方法論記事

世界的な細胞のマトリックスメタロプロテアーゼと 3 D ゲルの代謝活性を測定

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DOI：

10.3791/59123

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2019年1月22日

 , 
1Department of Biomedical Engineering, The Ohio State University, 2The Ohio State University Comprehensive Cancer Center, Arthur G. James Cancer Hospital and Richard J. Solove Research Institute, 3Biomedical Technology Department, King Saud University

この記事について

サマリー

カプセル化、poly(ethylene glycol) (PEG) ゲル修飾と蛍光マトリックスメタロプロテアーゼ (MMP) の細胞を培養するためのプロトコルを提示するここでは、-分解性ペプチド。携帯電話の MMP と代謝活性は、標準的なマイクロ プレート リーダーを使用したハイドロゲルの文化から直接測定されます。

要約

しばしば三次元 (3 D) 細胞培養システムが、生体内での細胞および機能をより密接に要約するので、二次元 (2 D) の伝統文化システムよりも。しかし、三次元培養における細胞機能の測定より困難頻繁です。多くの生物学的アッセイは、3 D の文化で困難なことができる細胞材料の取得を要求します。この課題に対処する方法の 1 つは材料内の細胞機能の測定を有効にする新しい材料を開発します。ここでは、96 ウェル フォーマットで 3 D ゲルにおける細胞外マトリックス マトリックスメタロプロテアーゼ (MMP) の活性の測定の手法を提案します。このシステムで蛍光の MMP 分解センサー poly(ethylene glycol) (PEG) ハイドロゲルに修飾します。細胞遊走は蛍光強度に比例して、標準的なマイクロ プレート リーダーで測定することができます。96 ウェル フォーマットにこのアッセイの小型化アッセイの前 24 ウェルのバージョンと比較して条件ごとに 80% 50% と試薬の使用によって実験のセットアップに必要な時間の短縮。この試金はまた細胞機能の他の測定と互換性です。たとえば、代謝活性アッセイは、ここで示します同じハイドロゲル内の MMP 活性測定を同時に行なうことができます。ヒトメラノーマ細胞播種密度アッセイの作業範囲の適切なカプセル化の密度を決定するセルの範囲にわたってカプセル化でアッセイを発揮します。カプセル化細胞の 24 h 後 MMP と代謝活性の読み出し、細胞播種密度に比例します。1 つ出来る分解蛍光基質でアッセイをここで発揮、間分析と方法論はさまざまなハイドロゲル システムや他の蛍光センサーの適応かもしれません。このようなアッセイは、さまざまなアプリケーションのための実用的で効率的かつ簡単にアクセスできる 3 D 培養プラットフォームを提供します。

概要

三次元 (3 D) 培養システム多くの場合より密接に二次元 (2 D) の伝統文化システムよりも生体内の細胞応答を要約、いくつか優れた出版物1,2,3を参照.しかし、細胞の機能を測定する三次元培養システムを利用して携帯電話の検索の難しさのために挑戦している、さらに処理のサンプルします。この難易度は、3次元培養システムで多くの細胞機能の測定を制限します。この困難を克服するために新しい技術が必要な 3 D 環境内で細胞機能の簡単な測定を可能にします。この必要性に対処する方法の 1 つは、3 D 細胞培養のサポートだけでなく、また、細胞の機能を測定するセンサーを組み込む材料の開発です。たとえば、いくつかのハイドロゲル システムは蛍光プロテアーゼ分解部分 3 D 環境4,5,6,7内プロテアーゼ活性の可視化を有効にするを組み込まれています。一方、これらのシステムは、もともと顕微鏡イメージングのために利用された、これらのシステムも 3 D で細胞機能の簡易測定を有効にする標準的なプレート リーダーを使用してグローバル ・ マトリックス マトリックスメタロプロテアーゼ (MMP) の活性用適応できます。環境8。

Mmp、亜鉛プロテアーゼのスーパーファミリーは、正常組織の恒常性と多くの疾患で重要な役割を果たします。Mmp が低下して細胞外マトリックス (ECM) を改造、サイトカインと細胞表面受容体を切断、他 Mmp の9,10をアクティブにします。Mmp は、関節炎、動脈硬化、アルツハイマー病、および癌 ( 9,10,11のレビューを参照してください) などの疾患、創傷治癒など生理学的なプロセスで重要な役割を果たします。癌で高い MMP の発現は癌の転移と予後不良12相関します。さらに、Mmp は、癌細胞の浸潤や移行、本質的に 3 D 現象13,14細胞プロセスを促進することによって腫瘍の進行に貢献します。したがって、基礎生物学的研究や薬剤のスクリーニングの試金など、多くの場面で 3 D 培養の MMP 活性を測定することに関心があります。

