガラクトースの量を変化させることによって)を可能にする。実際、微細に微細に微細に発現することは、P53自体だけでなく、他のP53ファミリータンパク質12、13を研究するための重要な開発を表す。

P53依存式を制御するREのタイプに関しては、S.cerevisiaeは、そうでなければ同種の背景に関心のあるREのユニークな違いを有する異なるレポーター株の構築を可能にする。この目標は、S.セレビシエで開発された特に汎用性の高いゲノム編集アプローチの適応を用いて達成され、デリット・パーフェット12、14、15、16と呼ばれる。

さらに、異なるレポーター遺伝子(すなわち、URA3、HIS3、およびADE2)は、S.セレビシエにおけるヒトTFの転写活性を定性的かつ定量的に評価するために使用することができ、それぞれが特定の特徴を有する実験的ニーズに合わせて調整される17,18,19,20,21.これらのレポーター遺伝子の発現は、それぞれウラシル、ヒスチジン、アデニンプロトトロフィーを付与する。URA3レポーターは、5-FOAの存在下での細胞の増殖も許可しないため、逆選択することができます。ADE2レポーターシステムは、栄養選択に加えて、野生型(すなわち、ADE2発現で機能的)または変異体(すなわち、ADE2上では機能しない)を発現する酵母細胞の同定を可能にするという利点を有する。)コロニー色からP53。

例えば、ADE2遺伝子を発現する酵母細胞は、制限量のアデニン(2.5-5.0 mg/L)を含むプレート上に通常サイズの白いコロニーを生成するが、不十分または転写しないものは、より小さい赤(またはピンク)と同じプレートに現れる。コロニー。これは、アデニン生合成経路における中間体の蓄積(すなわち、以前はアミノイミダゾールリボチドまたはAIRと呼ばれてきたP-リボシラミアミノアミノイミダゾール)に蓄積され、これは赤色顔料を形成するために変換される。定性的色ベースのADE2レポーター遺伝子は、その後、定量的なホタルホチホチピナスピラリス(LUC1)12、22に置き換えられました。最近では、ADE2レポーターはlacZレポーターと組み合わせることで、機能の残りのレベルに応じてP53変異体をサブ分類するために利用できる簡単に得点、半定量、ダブルレポーターアッセイを行っています。23.

EGFP(増強された緑色蛍光タンパク質)またはDsRed(ディスコスコスマsp. 赤色蛍光タンパク質)などの蛍光レポーターは、全ての誤解変異に関連するトランス活性化活性の定量評価にも使用されています。TP53コーディング シーケンス24.最後に、P53対立遺伝子発現の調節性プロモーターと、RE遺伝子および/またはレポーター遺伝子と異なる同種酵母株を組み合わせる可能性は、癌関連および生殖細胞系列の精製分類を生成するデータマトリックスの開発につながった。変異体P53ア列25、26、27.

上述のアプローチは、P53タンパク質の転写活性を測定するために使用される。しかしながら、酵母S.セレビシエ28およびシゾサッカロマイセスポンベ29における野生型P53の発現は、細胞周期停止28、30またはに関連している成長遅滞を引き起こす可能性がある。細胞死31.いずれの場合も、酵母増殖阻害は高いP53発現によって引き起こされ、細胞増殖に関与する内因性酵母遺伝子の転写変調の可能性と相関している。この仮説を支持して、機能喪失変異体P53 R273Hは、野生型P5332と同様のレベルで発現した場合、酵母細胞の増殖を妨げなかった。逆に、有毒変異体P53V122Aの酵母における発現(野生型P53と比較して転写活性が高いとして知られている)は、野生型P5332よりも強い増殖抑制効果を引き起こした。

さらに、ヒトMDM2が酵母におけるヒトP53転写活性を阻害し、そのユビキチン化およびその後の分解33を促進できることが実証された。従って、ヒトMDM2およびMDMXがP53誘発酵母増殖阻害を阻害する能力が32,34であった。追加の研究では、P53転写活性とアクチン発現レベルとの間に相関が確立され、酵母32におけるACT1遺伝子上流におけるP53 RE上流の同定が確立された。一貫して、アクチン発現は野生型P53によって増強され、さらにP53 V122Aによって強化されたが、変異型P53 R273Hでは増加しなかった。逆に、P53によるアクチン発現は、P53阻害剤MDM2、MDMX、またはピフィトリンα(P53転写活性の低分子阻害剤)の共存在において減少し、酵母増殖アッセイに基づく結果と一致する。重要なことに、これらの結果は、P53誘発成長阻害と酵母におけるその活性の程度との間に相関関係を確立し、P53機能を調節する小分子を同定し、研究することも利用されている28,34,35.

