ゼブラフィッシュの先天性ストレスを研究する行動的アプローチ

サマリー

本稿では、大人のゼブラフィッシュのストレス行動を測定する簡単な方法について述べる。このアプローチは、ストレス状態にあるときにゼブラフィッシュがタンクの下半分を好むという生来の傾向を利用している。また、アッセイと薬理学を結合するための方法についても述べる。

要約

生物の生存には、ストレスの多い刺激に適切に対応することが不可欠です。広範な研究は、ストレス関連疾患や精神疾患の広い範囲で行われている, まだより良い治療法を開発するために、ストレスの遺伝的およびニューロンの調節への研究はまだ必要とされています.ゼブラフィッシュは、変異とトランスジェニック線の大規模なコレクションが存在するので、ストレスの神経基盤を調査する強力な遺伝的モデルを提供する。また、ほとんどの薬物は水に直接加えることができるため、薬理学はゼブラフィッシュに容易に適用することができます。ここでは、ゼブラフィッシュの先天性ストレス応答を研究する方法としての「新規タンクテスト」の使用について説明し、抗不安薬の可能性をどのように検証できるかをアッセイで示します。この方法は、遺伝的変異を保有するゼブラフィッシュラインや、精密な神経回路を操作するためのトランスジェニックアプローチが用いられるものを容易に結合することができる。試金はまた他の魚モデルで使用することができる。ともに、記述された議定書は他の実験室へのこの簡単な試金の採用を促進すべきである。

概要

ストレス応答は、潜在的に有害または嫌悪刺激から生じる行動および生理学的状態を変化させる。ストレス反応は動物界全体で保存され、生物¹の生存にとって重要です。数十年にわたる研究は、ストレス状態の根底にある遺伝的およびニューロンのメカニズムに関する知識を大幅に拡大しました。今日、扁桃体および線条体²のような脳の領域、および副腎皮質刺激放出ホルモン(crh)、およびグルココルチコイド(gr) および鉱質コルレセプター のような遺伝的因子 (mr) は、広く^3,4,5,6を研究されています。これらの重大な所見にもかかわらず、ストレスの遺伝的およびニューロン調節については未知のままである。このように、多くのストレス関連障害は治療法の欠如に苦しむ。

遺伝的に不可モデル生物は行動の遺伝的およびニューロン制御の研究に有用なツールを提供する。魚のモデルは、特に、非常に強力です: 彼らは短い世代の小さな生物であり、実験室での使用は容易なであり、それらのゲノムは容易に改変されており、脊椎動物として、遺伝的なだけでなく、neuroanatomical も共有しているその哺乳類の対応物^7、8との相同性。応力を測定するための標準アッセイは、遺伝子変異を保有するゼブラフィッシュラインまたは正確なニューロンサブセットの操作が可能であり、単一の遺伝子または定義されたニューロンの影響を迅速かつ効率的に評価することができます。

行動は、ストレス応答は、超活性または長時間の非活動 (「凍結」に類似した) の期間として魚を特徴とすることができ、⁹、調査¹⁰の減少、急速な呼吸、食物摂取の減少¹¹、およびタンク¹²の底のための場所を好みます。例えば、なじみのない水槽に入れたとき、大人のゼブラフィッシュや他の小さな魚のモデルは、タンクの下半分の初期設定を示していますが、時間が経つにつれて、魚はほぼ均等な周波数¹²で上面と下半分を探索し始めます。不安を軽減することが知られている薬物を有する成人の治療は、魚をすぐ上半分の^10,13を探索します。逆に、不安を増加させる薬物は、魚がタンク^12、14、15の下半分に強い嗜好を示す原因となる。従って、タンクの下半分のための減らされた調査そして好みは圧力の簡単で、信頼できる徴候である。

