肺胞マクロファージの貧食能およびマウスにおける細菌クリアランス

サマリー

ここでマウス肺胞マクロファージおよび肺から細菌クリアランスの貪食能を分析するための一般的な方法を報告します。これらのメソッドは、フルオレセイン イソチオ シアン酸ビーズの貪食および緑膿菌緑色蛍光タンパク質の生体内で貪食能を検討します。マウスで膿をクリアするための方法について述べる。

要約

肺胞マクロファージ (AMs) は、肺の肺胞腔をガードします。AMs によって貪食病原体、死んだ細胞や異物の除去に侵入戦防衛で重要な役割を果たしている、炎症反応、組織改造の解像度では、処理の様々 な表面の受容器によって仲介されます。AMs。ここで、in vitro および in vivo アッセイおよび実験的戦略を使用してパターン認識受容体-、補体受容体 - と受容体を介した Fc ガンマを区別する AMs の貪食能の分析方法を報告します。貪食。最後に、我々 は確立し体内細菌クリアランスを評価するためにマウスで膿性肺炎モデルを特徴付ける方法をについて説明します。これらの試金は午前の機能を評価する最も一般的な方法を表し、マクロファージの機能と他の臓器に細菌クリアランスの勉強にも使えます。

概要

AMs は、休止期、1 つ認識を介して免疫反応の主要なプレーヤーと吸入の病原体や異物^1,2の内面化、肺胞で主要な居住者食です。午前貪食の欠乏はしばしば呼吸の結果、AMs が膿やクレブシエラ肺炎^3,4など多くの肺病原体の迅速なクリアランスに欠かせないことが報告されています。などの感染症、急性肺炎死亡率と罹患率を引き起こす。

AMs は、サイトカインやケモカイン TNF α、il-1、ケモカインを生成し、炎症性好中球、単球を集める歯槽の環境の他の細胞のクロストークなどを生産することによって肺で生得的な炎症反応を開始するも、肺⁵適応免疫細胞。たとえば、AMs によって生成される il-1 は主要な上皮細胞⁶から好中球ケモカイン CXCL8 のリリースに役立ちます。また、AMs はアポトーシス多形核白血球 (Pmn) の貪食能、周囲の組織、組織の損傷の結果、長期の炎症細胞内酵素の持続的な漏出につながる Pmn からの失敗に貢献します。^7,

プロトコル

このプロトコルの制度的動物ケアおよび使用委員会 (IACUC) 東バージニア医学校のガイドラインに従います。

1. 蛍光ビーズ貪食

1. マウスを安楽死させる (c57bl/6 j、6 週齢、女性) 動物の倫理的な安楽死のため IACUC プロトコルに従って CO₂窒息により。
2. ペーパー タオルで覆われて解剖基板上腹のマウスを置きます。その手足をイナバウアーで前足をダウンピンし、その気管がまっすぐ配置されて、戻ってくる、その頭をプルする前に歯とレベル下で文字列をフックします。
3. マウスの喉、胸、腹を 70% エタノール消毒や毛皮がツールにくっつかないように濡れています。
4. 定期的な鉗子を使用すると、体の中心線で皮膚を引き上げ、喉の上に中心線を手術用はさみでカットします。
5. 標準的な外科はさみの鈍い端を使用して、慎重に喉の筋肉や結合組織を離れ、春はさみ (刀) を使用して、気管を公開します。
6. 軟骨輪を鉗子で把持、慎重に気管の心室の顔に、刀を用いた小切開 (~1.5 mm) を行い 18 G カニューレを気管に挿入します。
7. 優しく洗浄リン酸緩衝生理食塩水 (PBS)、一度に 1 mL を 3 mL。たびには優しく注射器と肺に reinfuse に、羊水を抜き取る連続 3 x。BALF を収集した後、安楽死できるように頚部転位を実行し....

結果

まずマウスで貪食能を分析する実験を行った主な AMs。すべての解析を通して WT ・ TRIM72^KOマウスから分離した AMs を比較しました。図 1Aのように、蛍光顕微鏡プライマリ AMs 発生 1 時間後のマウスで FITC ガラスビーズの貪食能を明らかにしました。図 1Bは、フローサイトメトリーによる貪食の分析を示しています。貪食能の定量化測定顕微鏡やフローサイトメトリーはそれぞれ図 1Cと図 1Dで表されます。図 2Aで MH S 細胞による貪食を媒介 FcγR と CR を表し.......

