中大脳動脈から膜電位を記録する微小電極浸入法

Summary

この記事の主な目的は、マイクロ電極衝撃法を用いて中大脳動脈から膜電位(V m)を記録する方法の詳細を提供することである。カニューアル化された中大脳動脈は、筋原性のトーンを得るために平衡化され、血管壁は、高抵抗マイクロ電極を使用して突き刺さる。

Abstract

血管平滑筋細胞の膜電位(Vm)は血管の緊張を決定し、したがって臓器への血流を決定する。イオンチャネルおよび疾患状態でV_mを調節する電気原性ポンプの発現および機能の変化は、Vm、血管緊張、および血流を変化させる可能性がある。したがって、電気生理学の基本的な理解と、健康な状態や病気状態でVmを正確に記録するために必要な方法が不可欠である。この方法は、V_mを復元するために異なる薬理学的薬剤を使用してV_mを調節することを可能にする。いくつかの方法がありますが、それぞれ長所と短所がありますが、この記事では、マイクロ電極の衝撃法を用いて中大脳動脈などのカニューズ抵抗血管からV_mを記録するプロトコルを提供します。中大脳動脈は筋次室内で筋原性のトーンを得ることが可能であり、血管壁は高抵抗のマイクロ電極を使用して突き刺さる。V_m信号は、電気計を介して収集され、デジタル化され、分析されます。この方法は、細胞を損傷することなく、膜抵抗を変更することなく、血管壁のV_mの正確な読み取りを提供します。

Introduction

細胞の膜電位(Vm)とは、血漿膜全体のイオン電荷の相対的な差と、これらのイオンに対する膜の相対的な透過性を指す。V_mはイオンの微分分布によって生成され、イオンチャネルおよびポンプによって維持される。K⁺、 Na⁺、および Clなどのイオン チャネルは、休止 V_mに実質的に寄与します。血管平滑筋細胞(VSMC)は、4種類以上のK+チャンネル1、2種類の電圧ゲートCa2+チャンネル(VGCC)2、2種類以上のCl-^{チャネル3}を発現する。^4,5、店舗運営Ca²⁺チャネル6、ストレッチ活性化陽イオンチャネル7、8、および電気原性ナトリウム-カリウムATPaseポンプ9は、その全てがプラズマ膜内にあり、そのすべてがV_mの規制に関与する.

VSMCのV_mは内気圧に依存する。非加圧血管では、V_mは-50から-65 mVまで変化しますが、加圧動脈セグメントでは、V_mは-37から-47 mV¹⁰の範囲です。血管内圧の上昇は、VSMCが^脱分極11を引き起こし、VGCC開口の閾値を減少させ、筋因性^トーン12の発症に寄与するカルシウム流入を増加させる。逆に、受動血管または非加圧血管において、膜過分化は、高いK+チャネル活性に起因して、VGCCが開くことを防ぎ、その結果、カルシウム入り口が限られ、細胞内カルシウムの減少に寄与し、血管の調子¹³.したがって、内気圧の変化によるVmは血管緊張発達に重要な役割を果たしているように見え、VGCCおよびK+チャネルの両方がVmの調節において重要な役割を果たしている。

V_mは、血管の種類と種によって異なります。V_mは、モルモット優れた腸間膜動脈ストリップ14、60mmHgルーメン^圧力12におけるラット中脳動脈における-45±1 mV、および-35±1 mVのラット・パレンキマル動脈における40mmHgルーメン^圧15における-54±1mVである。伸ばされていないラットリンパ筋に記録された残りのV_mは、-48±2 mV¹⁶である。脳VSMCのV_mは末梢動脈よりも陰性である。これに対し、ネコ中脳動脈は約-70mVのVmを持つことが報告され、腸間膜および冠動脈はそれぞれ-49と-58 mV、それぞれ17、18を持つことが報告された。血管床間のVmの違いは、イオンチャネルおよび電気原性ナトリウムカリウムポンプの発現および機能の違いを反映しうる。

_Vmの増減は、それぞれ膜脱分極および過分極と呼ばれる。Vmにおけるこれらの変化は、イオンチャネルゲーティング、細胞シグナル伝達、筋肉収縮、作用電位伝播を含む多くの生理学的プロセスにおいて中心的な役割を果たす。一定の圧力では、K+チャネルを活性化する多くの内因性および合成血管拡張化合物が膜過分極を引き起こし、その結果、血管拡張1、13を生じる。逆に、持続的な膜脱分極は、アゴニスト誘発または受容体媒介血管^収縮19において不可欠である。V_mは、VGCC¹³を介して Ca²⁺流入を規制するだけでなく、内部ストア 20、21^およびCa²⁺の感度から Ca²⁺のリリースに影響を与える重要な変数です。収縮^装置22.