ペグ ゲルは、高含水率により 3 D 細胞培養、タンパク質吸着と可変自然への抵抗のため活躍しています。ペグ ヒドロゲルは、細胞接着を促進する増殖因子 β (TGF-β)の変換などの成長因子のテザリングを直接 RGD、RLD と IKVAV のような ECM 擬態ペプチドなど直接セルに関数、鎖の数と機能されて15,16。最近では、PEG ヒドロゲルよく5,8と細胞機能の測定を可能にするセンサー ペプチド修飾されてが。具体的には、ペグ ハイドロゲル システムの使用は修飾と蛍光標準プレート リーダー 3 D 培養細胞の MMP 活性の測定 MMP 分解ペプチドを有効に、それ以上の処理は必要ありません。これらのシステムは、細胞機能、代謝活性を含む他の測定。蛍光の MMP 分解ペプチド修飾 3 D ペグ ハイドロゲルとこれの使用のために必要な最初の最適化実験を示す示された結果で培養された細胞の MMP 活性の測定のためのプロトコルの説明ここでは、試金。ひと悪性黒色腫細胞 (A375) された播種アッセイの作業範囲内にある適切な播種密度を決定する量の範囲で蛍光ゲルでカプセル化されます。カプセル化の 24 h 後 MMP と代謝活性を標準的なマイクロ プレート リーダーを用いた測定しました。次に、MMP 活性アッセイの線形範囲内播種密度を決定するための代謝活性と正常化しました。最後に、得られた結果の再現性を反映するようにトリプリケート間変動パーセンテージ (%cv) のプレート内の係数を求めた。このメソッドには、シンプルで高速な 3 D 細胞培養、および最小限のサンプル処理とプロテアーゼ活性の簡易測定ができます。

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プロトコル

1. ハイドロゲル コンポーネントの準備

  1. 8、フルオレセイン蛍光分子としてや、クェンチャーとして dabcyl 活用他前述の蛍光プロテアーゼ分解性ペプチドを合成します。10 mM の濃度の DMSO のペプチドや凍結融解の繰り返しを避けるために小さい (〜 30 μ L) 因数で-80 ° C の冷凍庫に保管を溶解します。
    注: これらのペプチドは、市販も購入できます。このプロトコルには、ハイドロゲル ポリマー ネットワークに共有結合結合を有効にするペプチド配列の C 末端のシステインが必要です。
  2. 8 腕 40 kDa ポリ (エチレング リコール) アミン (PEG) の準備-ノルボルネン (NB) として説明17。1H NMR を使用して 90% 以上の最後のグループ化を確認します。溶かしてペグ NB 滅菌リン酸バッファー生理食塩水 (PBS) 25 %w/v で (~ 300 μ L) 因数で-80 ° C の冷凍庫に保管してください。
    注: PEG 修飾ノルボルネンは商業的また購入することができます。
  3. 18を他の場所で説明されているように光開始剤リチウム フェニル 2,4,6 trimethylbenzoylphosphinate (ラップ) を合成します。68 mM の濃度に滅菌水でラップを溶解し、(~ 300 μ L) 因数で-80 ° C のフリーザーで保存します。
    注: Irgacure (2-Hydroxy-4′-(2-hydroxyethoxy)-2-methylpropiophenone) は光開始剤として使用することができます別の方法として。ラップと Irgacure は、商業的に購入することができます。
  4. それぞれ、ペプチド MMP 分解 (KCGPQG↓IWGQCK) 架橋剤と滅菌水 200 mM と 100 mM の濃度で細胞接着ペプチド (CRGDS) を溶解し、(~ 300 μ L と 〜 30 μ L)-80 ° C のフリーザーに保管因数、それぞれ。

2. 分析メディアの準備

  1. 熱不活化準備、炭剥奪 MMP の試金のためのウシ胎児血清 (FBS)。
    注: FBS のプロテアーゼは MMP の試金; 高いバック グラウンド信号を作り出すことができます。したがって、熱不活化し、炭に勧めアッセイ メディアの FBS をストリップします。
    1. 55 ° C で 30 分間加熱による政府短期証券の 100 mL を不活性化します。
      注: FBS の 100 mL は、早かったと将来の使用のための-20 ° C で保存のためここで利用されました。小さいボリュームは、必要に応じて使用できます。
    2. FBS (約 5 mL) の少量に 0.25% デキストランの活性炭と 0.025% の w/v の w/v を加え、スラリーが形成されるまでをかき混ぜます。FBS の残りの部分を追加し、55 ° C で 30 分間かき混ぜる
    3. 1,962 x gで 4 ° C で 20 分間遠心上澄みを別の容器に転送します。
    4. 2.1.2 手順を繰り返しますが、37 ° C ではステップ 2.1.3 続きます。0.45 μ m フィルターとし、0.2 μ m フィルターを使用して上清を滅菌します。
  2. アッセイ メディアを準備 FBS、2 mM 10 U/mL ペニシリン、L-グルタミン 10 μ G/ml ストレプトマイシンを剥奪 1% 炭を添加したメディアを使用しています。
    注: 蛍光干渉が少ないを持っているので、フェノールレッドなしメディアはお勧めします。インシュリン、成長因子などのアッセイ メディア他の追加等.は吸光度限り追加可能性があります、センサー (494 nm/521 nm) と蛍光スペクトルのピークは重複しません。
  3. 希薄細菌コラゲナーゼ酵素 I 型 10 と 1,000 μ g/mL アッセイ メディアで肯定的な制御として。

