ペプチド濃縮と質量分析によるタンパク質ユビキチン化部位の検出

ユビキチンからタンパク質への結合は、プロテアソームによる分解を示すものであり、プロテオスタシスにおいて重要なプロセスです。ユビキチンのC末端カルボキシル基は、標的タンパク質^11,22のリジンε-アミノ基とイソペプチド結合を形成する。また、ユビキチンは他のユビキチンモジュールに付着することができ、その結果、均質(すなわち、K48またはK11)または分岐(すなわち、不均質または混合)のポリウビキチン構造^11、33の形成をもたらす。ユビキチンの最もよく知られた機能は、プロテアソーム分解におけるその役割であり、K48結合ポリウビキチンによって媒介される。しかし、モノ-とポリユビキチン化の両方が、プロテアソームによる分解とは無関係な多くのプロセスにおいて役割を果たしていることも明らかになっている。例えば、K63連結鎖は、細胞内密売、リソソーム分解、キナーゼシグナル伝達、およびDNA損傷応答^44,55において非分解的役割を有する。他の6つのリンケージタイプはあまり豊富ではなく、その役割は依然としてほとんど謎めいているが、細胞内のそれらの機能に関する最初の徴候は、主にリンケージ特異的検出^66、77を可能にする新しいツールの開発のために出現している。

質量分析はプロテオーム解析に欠かせないツールとなっており、現在では、事実上あらゆる生物学的源から数千種類の異なるタンパク質を1回の実験で同定することができます。複雑さの追加の層は、タンパク質活性を調節することができるタンパク質の翻訳後修飾(PTM)のタンパク質(例えば、リン酸化、メチル化、アセチル化、ユビキチン化)によって提示される。PTMを含むタンパク質の大規模同定は、質量分析分野の発展によっても可能となっています。PTMを持つペプチドの比較的低い化学測定は、その非修飾の対応物と比較して技術的な課題を提示し、一般的に質量分析の前に生化学的濃縮ステップが必要です。過去20年間、PTMの分析のためにいくつかの異なる特異的な濃縮方法が開発されました。

細胞内のタンパク質ユビキチン化の多面的役割のため、タンパク質⁸上のユビキチン化部位の検出のための分析方法の開発に大きな需要がある。^,質量分析法の適用は、フルーツフライ、マウス、ヒト、および酵母タンパク質^{,,9、10、11、12、13、1410,}中の⁹同定されたユビキチン化部位の数の爆発に至^った。¹¹¹²¹³主要なステップは、K-ε-GGレムナントモチーフ('diglycine'または「diGly」とも呼ばれる)に対する抗体を用いたペプチドレベルでの免疫沈降ベースの濃縮戦略の開発によって提示された。これらのdiGlyペプチドは、プロテア^{ーゼ15、16,16}としてトリプシンを使用してユビキチン化タンパク質の消化時に産生される。

ここでは、眼窩質量分析法による免疫精製とその後の検出を用いて、diGlyペプチドを濃縮するための最適化されたワークフローを提示する。既存のワークフローのいくつかの変更の組み合わせを使用して、特にサンプル調製および質量分析段階で、プロテアソームで処理されたHeLa細胞の単一サンプルから23,000以上のdiGlyペプチドを日常的に同定できるようになりました。阻害剤および、治療されていないHeLa細胞から〜10,000。このプロトコルは、細胞培養中のアミノ酸による標識のない安定同位体(SILAC)のHeLa細胞と脳組織などの内因性サンプルの両方に、このプロトコルを適用しました。

このワークフローは、深いユビキチノメを明らかにするために、ユビキチン化部位の分析のためのツールのレパートリーに貴重な追加を提示します。次のプロトコルは、ワークフローのすべての手順を詳細に説明します。