異なる細胞タイプからVmを記録する方法はいくつかありますが、カニュート容器のマイクロ電極衝撃法から収集されたデータは、単離されたVSMCから得られたデータよりも生理学的であるように見えます。現在のクランプ法を用いて単離されたVSMCから記録された場合、VmはVSMC²⁴における自発的過過極極と見なされる。分離されたVSMCはシンシチウムに含まれ、シリーズ抵抗の変化はV_mの振動挙動に寄与する可能性がある。一方、Vmが無傷の血管から記録された場合、振動挙動は観察されず、おそらく動脈内の同期体であり、安定したVm^{につながる血管全体に要約されるVSMC間の細胞接触によるものである。24.}したがって、標準的なマイクロ電極衝撃技術を用いて加圧容器からのVmの測定は、生理学的条件に比較的近い。

カニュート血管からのV_mの記録は、同期しているVSMCのV_mが血管の緊張と血流の主要な決定要因の1つであり、V_mの変調が拡張する方法を提供することができるので、重要な情報を提供することができます。血管を収縮させる。したがって、V_mの記録に関わる方法論を理解することが不可欠である。本論文では、微小電極浸漬法を用いた中脳動脈(MCA)からのVmの細胞内記録について述べている。このプロトコルは、MCA、マイクロ電極を調作し、電気計をセットアップし、V_mを記録する衝撃法を実行する方法を説明します。また、代表的なデータ、この方法を使用する際に発生した一般的な問題、および潜在的な問題について説明します。

Protocol

オスのラットはUMMCの動物ケア施設に収容され、実験動物ケア協会(AAALAC)の評価と認定が承認されています。動物は研究を通じて食べ物と水に自由にアクセスできました。動物は、24±2°Cの温度、湿度レベル60〜80%および12時間の光/暗いサイクルで制御された環境で維持された。すべてのプロトコルは、UMMCの動物ケアと使用委員会によって承認されました。

1. 設備の準備

1. 二重チャネル差動電気計アンプ(材料の表を参照)を容器室の近くおよび所望の位置に置きます。
2. アンプチャネルAまたはBの出力をBNC-BNCケーブルでデジタイザのチャンネル入力に接続します。
3. マイクロマニピュレータにプローブを取り付け、顕微鏡とミオグラフの近くに置きます。記録設定は、振動のないテーブルに取り付けなければなりません。
4. 説明されているように、アンプの前面にノブとスイッチを置き、この実験用に設定する位置に置きます。
5. 適切な電極を介してアンプの回路地面に浴場の接地を接続します。同様に、ケージがアンプのシャーシに接地されていることを確認します。

2. マイクロ電極の調製と組み立て

1. ホウケイ酸塩ガラスマイクロ電極(材料の表を参照)を使用し、8-10ミリメートルテーパ、<1 μmの直径と3 M KClで満たされたときに80-120 MΩの抵抗を持つためにガラス先端を引っ張ります。
   1. 次の設定を使用して、標準のプーラーを使用して短い段階的テーパを実現します: 熱 = 650。速度 = 20;プル = 25;時間= 250とより高い抵抗と小さな先端のために2回ループします。設定は器具固有のものとして、材料の表を参照してください。
      注:先端の直径<1 μmは、突き刺されたときに細胞への損傷を最小限に抑えます。
2. マイクロファイバーシリンジを使用してマイクロ電極を3M KClで充填します(材料の表を参照)。
   1. マイクロ電極に3M KClを注入しながらマイクロファイバーシリンジのプランジャーをゆっくりと引き上げ、流体が充填するスペースを確保し、マイクロ電極内部の気泡の形成を防ぎます。
   2. マイクロ電極を満タンにし、マイクロ電極ホルダーに入れる前に気泡がないことを確認してください。気泡が存在する場合は、指でマイクロ電極を軽くタップして気泡を取り除きます。
3. ケアを行使し、しっかりと退屈な穴を通してホルダーに電極シャンクを押し込みます。余分な液体が存在する場合は、組織でそれを削除します。
4. 電極ホルダーアセンブリをアンププローブに接続します。電極試験を行い、入力オフセットを調整し、ゼロ設定を確認し、アンプマニュアルに応じてプローブ入力漏れを確認します。
5. 表 1に示すように、電極試験を使用して電極抵抗を測定します。
6. 作動電極は、チャネル出力で1 mV/MΩの正のDC電圧シフトを表示します。一方、チャンネル出力とメーターに大きな電圧が現れた場合、これはブロック電極または壊れた電極を示します。
7. 記録ソフトウェアを開き、ファイルに名前を割り当て、保存ソフトウェアで将来の分析のために保存します。