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プロトコル

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1. 特定のRE(yAFM-REまたはyLFM-RE)を含むADE2またはLUC1レポーター酵母株の構築

  1. yAFM-ICOREまたはyLFM-ICORE株12,14(ICORE=I、GAL1プロモーター下でのISce-Iエンドヌクレアーゼ;CO = カウンタ選択可能 URA3 ;RE = レポーター KanMX4カナマイシン耐性を与える;表 1)YPDA寒天プレート上の-80°Cで保存された15%のグリセロールストックから(表2)。30°Cで2〜3日間成長させてください。
  2. 新鮮なプレートから1つの酵母コロニー(生後3週間以内)を取り、YPDAの5mLを含む小さなフラスコに置きます(表2)。一晩30°Cでインキュベートし、150〜200 rpmで振ります。
  3. 翌日、デキストロースの痕跡をすべて除去し、3,000xgで2分間細胞をペレットし、チューブの反転により上清を廃棄する。
    注: このプロトコルのすべての遠心分離を室温(RT)で実行します。
  4. ガラクトース(表2)を含む予め温められたCM(完全な培地)の30〜50mLで細胞ペレットを再中断し、30°Cで4時間インキュベートし、150-200 rpmで振ります(I-SceIの誘導に必要)。
  5. 細胞を3,000 x gで2分間遠心分離し、チューブの反転によって上清を捨てます。
  6. 無菌水の30〜50 mLで細胞ペレットを再懸濁する。手順 1.5 を繰り返します。
  7. 無菌水の10mLで細胞ペレットを再懸濁する。手順 1.5 を繰り返します。
  8. 無菌LiAcTE(表3)の5mLで細胞ペレットを再懸濁し、DNA取り込みを好むイオン溶液である。手順 1.5 を繰り返します。
  9. 無菌LiAcTEの250 μLで細胞ペレットを再懸濁し、1.5 mLチューブに細胞を移します。ステップ1.5を繰り返し、無菌LiAcTEの300〜500 μLで細胞ペレットを再懸濁する。
  10. 洗浄中に、100°Cで10分間サケ精子DNAキャリアの10mg/mL溶液を変性し、一本鎖DNAとしてそれを維持するために氷の上ですぐに冷やします。
  11. 別の1.5mLチューブに、所望のオリゴヌクレオチドの500ピコモレ(表3)、沸騰したサケ精子キャリアDNAの5μL、無菌LiAcTE PEGの300μL(表3)、および酵母細胞懸濁液の50μL(ステップ1.9から)を加える。
  12. 10sのチューブを混ぜて30°Cで30分間インキュベートし、150-200 rpmで振ります。1.5 mLのチューブを側面に置き、揺れを好みます。
  13. 加熱ブロック内の42°Cで酵母細胞に15分間ヒートショックを与え、次いで10,000 x gで20sの細胞を遠心分離する。上清を取り出し、無菌水の1mLで細胞を再懸濁する。
  14. YPDA寒天プレート上の細胞懸濁液の100 μLを広げ、30°Cで1日インキュベート(逆さま)します。十分に分離されたコロニーが得られるように、また1:10希釈の100 μLを広げる。
  15. 翌日、デキストロースと5-FOAを含むCM寒天プレートに滅菌ビロードを使用したレプリカプレート(表2)。多くの細胞が転移した場合(URA3細胞の成長など)、新しいプレート上の2番目のレプリカプレートを検討してください。
  16. 3日後、G418を含む非選択的YPDAおよびYPDA上のレプリカプレート(カナマイシンに類似したアミノグリコシド系抗生物質)寒天板(表2)は、その後の比較を容易にする各プレートをマーキングする。プレートを30°Cで一晩インキュベートします。
  17. 翌日、G418感受性であるがYPDAプレート(例えば、yLFM-またはyAFM-REコロニー)上で成長するコロニーからの候補レポーター株を同定する。新しいYPDAプレート上で同定されたコロニー(3-6コロニー)をストリークして、単一のコロニー単離物を得て、30°Cで2日間成長させます。
  18. YPDAプレートに単一酵母コロニーをパッチし、コロニーを分離してさらなる分析を行います。30°Cで24時間後、小柄な変異体(すなわち、呼吸不全変異体)の増殖を防ぐYPGA寒天プレート(表2)上のレプリカめっきによってそれらをテストする。同時に、新しいYPDA寒天プレート上のレプリカプレート。
  19. 正しいパッチ(すなわち、YPDAおよびYPGA寒天プレートの成長;1-3コロニー)をステップ1.18からテストし、コロニーPCRによる正しいオリゴヌクレオチド統合の存在を調べます。10x PCRバッファーの5 μL(1.5 mM MgCl 2)、10ピコモレス/μLプライマーの2μL(表3)、2.5mMdNTPの4μL、5 U/μL Taqポリメラーゼの0.25 μL、および水を5μLの最終容積に加えて反応ミックスを組み立てます。スクリーニングする必要がある酵母コロニーの数に対する反応ミックスを乗算し、各PCRチューブに50 μLをアリコートします。ピペットを使用して、YPDA寒天プレートから非常に少量の酵母細胞を単一のPCR反応ミックスに加えます。
  20. 次のプログラムでPCR反応を行います:94 °C、94°Cで1分間の35サイクルの脱退、55°Cで1分間のプライマーアニーリング、72°Cで2分間延長。
  21. 反応が完了したら、PCR反応のアリコート(体積の約10分の1)をアガロースゲルにロードし、正しいサイズ(約500bp)を確認します。
  22. 市販キットで精製後のPCR産物を配列し、ステップ1.19の同じプライマーを使用して所望のRE配列の統合を確認する。
  23. 正しい配列の検証後、yAFM-REまたはyLFM-RE株培養物(YPDA)の15%グリセロールストックを作り、-80°Cに保存します。