ここに記載されているすべての方法は、エラスムスMCの制度的動物のケアと使用委員会(EDC)によって承認されています。

1. サンプル準備

1. 培養細胞
   1. 目的の細胞株(例えば、HeLaまたは骨肉腫[U2OS]細胞)を選択し、10%の熱不活性化ウシ胎児血清(FBS)および100単位/mLペニシリン/ストレプトマイシンを補ったDulbeccoのミニマルイーグルミディアム(DMEM)の細胞を成長させます。
   2. 定量的プロテオミクス実験の場合、アルギニンおよびリジンを欠いたDMEMの培養細胞。培地は、10%透析ウシ胎児血清(FBS)、100単位/mLペニシリン/ストレプトマイシン、およびアラニン-グルタミンを添加する必要があります。従来のリジンとアルギニン('ライト'ミディアム)またはリジン^-8(13C₆₎のいずれかを加えて、2種類のメディアを作ります。¹⁵N₂) とアルギニン-10 (¹³C₆;¹⁵N₄)('ヘビー'ミディアム)、それぞれ。
   3. 軽い媒体(すなわち、標識されていない)および重媒体(すなわち、標識されていない、SILAC)の細胞の培養バッチは、重媒体培養中のすべてのタンパク質が重い安定同位体を含む重い安定同位体で標識されていることを確認するために、拡張および処理前に少なくとも6倍の倍増を行うアミノ酸。
   4. プロテアソーム阻害剤ボルテゾミブの10μMまたはDMSOの同等の体積を模擬処理として8時間の細胞を処理します。PBSで細胞を洗浄し、1%トリプシン/EDTAを使用して細胞を解約し、細胞をペレット化します。
   5. 2 mLの氷冷50 mM Tris-HCl(pH = 8.2)で0.5%デオキシコール酸ナトリウム(DOC)で試験した条件ごとに1つの150 cm²培養プレートから細胞ペレットをlyseします。95°Cで5分間にライセートを沸騰させ、10分間超音波処理(材料表に記載されている超音波処理器の場合は「H」を設定)4°Cで沸騰させます。N-エチルマレイミド(NEM)などのデビキチナーゼ阻害剤の使用は、ペプチド同定を複雑にする望ましくないタンパク質修飾を導入する可能性があるため、お勧めしません。
2. インビボマウス脳組織
   1. 生体組織で使用する場合、100 mM Tris-HCl(pH=8.5)、12 mMナトリウムDOC、および12 mMナトリウムN-ラウロイサルコシン酸ナトリウム¹⁷を含む氷冷緩衝液中の組織をライスする。4°Cで10分間のライセート(材料表に記載されている超音波処理器の「H」を設定)を超音波処理し、95°Cで5分間煮沸します。
3. 着色吸光度BCAタンパク質アッセイキットを用いて、全タンパク質量を定量化します。タンパク質の総量は、正常なdiGlyペプチド免疫沈降(IP)のために少なくとも数ミリグラムでなければなりません。SILAC実験では、軽い標識タンパク質と重い標識タンパク質を、総タンパク質量に基づいて1:1の比率で混合します。
4. 50°Cで30分間5mM 1,4-ジチオスライトを使用してすべてのタンパク質を還元し、その後、暗闇の中で15分間10 mMヨードアセトアセトアミドでアルキル化します。Lys-C(1:200酵素対基質比)でタンパク質消化を4時間行い、続いてトリプシンによる一晩の消化(1:50酵素対基質比)を30°Cまたは室温(RT)で行います。
5. 消化したサンプルにトリフルオロ酢酸(TFA)を加えて、最終濃度の0.5%にし、遠心分離機を100分間10分間、すべてのg洗剤を沈殿させ、除去します。その後の分画のためにペプチドを含む上清を集める。