3. 中大脳動脈の分離とカネレーション

1. 試薬を調製する。
   1. 表2に記載されているように、正常および低カルシウム生理塩溶液(PSS)を調記する。
2. 筋グラフを準備します。
   1. ミオグラフ室(材料の表を参照)を蒸留水で何度もすすいで、破片をなく。通常のPSSの5 mLでチャンバをロードします。
   2. 5-10 mLシリンジを使用して濾過された通常のPSSで両方のガラスカニューレを充填します。気泡を入れずにカニューレ全体と付属のチューブを注意深く充填してください。
   3. 鈍い鉗子を使用してそれぞれ半結び目で2つのモノフィラメントナイロン縫合糸(10-0、0.02ミリメートル)を準備します。
   4. 解剖顕微鏡下で解剖鉗子を使用して先端からわずか離れた両方のカニューレに部分的に閉じた縫合結び目を置きます。後でこれらの結び目は滑り落ち、容器をしっかり止めるためにカニューレの動脈の端に注意深く結びつくだろう。
3. 中大脳動脈を分離し、カニューレする。
   1. 2~4%吸入イソファルランを用いてスプラーグドーリーラットに深い麻酔を誘導する。
   2. 深い麻酔下でギロチンを使用してラットを切断します。
   3. 骨カッターとはさみを使って頭蓋骨を慎重に取り外します。
   4. 頭蓋骨から脳を取り出し、氷の上に低カルシウムPSSの5 mLに置く。
   5. スプリングハサミと鉗子を使用して、脳から内径100~200μmのラット中脳動脈(MCA)の分岐していない部分を同定し、解剖する。
   6. MCAを細かい鉗子を使用してガラスカニューレに取り付け、通常のPSSを含む筋グラフの縫合糸を締め付けることによって安全にする。
   7. 遠位カニューレを閉じて、MCA 内に流れが入らないようにします。
   8. 流入ピペットをPSSを保持する貯水池に接続して、インライン圧力トランスデューサで監視される内ルミナル圧力の制御を可能にします。
   9. 電荷結合デバイスカメラ(材料表を参照)を使用して、カニューテッドMCAを反転顕微鏡とイメージングソフトウェアに取り付けたカヌラリゼーションMCAを視覚化します。
   10. MCA の軸長を、剛体またはフラクシッドで見えないおおよその長さに設定します。
   11. O 2(95%)で浴液を平衡化CO₂ (5%)37 °Cで十分な酸素化、温度を提供し、7.4でpHを維持する。
4. インパール(細胞血漿膜に浸透)血管平滑筋細胞。
   1. 地上電極を接続し、ミオグラフのPSSに浸しておきます。
   2. 容器室を照らし、顕微鏡を通して、浴室溶液中のマイクロ電極の先端を可視化します。
      注:あるいは、イメージングソフトウェアを有するコンピュータ上のMCAおよびマイクロ電極を可視化することができる。
   3. マイクロマニピュレータのコントロールを使用して、微小電極の先端を血管の外壁に近づけます。マイクロマニピュレータとマイクロ電極の先端は、組織に対して安定した位置にある必要があります。
      注:実験を開始する前に、膜電圧が安定していることを確認してください。測定電圧が不安定な場合、電極とセルとの間の接続はシールされず、漏れを示す。
   4. 録音を開始します。
   5. マイクロ電極の先端を容器に向かってゆっくりと動かし、マイクロマニピュレータのコースまたは細かい制御を使用して容器の中心を目指す。
      注:時折、マイクロ電極先端が筋線膜に接触すると、記録中の小さなたわみが観察されることがある。
   6. 先端が血管に近接しているとき、マイクロマニピュレータを使用して電極を前方に進め、筋肉の膜を突き刺す。
   7. この時点で、記録されているV_mの変化を観察し始めることができます。マイクロ電極が細胞の膜を押し付けるときは、マイクロマニピュレータに触れないでください。
      注:記録電極と基準電極の電圧差は、血管内圧またはその他の興奮性または抑制刺激のレベルに応じて、0 mV から -40 mV から -75 mV の間に減少します。これらの測定値は、現在の細胞の膜電位差を特徴付します。
   8. 正確な測定を得るためにVSMCを傷つけることなく、容器の異なる領域の単一の容器に複数の衝撃を行います。
   9. 記録後、マニピュレータを使用して、マイクロ電極を1つの迅速な動きで除去します。
   10. 記録を停止し、さらなる分析のためにデータファイルを保存します。