3. ゲル作製と細胞のカプセル化

  1. ヒドロゲル前駆体溶液を準備します。
    1. 次の順序で 1.5 mL チューブ、ボルテックス各コンポーネントの付加の後に試薬を追加: 20 mM 8 腕 40 kDa ペグ NB、12.75 mM MMP 分解性架橋剤ペプチド、17.8 mM NaOH、1 mM 2 mM ラップ、CRGDS、0.25 mM 蛍光の MMP 分解ペプチド。
      注意:表 1に示しますゲル前駆体ソリューション内容、ストック濃度、作業濃度ボリューム計算式と必要なボリュームを実施するのに十分なゲル前駆体溶液の 120 μ L をするために必要な10 ヒドロゲルを試してください。ピペッティングによるハイドロゲル、ソリューションの損失を考慮して、20% の総容積を増やします。商業のペプチドが備わっておりしばしば酸性塩化水素溶液。従って、水酸化ナトリウムは 7 の最終 pH を達成するために加えられます。最終的な解決の pH は、ユーザーによって確認する必要があります。
    2. 複数の 1.5 mL チューブにゲル前駆体溶液を分割対象条件ごとの 1 つの管。
      注: ゲルが細胞添加せず準備は、いくつかの制御条件が示唆されました。陰性対照の非特異蛍光センサーの劣化を考慮するハイドロゲル条件の 1 つことができます培養車両制御と実験的メディアだけで治療条件がない場合。肯定的な制御と実験間の校正では、ヒドロゲルは蛍光センサーを切断するプロテアーゼ孵化することができます。たとえば、細菌コラゲナーゼの 2 つの濃度はここで使用されました。
  2. ヒドロゲルのセルをカプセル化します。
    1. 使用しているセルの種類に応じて単一細胞懸濁液を準備します。たとえば、10 ml の PBS の A375 メラノーマ細胞の 10 センチメートルの皿を洗ってください。Trypsinize 0.05% トリプシンを用いた細胞と細胞数を決定する検定の 3 分カウント電池の CO2を 37 ° C、5% で孵化させなさい。
    2. 314 x g 3 分で細胞液を遠心分離機、培地を吸引し、約 3 倍、最高必要な播種密度実験のための PBS のセルを再度中断します。たとえば、21 x 10 の6セルの密度と細胞懸濁液は、7 × 106セル/mL の最終的なカプセル化された密度を達成するためにここで使用されました。
    3. 正確な細胞濃度のように、再びセルをカウントします。
    4. (0.25、0.5、1、2、3、4、5、6、および 7 x 106セル/mL この例で) 必要な播種密度に応じてヒドロゲル前駆体溶液の各チューブに浮遊細胞と PBS を追加します。浮遊細胞の代わりにセルがいない条件に PBS を追加します。
      注: すべての条件ではハイドロゲル成分比を確保するため同じ最終的なヒドロゲル前駆体の解決の容積を持っているし、PBS は一定。細胞内には、前駆体溶液を混合するために泡を作成せず積極的にピペットを上下するボルテックス チューブないを行います。
    5. 黒の無菌調剤中に先端を各ウェルの真ん中に中央揃えされていることを確認、下 96 ウェル プレート ラウンドにヒドロゲル前駆体溶液 10 μ L を調剤します。
    6. ヒドロゲル前駆体溶液を 3 分の 4 mW/cm2で紫外 (紫外線) 光にプレートを公開することによって重合します。
      注: UV ランプ (UVL 56 ハンドヘルド UV ランプ、UVP、アップランド、カリフォルニア州) を生成する紫外線波長の長い UV-A 光 (365 nm)、細胞の生存率には影響しません。
    7. カプセル化されたセルのない肯定的な制御条件を除いてすべての井戸にアッセイ メディアの 150 μ L を追加します。ポジティブ コントロールするコラゲナーゼ酵素液の 150 μ L を追加します。
    8. 孵卵中の蒸発を減らすためにプレートのウェルに 150 μ L の PBS を追加します。