2. オフラインペプチド分画

1. 高pH逆相(RP)C18クロマトグラフィーをポリマー定常相材料(300Å,50 μM;材料表を参照)を空のカラムカートリッジに装填してトリプティックペプチドを分画します。定常相ベッドサイズは、分画されるタンパク質消化量に調整する必要があります。タンパク質消化の約10 mgのために、0.5 gの定常相材料で満たされた空の6 mLカラムカートリッジ(材料表を参照)を準備します。タンパク質の消化と定常相比は約1:50(w/w)である必要があります。
2. 準備したカラムにペプチドをロードし、約10カラムの体積0.1%TFAで洗浄し、続いて_H2Oの約10カラム量を洗浄します。
3. ペプチドを10mMアンモニウム・フォーマット溶液(pH=10)の10カラム量(pH=10)をそれぞれ7%、13.5%、50%アセトニトリル(AcN)で3つの分数に溶出します。すべての分画を完全に凍結乾燥させます。
4. ユビキチン残骸モチーフ(K-ε-GG)抗体をタンパク質Aアガロースビーズに結合させ、diGlyペプチドの免疫強化のために使用してください。ビーズのバッチあたりの抗体の正確な量は、独自の情報であり、メーカーによって開示されていないので、混乱を避けるためにメーカーが行うビーズのバッチに同じ定義を使用することをお勧めします。これらのビーズ2xの1つのバッチをPBSで洗浄し、ビーズスラリーを6等分に分割します。実験計画の詳細については、図 1を参照してください。
5. ステップ2.3で採取した3個のペプチド画分を、50 mM MOPS、10 mMリン酸ナトリウム、および50 mM NaCl(pH=7.2)からなるバッファーの1.4 mLに溶解し、破片をスピンダウンします。
6. 分画の上澄み物をdiGly抗体ビーズに加え、回転ユニットの4°Cで2時間インキュベートします。ビーズをスピンダウンし、上清を抗体ビーズの新鮮なバッチに移し、4°Cで2時間再びインキュベートします。
7. その後のグローバルプロテオーム(GP)解析のために上清を保存します。
8. すべての端数から200 μLピペットチップに、GF/Fフィルタープラグを装着してビーズを保持します。ピペットチップとビーズを入れて、遠心分離機の先端アダプターを装備した1.5 mLマイクロ遠心分離チューブに入れます。200 μLの氷冷IAPバッファーでビーズ3を洗い、その後200 μLの氷冷ミリQ H₂Oで3倍に洗い、洗浄ステップごとに2分間200 x gでカラムをスピンダウンしますが、カラムを乾燥させないように注意してください。0.15%TFAの50 μLの2サイクルを用いてペプチドを溶出する。
9. C18段チップ(基本的には2枚のC18ディスクを持つ200μLピペットチップ)を使用してペプチドを脱塩し、真空遠心を使用して完全に乾燥させます。

3. ナノフロー LC-MS/MS

1. ナノフローLCシステムに結合された感度の高い質量分析計でLC-MS/MS実験を行います。
2. CSH130樹脂(3.5 μm、130 Å)を詰めた75 μmの内径を備えた社内梱包された50cm逆相カラムを使用し、120分以上の勾配を持つペプチドを120 nL/minで溶出します。たとえば、カラムオーブンを使用して列を50°Cに保ちます(資料表を参照)。
3. 質量分析解析を実行します。
   1. 質量分析計は、データ依存型取得(DDA)モードで動作する必要があります。MS1質量スペクトルは、4E5の自動ゲイン制御(AGC)ターゲット設定とOrbitrap質量分析計の場合の最大射出時間50msの高分解能(例えば、120,000)で収集する必要があります。
   2. まず「最高強度第一」モードで質量分析を行います。このように、最も強いイオンが断片化のために最初に選択され、次に2番目に高いイオンが選択され、合計サイクル時間が3秒の最高速度法を使用します。続いて、「最低強度第一」モードでDDA MS解析の第2ラウンドを実行し、最も強いイオンが最初に選択され、次に2番目の最低イオンが選択されるようにします。この戦略は非常に低いバンドバンタンシーペプチドの最適な検出を保障する。
   3. 前駆体イオンを充電状態(2~7電荷)とモノアイソトピックピーク割り当てに従ってフィルターします。前に尋問された前駆体を動的に除外し、4重極質量フィルタを1.6Thの幅に設定したペプチド前駆体を分離する。
   4. 最大射出時間50 ms、HCD衝突エネルギー30%の7E3のイオントラップでMS2スペクトルを収集します。