Results

提示された方法は、Vmをカニューレド容器に記録するために確実に使用することができる。MCAを脳から分離する方法を説明する簡単な手順を図1Aに示す。頭蓋骨から脳を分離した後、MCAを解剖し、低カルシウムPSSを含むペトリ皿に入れた。取り付けられた結合組織の一部も、分離中のMCAの損傷を防ぐためにスプリングハサミと鉗子を使用してMCAと一緒に解剖した。慎重に、結合組織も除去され、解剖されたMCAは筋グラフに移る準備ができていた。MCAはカニューレに取り付けられ、筋グラフのカニューレの両端に縫合結び目を使用して結ばれた。一般的なマイクロ電極インパレメント法の設定の概略図を図 1Bに示します。3M KClで満たされたマイクロ電極をプローブ内のホルダーを介して電気計に接続した。電気計のチャンネル出力は、BNC-BNCケーブルを用いてデジタイザのアナログ入力チャンネルに接続した。デジタイザ出力は、記録ソフトウェア内の信号を可視化するためにオシロ...

Discussion

この記事では、カニューレト容器調製物からV_mを記録するために鋭いマイクロ電極の衝撃法を使用する方法に関する必要な手順を提供します。この方法は広く使用され、実験的な質問の広い範囲に答えるV_mの高品質で一貫した記録を提供しています。

メソッドを確実に成功させるために、いくつかの重要な考慮事項とトラブルシューティング手順について説明します。マイクロ電極の品質(その鮮明さと抵抗)とそれが浸透する細胞プロセスは、V_mの安定性と精度に影響を与えます。信号が連続的にドリフトする場合、またはアンプの記録範囲の上または下にある場合は、電極がブロックされているか、先端が壊れている可能性が最も高いです。衝撃が部分的、不十分、またはセルに損傷を与えるだけの場合、記録された電位は0 mVに戻り、不安定な信号または信号なしになります。場合によっては、セルの内容物が非常に高い抵抗電極を遮断することもできる。これらの問題はすべて、電極を新しい電極に置き換えるだけで克服できます。

成功した衝撃を...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
解剖器具
Aneshetic Vaporiser	Parkland scientific	V3000PK
Dissection microscope	Nikon Instruments Inc., NY	Eclipse Ti-S
Kleine Guillotine Type 7575	Harvard Apparatus, MA	73-198
Littauer Bone Cutter	Fine science tools	16152-15
Moria MC40 超微細鉗子	ファイン サイエンス ツール	11370-40
手術用ハサミ シャープ ブラント	ファイン サイエンス ツール	14008-14
縫合	ハーバード 装置	72-3287
バンナス スプリング ハサミ	ファイン サイエンス ツール	15018-10
電気生理学 機器
電荷結合素子 カメラ	Qimaging, , BC	Retiga 2000R
差動電位計 増幅器	WPI	FD223A
インライン圧力トランスデューサ	Harvard Apparatus,	MA1 72-4496
Micromanipulator	Thor labs	PCS-5400
Microelectrodes	Warner Instruments LLC, CT	G200-6、
マイクロフィル(マイクロファイバーシリンジ)	WPI	MF28G67-5
マイクロ電極ホルダー	WPI	MEH1SF
筋グラフ	リビングシステム計装、VT	CH-1-SH
プーラー	サッター インストゥルメント、カリフォルニア州サンラファエル	P-97
振動フリー テーブル	TMC	3435-14
SoftwaresClampex
10	分子デバイス
p Clamp 10	分子デバイス
イメージングソフト	ニコン, NY	NIS-elements
Chemicals
NaCl	Sigma	S7653
KCl	シグマ	P4504
MgSO4	Sigma	M7506
CaCl2	Sigma	C3881
HEPES	Σ	H7006
グルコース Σ		G7021
NaH2PO4	Sigma	S0751
NaHCO3	Sigma	S5761