ほとんどの脊椎動物と同様に、魚のストレス応答は、視床下部-下垂体-腎間軸の活性化によって駆動されます (HPI; 哺乳類における視床下部-下垂体-副腎 [HPA] 軸に類似)^14,16.視床下部のニューロンホルモン副腎皮質刺激放出ホルモンを発現します (CRH) 下垂体への信号, 順番にリリース副腎皮質刺激ホルモンを解放 (ACTH).ACTH は次に、抗腎腺にシグナルを送り、コルチゾールを産生して分泌し、これは、下流標的¹⁶の数を有し、それらのうちの1つは、 crhを産生する視床下部ニューロンのネガティブフィードバック^3、17、 ^18、19。

ここでは、先天性ストレスの行動尺度を評価する方法について述べる。挙動については、新規タンク潜水試験^12,14を用いて詳細なプロトコールを行う。その後、既知の抗不安薬であるブスピロンがストレスの行動測定を減少させることを例として示します。

プロトコル

プロトコルは、機関の動物のケアによって承認されており、Committeeat フロリダアトランティック大学を使用しています。

1. 準備

1. 行動学的研究を行うための孤立した部屋を指定するか、または孤立するように部屋のセクションを閉じる。
   注: 部屋は、魚の正常な動作を中断することを避けるために、乱されず、低トラフィックでなければなりません。
2. 以下の材料・装置を行動室に移す:(i) カメラとレンズ、(ii) レンズに取り付けることができる赤外線フィルター、(iii) カメラスタンド、(iv) カメラ取得ソフトウェアを搭載したコンピュータ、(v) しっかりとした安定したテーブルでアッセイを実施on、(vi) 赤外線ライト (IR ライト; 850 nm または 940 nm)、(vii) 記録タンクの長さよりも長い白色アクリルディフューザー (viii) 1.8 L 台形プラスチックアッセイタンク (「新規タンク」と称される。ここで使われているのは12×18インチ)、(ix) 魚系水のバケツ。
   注: 新しいタンクのために、私達の実験室は形で台形である商業的に利用できるプラスチック容器を、使用する。タンクの寸法は、x 9 の約6です (詳細寸法は図 1Aをご利用ください)。我々が使用するディフューザーボードは、新規のタンク (12 in x 18) よりもわずかに大きいです。新規のタンク実験は、矩形または異なる台形寸法^20、21を有するものなどの異なる形状を有するタンクで実施されている。通常、魚の行動は、その寸法に関係なく、すべてのタンクで似ています: すべてのコンテナのために、魚は最初は下半分を好むが、時間が経つにつれて、より大きな周波数で上半分を模索し始めます。
3. カメラのレンズに赤外線フィルターを取り付けます。赤外光ストリップの波長は、典型的には 850 nm から 940 nm の範囲です。このフィルタは、720 nm 未満の波長の光をカメラに通すロングパスフィルタです。
4. カメラの集録ソフトウェアに適したパラメータを選択します。ほとんどの録画では、カメラの集録を30フレーム/秒のレートに設定し、録音時間を10分にします。
   注: これらのパラメータは、実験によって異なる場合があります。例えば、新規のタンク^22,23において馴化を研究し、より長い記録が必要とされてもよい。