4. データ分析

1. アンドロメダ検索エンジン^18、19,19に基づいて自由に利用可能なMaxQuantソフトウェアスイートなどの適切な検索エンジンを使用して、質量分析生ファイルを分析します。MaxQuant で、以下に示すいくつかの適応を使用してデフォルト設定を選択します。トリプシンに酵素特異性を設定し、切断の最大数を3に上げる。リジンをdiGly残骸(+114.04 Da)、メチオニンおよびN末端アセチル化の酸化を可変的な修飾として設定し、システインのカルバミドメチル化を固定修飾として設定する。
2. たとえば、Uniprot リポジトリ (https://www.uniprot.org/downloads) からダウンロードしたタンパク質配列を含む FASTA ファイルに対して、MaxQuant によって自動的に提供されるおとりと標準的な一般的な汚染物質データベースと組み合わせてデータベース検索を実行します。偽発見率(FDR)を1%に設定し、変更された(diGly)ペプチドの最小スコアを40(デフォルト値)に設定します。さらなる分析からC末端ジグライジン残基で同定されたペプチドを除外する。
3. SILAC実験ファイルの定量分析では、多重度を「2」に設定し、ステップ4.2を繰り返します。
4. MaxQuantソフトウェアスイートのペルセウスモジュール²⁰で、すべての下流分析(統計、遺伝子オントロジー分析など)を実行します。

ユビキチン化されたタンパク質は、タンパク質がトリプシンで消化されると、標的リジン残基に114.04ダジグリシン残骸を残します。このモチーフによって引き起こされる質量差は、質量分析実験においてユビキチン化の部位を明確に認識するために用いられた。ここで説明する戦略は、ナノフローLC-MS/MSによるdiGlyペプチドの濃縮とその後の同定のための最先端の方法である(図1A)。本研究では、培養細胞と生体内物質の両方をタンパク質の生物学的供給源として使用したが、このプロトコルはタンパク質の任意の供給源と互換性がある。プロトコルの手順に従って、タンパク質入力の2〜20 mgから10,000-25,000 diGlyペプチドを同定することは簡単であるべきです。細胞中のユビキチン化の程度を増大させるために、ボルテゾミブまたはMG132のようなプロテアソーム阻害剤は、細胞を収穫する数時間前に添加することができる。プロテアソーム阻害剤を使用しなかった場合、同定されたジグリペプチドの数は有意に低い(30〜40%)傾向があった。

既存のプロトコルを改良しました。まず、ペプチド混合物の複雑さを軽減するために、逆相クロマトグラフィーとその後のpH溶出に基づく粗分分法を3画分に行う。これらの画分は、ペプチド同定において極めて低い重複を示しており、かつ、同程度の数のdiGlyペプチドを1画分当たりに同定すべきである(図2)。これにより、これらの各画分で同定されたユニークなdiGlyペプチドの数が多くなります。重要なことに、分画の1つ(通常は第2)はユビキチン自身のK48修飾トリプティックディグリーペプチドLIFAGK(GG)QLEDGR(m/ z 730.39)を含むべきです。これは免疫沈降画の中で最も豊富なペプチドであり、LCクロマトグラムにおける強烈で広いピークによって特徴付けられる(図1B)。これはベンチマーククロマトグラフィーピークであり、それがクロマトグラムに存在しない場合、IPは最も失敗した可能性が高い。

もう一つの改善は、DDA分析手順の適応である質量分析計におけるイオンルーティング多極である。従来の上位Nデータ依存的取得(DDA)では、MS1スペクトルからのNピークが断片化のために選択される。この断片化スキームは、最初に最高強度のピークから始まり、次に2番目に高い強度のピークが続きます。別の断片化スキームでは、最も強いピークが最初に選択され、次いで2番目に強いピークが続きます。この選択順序の背後にある根拠は、非常に低い豊富なペプチドを断片化するのに十分な時間があることです。実際、標準的なDDA設定(すなわち、最高の最初)を持つ重複したLC-MS分析と比較して、「最も高い最初」および「最も低い最初の」DDA実行を組み合わせると、ペプチド同定の数が増加することがわかりました。したがって、より包括的なユビキチノミムプロファイリングでは、LC-MSの実行をデータ分析手順で「最も高い最初」と「最も低い最初」の断片化レジームと組み合わせることをお勧めします。この「最も低い最初の」戦略は、従来のDDA政権のみが使用されたときに検出されなかった、追加の4,000個以上のユニークなdiGlyペプチドを生成することができます(図2)。