2. 定性色系ADE2酵母アッセイを用いたP53タンパク質トランス活性化能の評価

  1. yAFM-RE ひずみを使用して手順 1.1 と 1.2 を繰り返します (表1)。
  2. 翌日、予め温められたYPDAの30〜50mLで細胞培養(1:10)を希釈し、OD600nmが0.8〜1.0(〜2h)に達するまで振ることによって30°Cでインキュベートし続ける。
  3. 手順 1.5-1.10 を繰り返します。
  4. 別の1.5mLチューブに、300〜500ngの酵母P53(または対照)発現ベクター(表4)、沸騰したサケ精子DNAキャリアの5μL、無菌LiAcTE PEGの300μL、および酵母細胞懸濁液の50μLを加える。
  5. 手順1.12と1.13を繰り返しますが、無菌水の300 μLで細胞ペレットを再懸濁します。
  6. 合成選択的(P53発現または対照ベクター)プレート上の細胞懸濁液の100μLを炭素源および高量アデニン(表2)として含有し、次いで2〜3日間30°Cでインキュベート(逆さま)する。
  7. 新しい選択的プレート上の単一酵母形質転換コロニー(プレートあたり2-6ストリーク)をストリークし、それらが30°Cで一晩成長させます。
  8. 翌日、無菌ビロードのレプリカプレートを使用して、色表現型の評価を可能にする新しい選択的プレート(すなわち、デキストロースを炭素源として含有するが、アデニンの量を制限するプレート;表2)プレートを30°Cで逆さまに3日間インキュベートします。必要に応じて、P53タンパク質の温度感受性を評価し、3日間3つの異なる温度でインキュベートする:24°C、30°C、および37°C。
    注: 同じストリークを複数回レプリケートできます。
  9. P53タンパク質トランス活性化能を評価するには、酵母コロニーの色ベースの表現型を確認し、P53野生型および空ベクター表現型に関してP53タンパク質表現型を比較する。