2. セットアップ

注: このセクションのステップでは、新規のタンクアッセイの設定について説明します。最終製品の図は、図 1Bに示されています。

1. テーブルの真ん中に新しいタンクを置きます。
2. タンクの後ろに赤外線ライトを置き、タンクと LED 光源の間に白いアクリルシートまたはディフューザー画面を配置します。
   1. それは最大限に Led から来る光を拡散するようにディフューザーを配置し、光の強度は、新しいタンクを照らすのに十分です。ボードが光源に近ければ近いほど、ライトは明るくなりますが、拡散は少なくなります。これとは対照的に、拡散板を光源から離して配置すると、光の強度は低下しますが、光はよりよく広がります。
3. 新しいタンクの約4分の3を魚系の水で満たしてください。
   注: システム水は水道水の逆浸透を用いて生成され、その後、導電率は900±100μ s、pH は中性 (7.2)、温度は27±1° c である。
4. カメラをカメラスタンドに取り付け、カメラをコンピュータに接続します。ビデオ取得ソフトウェアを開き、タンクの前面に向くようにカメラを調整し、新しいタンク全体が見えるようにし、ビデオに隠された領域がないことを確認します。タンクと赤外線ライトは、カメラを通して観察したときにタンク全体に十分かつ照明があるように調整してください。
   注: 実験に進む前に、多くの場合、魚のビデオがキャプチャされ、トラッキングが実行される試運転を実行するのに役立ちます。これにより、セットアップは動作の実験に十分であることが保証されます。

3. 新規タンクテストセットアップ

1. 魚系水を事前に充填した 250 mL ビーカーと、少なくとも2つの保持タンクを準備します。
2. 試験の朝に、魚施設からの各実験条件 (コントロールと実験大人) に使用されるように、少なくとも10匹の成人ゼブラフィッシュを保持タンクに移し、それらを行動室に移し、少なくとも1つのために順応させることを可能にする時間。
   注: パワー解析は実験の前に実行する必要がありますが、私たちの手には、通常、統計的な有意性を検出するのに n = 10 で十分です。さらに、保持タンクは、水のリットル当たり5個体を含むべきではありません。ゼブラフィッシュ成人が新しいタンク²²の30分以内に慣らすことが示されているように1時間の順化が十分である。また、行動リズムは概日プロセスの影響を受けるため、異なる曜日に行われる実験の反復は同じ時間内に実行されるべきである。通常は、午前11:00 から午後6:00 の間のすべての実験を実行します。
3. 動物の状態または遺伝子型が実験者に盲目であるようにタンクにラベルを付けます。
   注: 実験は、文字または数字のシステム (すなわち、1つのタンクに ' A '、別の ' B ' のラベルが付けられているなど) を使用して水槽にラベルを付けることによって簡単に目がくらむことができます。実験に関与していない当事者は、そのようなシステムでタンクにラベルを付け、事後分析が完了するまで、実験者から id をマスクします。
4. ネットを使用して、ステップ3.1 からの予め充填されたビーカーにシングルアダルトを静かに配置する。大人の魚がビーカーに10分間順応するのを許す。
   注意: セックス固有の違いを探すために重要なポスト分析であるかもしれないので、大人の性別を記録します。
5. ビーカーに馴化した後、水と大人をビーカーから静かに注ぐことによって新規のタンク (セクション1にセットアップ) に魚を導入する。
6. 新しいタンクに大人を導入した後、カメラの記録を開始し、魚への追加の苦痛を防ぐために、セットアップから離れて移動します。
7. 録音が終了したら、新しいタンクから個体を取り外し、新たな保持タンクに入れます。
   注: 同じ個人で繰り返されるテストを防ぐためにステップ3.2 の1からの異なった保持タンクは使用されるべきである。
8. すべての動物がテストされるまで、各大人のためのステップ3.4 に3.7 を繰り返します。
   注意: 盲目の状態または遺伝子型に加えて、試験をランダム化する。乱数ジェネレーター、またはトライアル間でランダム化できる任意のツールを使用します。これは、実験を開始する前に各試行が決定されるように、実験の前に行う必要があります。
9. すべてのテストの終了時に、魚の施設に戻って魚を返します。

4. 薬物による前処理

注: 以下のステップの目的は、薬物の使用の前と後の個体の行動を比較することです。この比較は、最初にステップ3.4 〜3.6 のように新規のタンク試験を行い、続いて薬物処理を行い、次いで第2の新規タンク試験を行うことによって達成される (図 3a)。