最後に、最初のIPの後のフロースルーの追加IPは、別の〜2,500個のユニークなdiGlyペプチドを生成することができます(図2)。

ユビキチン化プロファイリングに関する文献の記事は、通常、12,21の同定されたdiGlyペプチドの約,2110,000を報告する。12ここでは、3つの生物学的複製スクリーンで同定されたすべてのdiGlyペプチドのうち、3つのすべてに>9,000が存在し、>17,000は3つの反復のうち少なくとも2つ存在していた(図3)。典型的には、ここで説明するプロトコルに従って、1つの標準的なバッチのCST抗体ビーズを用いて、1つの15〜20mgのタンパク質サンプルから>21,000個のユニークなdiGlyペプチドを同定する必要があります。純度と選択性の観点から、同定されたdiGlyペプチドと未修飾ペプチドの比率は常に>0.5である必要があります。ジグリーペプチド同定の数は、タンパク質入力物質の量に大きく依存していた。約2,500個のジググリーペプチド同定を生成した入力材料の1mgのみで行われたIPは、10mgのタンパク質入力物質>15,000 diGlyペプチド同定を行った。表1は、各条件について同定されたdiGlyペプチドの期待数を示す。なお、これらの数値は推定のみであり、使用する質量分析計の種類に依存する。図4は、入力材料の低、中、および高い量とのdiGlyペプチド同定の重複を示す。

また、上記のユビキチン化部位解析の改善の付加価値を示すため、プロテアソーム阻害剤ボルテゾミブで処理したSILAC標識HeLa細胞の定量的ユビキチノミック解析を、重複ラベルスワップアッセイ中の未処理対照細胞と比較して行った。半分以上(>55%)IPの際に溶出物中の全ての同定されたペプチドの、ジグリーペプチドであった。19,000個以上のユニークなdiGlyペプチドが同定され、これは非SILAC標識サンプルよりもわずかに少ない。この理由は、ペプチドピークペアの存在のために、SILACアッセイにおけるMS1スペクトルの複雑度が高くなることがあります。SILAC分析では、前方状態で排他的に同定されたジグリペプチドの数(すなわち、重いチャネルでボルテゾミブ処理細胞、軽チャネル内の制御細胞)と逆の状態で排他的に同定されたもの(すなわち、軽チャネルのボルテゾミブ処理細胞、重いチャネルの制御細胞)との間には比較的大きな違いが認められた。MaxQuantソフトウェアを「多重度=2」(すなわち、2チャンネルSILAC)モードで動作させると、7,555個のdiGlyペプチドが重いチャネルでゼロ強度(事実上すべて逆実験に来る)と光チャネルのゼロ強度値で同定された。対照的に、単一のdiGlyペプチドは、光チャネルにゼロ強度値を伴う重いチャネルにおいて非ゼロ強度値で同定されなかった。同じデータセットに対するMaxQuant分析を「多重度=1」モードで行い、1つの可変修飾にジグリ部分と標識アミノ酸を組み合わせて、そのペプチドの軽いペプチドの対応が検出できなかったとしても、多くの重いジグリーペプチド変異体が同定されました。これの最も可能性の高い説明は、ソフトウェアが重いチャネルに排他的に存在するdiGlyペプチドの同定に対処できないことです。プロテアソームの阻害が新規ユビキチン化部位の形成を引き起こすので、この現象は広範囲に起こる可能性がある。これらの問題に対処するために開発され、これを修正する必要があるMaxQuantの「requququfy」オプションチェックボックスをオンにすると、この問題を完全に回避するには不十分です。明らかに、diGlyペプチドの大部分はプロテアソーム阻害時にアップレギュレートまたはデノボ形成されているが、ペプチドプールの3分の2以上が少なくとも1.5のH:L比を有するため(図5B)。