3. 定量発光系LUC1酵母アッセイを用いたP53タンパク質トランス活性化能の評価

  1. プロトコル2に記載のLiAcベースの方法を使用して、P53(または対照)発現ベクター(表4)を用いて酵母細胞を形質転換する。yLFM-RE ひずみ (表 1)を使用します。
  2. 炭素源としてブドウ糖を含むアデニンを多量に含む新しい選択プレート上に単一形形をパッチし、一晩30°Cで成長させます。変換タイプごとに、5~7種類のパッチを作成します。
  3. 一晩の成長の後、カーボン源としてデキストロースまたはラフィノースを含む合成選択培地でプレートから無菌爪楊枝またはピペット先端を使用して少量の酵母細胞を再懸濁する(透明な96ウェルプレートの最終容積200μL、丸みを有する)または平らな底)。実験に誘導可能なP53発現が必要な場合は、ラフィノース培地にガラクトースを加えて誘導レベルを調節する(表2)。
    注:これらの細胞懸濁液は、約0.4のOD600nmを持ち、1より高くする必要があります。
  4. マルチラベルプレートリーダーを使用して、誘導可能なP53発現(30°Cで4-8時間、150-200rpm振る)後のOD 600nmで各井戸の吸光度を測定します。セルサスペンションがマルチチャンネルピペットとよく混合して均質であることを確認します。
  5. 透明な96ウェルプレートからセル懸濁液の10-20 μLを白い384(または96)ウェルプレートに移し、同量(10-20 μL)のリシスバッファーと混合します。シェーカー(150〜200rpm)上のRTで10〜15分間インキュベートし、ルシフェラーゼ基板への細胞の透過性を達成する。
  6. ホタルルシフェラーゼ基板の10-20 μLを追加し、マルチラベルプレートリーダーで光単位(LU)を測定します。
  7. P53タンパク質トランス活性化能を決定するには、対応するOD600nm(相対光単位、RLU)に各ウェルのLUを正規化する。酵母形質転換コロニーの3-4パッチからの平均RLUと標準偏差を計算します。
  8. P53野生型および空ベクターに対するP53タンパク質トランス活性化データを比較し、空ベクターで得られた値を減算するか、空ベクターで得られた値で除算することによって(すなわち、誘導の計算倍)。
    注:P53トランス活性化活性は、P53相互作用タンパク質(すなわち、MDM2およびMDMX)および/または薬物治療を含む同じ実験セットアップを使用して評価することもできる。

4. 酵母表現性アッセイを用いたP53タンパク質増殖抑制の評価

  1. セクション2で説明するLiAcベースの方法を使用して、P53/MDM2/MDMX(または制御)発現ベクター(表4)を用いて酵母細胞を変換します。CG379株(表1)を使用し、最小選択プレートに酵母形質転換体を広げます(表2)。
  2. 変換細胞を最小選択培地(表2)で約1OD600nmに成長させる。
  3. 選択的誘導培地中の0.05 OD600nmに希釈酵母細胞(表2)、オプションで、選択した小分子を適切な濃度(または溶媒のみ)に添加し、変異体P53を活性化またはMDM2を阻害する場合にその有効性を試験する。/MDMX-P53 相互作用。
  4. 連続軌道揺れ(200rpm)下で30°Cで細胞をインキュベートし、約42時間(陰性対照酵母が中対数相に達するのに必要な時間、約0.45 OD600nm)。
  5. 最小選択プレート上の酵母細胞培養物の100 μLアリコートをスポット(表2)。
  6. 30°Cで2日間インキュベートします。
  7. 100μL培養滴(コロニー形成単位、CFUカウント)で得られたコロニーの数を数えることによって酵母の成長を測定する。例えば、酵母を発現する野生型P53の増殖を考慮した化合物の変異型再活性化効果を算出し(100%に設定)、変異型P53を発現する細胞の増殖(溶媒制御にさらされる)を表す。再アクティブ化のゼロレベル。

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結果

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の建設ADE2またはリュック1レポーター酵母株

デリト・ペルフェットアプローチ12、14、15、16は、P53レポーター酵母株の構築を可能にするように適合された(図1B)。この方法は、両端に、選択された統合の軌跡に相同である少なくとも30個のヌクレオチドを含む単鎖または二本鎖オリゴヌクレオチドを採用する。具体的には、相同...