1. ポジティブおよびネガティブコントロールを含む、薬物の原液を準備します。
   注意: 薬は、以前に文献に使用されている場合, 適切な作業量を見つけて、これを使用.たとえば、代表的な結果のブスピロンの場合、100倍の原液を作成し、文献^13、20に記載されているように、最終濃度として 0.05 mg/mL を使用します。推奨用量が不明である場合、用量応答曲線は、いくつかの濃度を調べることによって実行されるべきである。薬物の連続希釈でより多くのビーカーを設定します。薬剤を水に溶解性ない場合は、ジメチルスルホキシド (DMSO) を溶媒として使用する。
2. システム水と 250 mL ビーカーの作業濃度に薬を希釈します。たとえば、100x ソリューションを作成した場合は、1:100 をシステムの水に希釈します。コントロールとしてシステム水だけでビーカーを設定します。
   注: DMSO をステップ3.1 で溶媒として使用した場合は、コントロールビーカーに等量の DMSO を使用してください。
3. 他の研究者の助けを借りて、薬物とコントロールビーカーの正体を隠して、テスターが事後分析まで治療条件に目をつぶっていることを確認します。
   注: 数字または文字システムを使用することができます。
4. 次のステップ3.1 〜3.6 に従って新規のタンク試験を行い、ベースライン行動ストレス応答を得た。
5. ベースライン記録後、ステップ4.2 に記載されているように、ネットを使用して、新規タンクから成体魚を直ちに除去し、薬物またはビヒクルを投薬したビーカーに入れる。大人が10分間ビーカーに留まることを許可する。
   注: 薬のクロス汚染を防ぐために、ネットがビーカーの水に触れないようにしてください。使用する薬剤に応じて適切な投与量と投与時間を確保します。.10分の治療時間は、すべての薬のために働かないかもしれません.
6. 処理後、ネットを使用してステップ4.5 のビーカーから大人を取り出し、新鮮なシステム水のみで満たされた別のビーカーに入れます。これは、第2の新規タンク試験中にさらなる投薬を最小化するための休薬期間である。大人がさらに10分間洗浄ビーカーに滞在することができます。
   注: 薬物による望ましくないクロス治療を防ぐために、各薬剤の状態に別々のネットを使用する必要があります。実験が望むなら、ウォッシュアウト期間はスキップされるかもしれません。
7. 前のステップでビーカーからその大人を除去することにより、新たなタンクダイビングテストを実行し、新しい新規のタンクに入れ、ステップ3.5 に3.6 に従ってください。
8. 2番目の新しいタンクテストの後、個別の保持タンクに個人を削除します。第二の小説タンク内のシステム水を注ぎ、次のテストのための新鮮なシステム水でそれを埋めます。このステップは、任意の薬物のクロス汚染を防止します.
   注: 薬物の半減期に応じて、薬物を含む新鮮なビーカーを3時間ごとに行う必要があります。ブスピロンのために、新鮮なソリューションを3時間ごとに作ります。さらに、ステップ3.8 のノートに続いて、試験はコントロールと薬物治療の間で無作為化されるべきです。
9. すべての試験の終了時に、個人を魚施設に戻します。
   注意: 使用される薬物の種類に応じて、これらの治療の個人への影響は長続きすることができます。そのため、他の実験ではこれらの個体を使用しないでください。

5. ビデオ分析

1. すべての試験の後、選択の追跡ソフトウェアにビデオファイルをロードします。
   注: 我々は通常、市販のトラッキングソフトウェアを使用しますが、いくつかの自由に利用可能なソフトウェアパッケージを使用することができます。追跡を達成するための手順は、使用するソフトウェアパッケージによって異なる場合があります。
2. ビデオからの静止フレームを使用して、(i) 水で満たされている新しいタンクアリーナ全体と、(ii) トップ3、(iii) の中間3、および (iv) タンクの下三分の一の周りに架空の境界を定義します。これらを使用して、魚が新しいタンクの各部分で費やされた時間を確立します。
3. ステップ5.2 で定義された各アリーナについて、フレームあたりの x-y 変位を計算します。
4. タンクの上部、中央、および下部の領域を定義します。各領域は、サイズが類似している必要があります。これらの領域を決定するための簡単な方法は、y 方向のタンクの長さを計算し、これを3で割ることです。
   注: 一般プロトコルに対するバリエーションは存在します。たとえば、一部のラボでは、3分の2の代わりに半分を使用します。
5. 各アリーナで費やされた時間、距離、および速度を決定します。
   注: ほとんどの追跡パッケージでは、ユーザーに対して自動的に計算が行われます。ただし、トラッキングソフトウェアではない場合は、x-y 変位値から簡単に計算することができます。たとえば、距離は次の式を使用して決定できます。
   