最後に、このユビキチン化部位解析法を生体内組織試料に適用した。有効性を評価するために、新鮮なマウス脳から約32mgのタンパク質を抽出した(湿った組織の重量の約10%はタンパク質である)。脳材料は、プロテアソーム阻害剤または全体的なタンパク質ユビキチン化を高めることができる他の試薬で治療されなかった。このサンプルから、10,871個のユニークなdiGlyペプチドが同定された(補足表2)。この組織で同定されたすべてのdiGlyペプチドは、定常状態の状態でユビキチン化の内因性部位に由来する。世界的なユビキチン化を高める(例えば、プロテアソーム阻害)する治療法は課されなかった。したがって、これらのユビキチン化部位,は、文献5、16、2216で提案されたアイデアと一致している非プロテアソーム媒介細胞シグナル伝達事象に関与する(ポリ)ユビキチン化から少5なくとも部分的に生じると仮定する。22

結論として、ここで説明する方法は、再現可能な方法でユビキチノメの詳細な探査を可能にする。この手順で得られる典型的な結果の概要については、 Van Der Walら23を参照してください。

図1:実験の概要(A) 実験的アプローチの概要サンプルを調製し、トリプシン化し、高pH溶出を伴う逆相クロマトグラフィーを用いて3つの分画に分画した。市販のα-diGlyペプチド抗体ビーズの1つのバッチを6つの等分に分割し、3つのペプチド画分をビーズ画分の3つにロードした。このジグリーペプチドを免疫精製、溶出、回収し、その後、フロースルーを残りの3つの新鮮なビーズ画分に移した。収集されたdiGlyペプチドは、最も強烈なピークがペプチド断片化のために最初に選択された1つのサイクルと、最も強いピークが最初に選択された次のサイクルを組み合わせた2層スキームに従って、Lumos Orbitrap質量分析計上の質量分析によって分析された。次に、nLC-MS/MS 実行の完全なセットを MaxQuant を使用して分析しました。(B) 分数の一つはユビキチン自身の K48 修飾トリプティックディグリーペプチド LIFAGK(GG)QLEDGR (m/z 730.39) を含む必要があります。これは免疫沈降画の中で最も豊富なペプチドであり、120分勾配で50〜55分の間のLCクロマトグラムの強烈で広いピークによって特徴付けられました。このベンチマークピークがクロマトグラムに存在しない場合、IPは失敗した可能性が最も高かった。この図は、ファン・デル・ウォルら23から変更されています。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

図2:3つの改善ステップのそれぞれについて検出されたdiGlyペプチドの数。(A) 免疫沈降前の粗分化の効果3つの別々の画分で同定されたdiGlyペプチド集団間の重複が示される。(B) 第1及び第2のインキュベーションステップの効果。(C)調整されたペプチド断片化レジーの結果。この図は、ファン・デル・ウォルら23から変更されています。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

図3:3つの生物学的複製物のボルテゾミブ処理細胞において検出されたDiGlyペプチドは、ラン間の重複量を示す。この図は、ファン・デル・ウォルら23から変更されています。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

図4:同定されたdiGlyペプチドの重複は、低(4mg)、培地(10mg)、および高(40mg)の総タンパク質入力量を有する分析から。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

図5:SILAC標識細胞におけるジグリーペプチドの検出。(A)SILAC標識HeLa細胞の順方向および逆条件で検出されたペプチドの数を多重度設定1および2に対する。(B) ボルテゾミブ(Btz)処理HeLa細胞におけるジグリーペプチドSILAC比の散布図前方と逆の両方の実験で同定され、定量されたペプチドのみが示されています。この図は、ファン・デル・ウォルら23から変更されています。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

表1:異なる条件に対するdiGlyペプチド同定の期待数。これらの数値は推定値のみであり、使用される実験設定に依存します。

補足表 1.こちらの表を表示するには、ここをクリックしてください (右クリックしてダウンロードしてください)。

補足表 2.こちらの表を表示するには、ここをクリックしてください (右クリックしてダウンロードしてください)。

著者らは利益相反を宣言しない。