ディスカッション

ガス交換機能を実行している間肺永続的異物、病原体、およびアレルゲンを直面しています。AMs は、主な機能、すなわち貪食のおかげで防衛の最初の行を提供します。AMs はまた他の免疫細胞が病原体を破壊して炎症の解像度を調整します。ここでは、具体的にはマウス肺から分離された AMs によって貪食能を評価する方法について述べる。本稿で提示されたプロトコルは、マクロファージの機能と他の臓器に細菌クリアランスの勉強にも使えます in vivo と in vitro 貪食の詳細な研究を説明します。

説明の in vitro 貪食 FITC ビーズの血清治療の培養のシンプルなアイデアに依存しているまたはオプソニン貪食を開始する培養 AMs の SRBCs。このメソッドには、広範な洗浄の手順と背景を減らすために nonphagocytized 赤血球の溶解が含まれます。付着の AMs を切り離すことには、注意が必要です。ACK 換散ソリューションを含む洗浄ステップを行う必要があります 1 分以内として長く洗濯時間につながる大食細胞の換散。

また.......

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
18-G ニードル	ニプロメディカル	CI+1832-2C	分子生物学グレード
2,7-ジアミノフルオレン (DAF)	Sigma-Aldrich	D17106	分子生物学グレード
70% エタノール	Decon Labs Inc.	18C27B	分析グレード
96ウェルプレート	Corning	3603	細胞生物学グレード
ACK 溶解バッファー	Life Technologies	A10492	分子生物学グレード
Alexa fluor-488 Zymosan-A-bioparticle	サーモフィッシャーサイエンティフィック	Z23373	分子生物学グレード
C5 欠損血清	Sigma-Aldrich	C1163	生化学試薬
遠心分離機	Labnet International	C0160-R
Cytospin 4 Cytocentrifuge	Thermofisher Scientific	A78300101 Issue 11
DMEM Cell Culture Media	Gibco	11995-065	Cell Biology grade
FBS	Atlanta Biologicals	S11550	Cell Biology grade
Flowサイトメーター	BD Biosciences	FACSCalibur
Flow Jo ソフトウェア	FlowJo, LLC
鉗子	デュモン	0508-SS/45-PS-1	実験動物の解剖に最適
FITCカルボキシル化ラテックスビーズ	Sigma-Aldrich	L4530	細胞生物学グレード
GFP-P. aeruginosa	ATCC	101045GFP	適しているfor 細胞感染アッセイ
ガラス底皿	MatTek Corp.	P35G-0.170-14-C	細胞生物学グレード
高圧シリンジ	ペンセンチュ	リーFMJ-250	実験動物用に適しています
ホモジナイザー	オムニインターナショナル	TH-01
過酸化水素	シグマ・アルドリッチ	H1009	分析グレード
倒立蛍光顕微鏡	オリンパス	IX73
ケタミン塩酸塩	Hospira	CA-2904	医薬品グレード
Shandon Kwik-Diff Stains	Thermofisher Scientific	9990700	細胞生物学グレード
LB 寒天	フィッシャー Scientific	BP1425	分子生物学グレード
LB ブロス	フィッシャー サイエンティフィ	BP1427	分子生物学グレード
MicroSprayer エアロゾライザー	ペンセンチュリー	IA-1C	実験動物の使用に適した
パラホルムアルデヒド	Sigma-Aldrich	P6148	試薬グレード
PBS	Gibco	20012-027	細胞生物学グレードの
ウサギ 抗SRBC-IgG	MP Biomedicals	55806	免疫アッセイ
抗SRBC-IgM	シダーラインラボラトリ	CL9000-M	免疫測定に適した
ハサミ	Miltex	5-2	実験動物の解剖に適した
小動物喉頭鏡	ペンセンチュ	リーLS-2	実験動物での使用に適した
ドデシル硫酸ナトリウム(SDS)	BioRad	1610301	分析グレードの
スプリングハサミ(Med)	ファインサイエンスツール	15012-12	実験動物の解剖に適しています
春のはさみ(小)	ファインサイエンスツール	91500-09	実験動物の解剖
に適した羊の赤血球(SRBC)	MP Biomedicals	55876	洗浄、保存された SRBC
尿素	Sigma-Aldrich	U5378	分子生物学グレード
キシラジン	Akorn Animal Health	59399-110-20	医薬品グレード

ック ウサギーズ