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ディスカッション

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

酵母ベースのアッセイは、P53タンパク質機能の様々な側面を調べるのに有用であることが証明されています。これらのアッセイは、機能性多型の評価を含むRE標的部位の変異体に対するP53トランス活性化電位を評価するために特に敏感である。カラーレポーターの使用とルシフェラーゼアッセイの小型化は、費用対効果が高く、比較的スケーラブルなアッセイをもたらす。また、増殖抑制試験は、化学ライブラリースクリーニングに使用される可能性があり、吸光度の測定を通じて酵母細胞の生存率の定量を自動化します。ABCトランスポーターの細胞壁および作用による透過性は限られているが、薬物スクリーニングのために酵母を使用する場合の制限と考えられてきたが、取り込み性を改善するための遺伝子改変は22、65に成功して開発された。

哺乳類の細胞ベースのアッセイと比較して、酵母ベースのP53アッセイは、P53がより高い真核生物でその機能を調節する補因子およびシグナル伝達カスケード経路の驚くべき複雑さから分離しているこ...

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開示事項

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

著者は利益相反を宣言しない。

謝辞

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

我々は、欧州連合(FEDERファンドPOCI/01/0145/FEDER/007728プログラプラオペラファクターデ・コンペティティビダード-コンペティシダード-コンペティシダード)と国家基金(FCT/MEC、ファンダサン・パラ・ア・シエンシア・エ・テクノロジア、ミニステリオ・ダ・エドゥカサオ・エ・シエンシア)に感謝します。パートナーシップ契約 PT2020 UID/QUI/50006/2019 およびプロジェクト (3599-PPCDT) PTDC/DTP-FTO/1981/2014 - POCI-01-0145-FEDER-016581。FCTフェローシップ:SFRH/BD/96189/2013(S.ゴメス)この研究は、コンパニア・S・パオロ、トリノ、イタリア(プロジェクト2017.0526)と保健省(プロジェクト5x1000、2015、2016;現在の研究2016)によってサポートされました。テレサ・ロペス=アリアス・モンテネグロ博士(トレント大学実験科学教育研究所)に対し、ビデオ録画の支援に深く感謝します。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
L-アスパラギン酸SIGMA11189
QIAquick PCR 精製キットQIAGEN28104
L-フェニルアラニンSIGMA78019
ペプトンBD バクト211677
酵母 ex+A2:C26tractBD バクト212750
ディフコ酵母 窒素塩基 アミノ酸および硫酸アンモニウムBD なしTM233520
酢酸リチウム二水和物SIGMA517992
細菌寒天 A 型Biokar DiagnosticsA1010 HA
G418 二硫酸塩SIGMAA1720
硫酸アンモニウムSIGMAA2939
L-アルギニン一塩酸塩SIGMAA5131
アデニン半硫酸塩SIGMAA9126
パッシブ溶解バッファー 5xPROMEGAE1941
Bright-Glo ルシフェラーゼアッセイシステム PROMEGAE2620
5-FOAZymo ResearchF9001
D-(+)-ガラクトースSIGMAG0750
L-グルタミン酸SIGMAG1251
Dextrose SIGMAG7021
L-ヒスチジンSIGMAH8125
L-イソロイシンSIGMAI2752
L-リジンSIGMAL1262
L-ロイシンSIGMAL8000
L-メチオニンSIGMAM2893
PEGSIGMAP3640
D-(+)-ラフィノース五水和物SIGMAR0250
L-セリンSIGMAS4500
L-トリプトファンSIGMAT0271
L-トレオニンSIGMA T8625
ウラシルSIGMA U0750
L-バリンSIGMAV0500

参考文献

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
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