   と速度は、次の式に基づいて決定することができます。
   
6. ステップ5.2 を5.4 に繰り返して、すべての試行のトラックと測定値を取得します。
   注: この一般的なプロトコルに対するバリエーション

6. 正規性の検定

1. 統計的な差異の計算に進む前にデータを実行します。データが通常、シャピロウィルクテストを使用して配布されているかどうかを確認します。
2. データが正規分布しているという帰無仮説が棄却された場合 (つまり、データがガウス分布に従っていない場合)、非パラメトリック検定を使用してすべての検定を実行します。逆に、データが正規分布に従うことが判明した場合は、パラメトリック検定の使用に進みます。
   注: 当社は統計を実行するために市販のソフトウェアを使用しています。ただし、R プログラミング言語を使用することもできます。シャピロ-ウィルク分析は R のシャピロ. テスト機能を使用して行うことができます。

結果

ゼブラフィッシュのストレスを調べる
野生型ゼブラフィッシュにおける経時ストレス挙動を調べるために、新規タンク試験において AB 株²⁴から成体魚を試験した。AB 成人は、上記のようなプロトコールを受けた。簡単に言えば、魚は行動室のタンクに 1-h 順応期間を与えられました。個体は、10分間ビーカーに入れ、その後、新鮮なシステム水で満たされた不慣れなタンク (新規タンク) に穏やかに配置しました。運動活性を10分間記録し、市販のソフトウェアを用いてトラッキングをオフラインで行った。最初と最後の分の間の運動活動の比較は劇的な相違を示した (図 2A、B)。最初にタンクに導入されたとき、魚は一番下 (図 2b) の時間の大半を過ごしましたが、時間が経つにつれて、大人はトップに費やされた時間の量が徐々に増加しました (

ディスカッション

ゼブラフィッシュは、新規のタンクで強いストレス反応を示す
ここでは、成人のゼブラフィッシュにおけるストレス応答を調べるための簡単な行動アプローチについて説明し、薬理学を用いた単純なストレス測定としてアプローチを検証する。

この新規タンク試験は、ゼブラフィッシュ及びその他の魚種^{12、14、21、35、36}、およびゼブラフィッシュの先天性ストレスを調べるために広く使用されている試験であり、強力な不安関連薬の薬理学的効果を調べるモデル。ヒトと同様に、これらの研究は、ブスピロン、ニコチン、フルオキセチン、およびスコポラミンのような薬物がゼブラフィッシュ^12、

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
カメラ			エドモンド・オプティクスのレンズ付きUSB カメラ Point Grey Grasshopper3 を使用しています。
赤外線フィルター	エドモンド・オプティクス
ビデオアクイジションプログラム			アクイジションフレームレートを設定できるため、VirtualdubやFlyCaptureなどのプログラムを使用してください。
赤外線LEDライト
アッセイタンク	アクアニアリング	部品番号 ZT180	サイズ:M3 1.8リットル
スタンドとクランプ、またはカメラ
250mLビーカー
トラッキングソフトウェア			私たちはノルダス情報技術からEthovision XT 13を使用しています
ブスピロン塩化	物Sigma-Aldrich	B7148
ランダム化試行発生器			Microsoft ExcelのRANDBETWEEN関数を使用します

用標準三脚