4. MMP と代謝活性の測定

  1. 蛍光を測定すぐにポスト カプセル化ベースライン蛍光測定を確立し、ゲルの重合における均一性を確保します。蛍光マイクロ プレートを用いたプレートを読む領域と不透明の 96 ウェル プレート プロトコルを活用したリーダーは、494 nm/521 nm (励起/蛍光) で設定をスキャンします。これを読む 0 h になります。
  2. プレート 18 h の 37 ° C、5% CO2で加湿のインキュベーターで孵化させなさい。
  3. 1:10 (v/v) 各井戸のための代謝活性試薬 (レサズリン) を追加します。
  4. さらに 6 時間 37 ° C、5% CO2で加湿のインキュベーターでプレートを孵化させなさい。
    注: このインキュベーション時間は、細胞の種類に応じて異なる場合があります。
  5. 24 h 後カプセル化で蛍光を測定します。蛍光マイクロ プレートを用いたプレートを読む領域と不透明の 96 ウェル プレート プロトコルを活用したリーダーは、494 nm/521 nm (励起/蛍光) MMP 活性と代謝活性の 560 nm/590 nm (励起/蛍光) で設定をスキャンします。

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結果

現在のアッセイは、修飾と蛍光の MMP 分解センサー8以前開発と特徴づけられる三次元ハイドロゲル培養系から適応されました。ここで使用される蛍光の MMP センサーは GPLAC (pMeOBzl) ↓WARKDDK (AdOO) C ペプチッド シーケンスで構成されています (↓ は、胸の谷間のサイトを示す) ことは以前 MMP 14 と MMP 1119で胸の谷間を最適化しました。ペプチドには蛍光分子 (蛍光) と胸の谷間のサイト (図 1) の両側を癒す分子 (dabcyl) が付いています。適切なプロテアーゼを浴びる蛍光センサーの fluorophore とクエンチャを分離し、蛍光を増加させます。ここでは、アッセイは 24 ウェル プレートから小型化された 96 ウェル プレート形式にカプセル化プロセスの複数のステップを排除し、50% の実験の実行に必要な時間を短縮します。さらに、10 μ L/ウェルに 50 μ...

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ディスカッション

3 D の in vitro における細胞培養を繰り返す体内環境の多くの重要な側面です。3次元培養も評価する細胞機能になり、携帯電話の検索と多数のセルを必要と多くの生物学的アッセイ挑戦を伝達します。したがって、開発処理と 3次元培養システムの有用性を大きくさらにサンプルなし細胞機能の測定を可能にする単純な 3次元培養システム。ここで説明した 3 D システムは、様々 な異なるアプリケーションに対応が可能します。蛍光センサーのシーケンスを変更して、他のプロテアーゼを検出できます。例えば、蛍光劈開センサーと順番 (GPQG↓IWGQK)、MMP 1 は切断することができます-2、-3、-7、-8、-9、以前化学療法22に応えて黒色 MMP 活性を検出する利用されました。ペグ ハイドロゲル システムの使用は、機械的性質、分解性、ヒドロゲル内マトリックス接着部分など、細胞の微小環境の正確な独立チューニングもできます。RGD この作業で使用する接着分子フィブロネクチン由来のシーケンスは、インテグリンを介する接着。(RLD) など他の接着分子と (IKVAV) フィブリノゲンから派生してラミニンそれぞ...

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開示事項

著者が明らかに何もありません。

謝辞

著者は、キング サウド大学 (KSU)、リヤド、サウジアラビア最初の著者のスポンサーと同様、オハイオ州がん研究 (OCR)、ああ、この仕事を資金調達のため米国を認めたいと思います。蛍光ペプチド センサーの分子量は、マトリックス、支援レーザー脱離イオン化法、キャンパス化学楽器センター質量分析及びプロテオミクスから支援を受けて飛行時間 (MALDI-TOF) 質量分析法を用いて測定しました。オハイオ州立大学の施設。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
1X リン酸緩衝生理食塩水Fisher Scientific10-010-049
活性炭 Sigma-AldrichC3345
ブラック丸底 96 ウェルプレートBrand-Tech89093-600
細胞接着ペプチド (CRGDS)GenScript USA Inc.カスタムメイド
のコラゲナーゼ酵素I型 Life Technologies17100-017
デキストランSigma-AldrichD4876
DMEM 高グルコース培地Invitrogen11965118
ウシ胎児血清 (FBS) Seradigm1500-500
蛍光マイクロプレートリーダー BioTekCytation 3
血球計算盤Hausser Scientific Co.3200
L-グルタミンLife Technologies25030-081
MMP 分解性ペプチド架橋剤 (KCGPQG↓IWGQCK)ジェンスクリプトUSA株式会社カスタムメイド
NaOHフィッシャーサイエンティフィックS318500
ペニシリン/ストレプトマイシンライフテクノロジーズ15140-122
レサズリン(アラマーブルー)ライフテクノロジーズDAL1100
UVライト UVPの95-0006-02

参考文献

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