方法論記事

フローサイトメトリー法による細胞小胞細胞調節されたメディアからの解析します。

DOI：

10.3791/59128

⸱

2019年2月12日

 ,  ,  , 
1Cellular and Molecular Cardiology Laboratory, Cardiocentro Ticino Foundation, Switzerland, 2Molecular Cardiology Institute, Dept. of Cardiology, University of Zürich, 3Faculty of Biomedical Science, Università Svizzera Italiana, Switzerland

* These authors contributed equally

この記事について

サマリー

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

プロトコルでは、小さな細胞小胞 (EV) の表面の抗原を検出する細胞培養上清を使用のために設計された再現可能な方法について説明します。それは、CD63 と CD81 CD9、表面抗原を認識する抗体が結合したビーズを用いた特定の EV 免疫沈降を利用しています。メソッドは、下流の流れフローサイトメトリー分析に最適です。

要約

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フローサイトメトリー (FC) は、細胞表面抗原マーカーの半定量的測定の選択の方法です。最近、この手法は、末梢血液や他の体液でエクソソーム (Exo) を含む細胞小胞 (EV) の表現型分析に使用されています。小型 EV の周り検出しきい値を持つ専用機器の使用を義務付けて 50 ~ 100 nm。また、EV は、FC で検出できるラテックス ビーズにバインドできます。マイクロ ビーズ、EV 関連マーカー/CD81、CD9、分化 CD63 のクラスターを認識する抗体の共役を使用ことができます EV キャプチャ用。CM から分離された Exo は、超遠心法による前濃縮の有無を分析できます。このアプローチは、従来の FC の楽器を使用して EV 分析に適しています。EV 濃度の平均蛍光強度 (MFI) 値と相関を示した。超音波処理によって劇的に EV を中断することと、MFI、メソッドが膜破片を検出されませんを示すが減少しました。あらゆる研究室で簡単に実装することができます EV の表面抗原の解析の正確かつ信頼性の高い方法を報告する.

概要

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細胞は、細胞膜小胞 (EV) 機構の解明 (MV) とエクソソーム (Exo) などを含むさまざまなサイズを分泌します。後者は、サイズと起源の細胞レベル下コンパートメントによって MV から区別することがことができます。MV (サイズ 200-1,000 nm) は細胞膜からの放出に親細胞から解放されます。逆に、Exo (30-150 nm) はエンドソーム膜に属し、多胞体 (MVB) 融合細胞膜1,2と、細胞外の空間に解放されます。

EV は、ますます腫瘍、神経、循環器、筋骨格系疾患3,4,5など多くの分野での治療のツールだけでなく、潜在的に、診断バイオ マーカーとして使用します。治療薬の in vitro 培養細胞の細胞調整培 (CM) からの小胞の分離を悪用する EV を使用して進行中の研究の大半。間葉系幹細胞 (Msc) は、いくつかの文脈で有益な効果を発揮し、MSC から派生した EV は、心筋虚血・再灌流傷害6と脳損傷7のモデルの利点を示しています。MSC から派生した EV も免疫調節活動療法不応接木対ホスト病8のモデルで示されているように、免疫拒絶反応を治療するために悪用される可能性を示します。羊水幹細胞 (hAFS) 積極的に豊かに MVs と Exo、異質のサイズ (50-1,000 nm)、分散増殖分化した細胞、血管、線維化の抑制など、いくつかの生物学的効果を媒介する CM、心臓保護機4。あることを示した最近 EV、そして特に Exo、ひと心臓由来神経前駆細胞 (Exo のクリック単価) から分泌されるラット5,9心筋梗塞サイズの低減します。

Exo tetraspanins (CD63 CD81、CD9) と主要組織適合複合体などを含む、彼らの表面のタンパク質の共通セットを共有クラス I (MHC-私)。蛋白質のこの一般的なセットに加えて Exo にはもプロデューサー セル型の EV のサブセットに固有蛋白質にはが含まれています。彼らは多くの生物学的プロセス5,10を規制することにより、細胞間のコミュニケーションに重要な役割を果たすために、エキソ マーカーは重要を得ています。サイズが小さい、やりがいのある仕事の古典的な流れ cytometry (FC) のまま使用して EV を分析する簡単な方法を見つけること。

ここでは、EV 分析超遠心法による前濃縮試料、または CM (図 1) に直接適用できる FC を使用して簡略化されたプロトコルを提案する.メソッドは、追加の洗浄せず正規 Exo 関連表面抗原 (CD63、CD9、CD81) にバインドする特定の抗体をコートしたビーズを使用します。FC の分析は、測定前に調整を必要とせず、従来の cytometer を使用して実行できます。抗原流れの cytometers を使用して個々 の小さな粒子の特性評価のための方法は、さまざまなアプリケーション11,12,13に関して他のグループによって記述されています。ここでは、小さな粒子と Exo、FC によってキャプチャされた粒子の表現型解析に続いての捕獲のため機能性磁気ビーズを使用しました。このメソッドは、試験管内の任意のセル型が発表した小さな小胞の抗原組成の特性評価に使用できますが、ここで我々 ひと心臓前駆細胞 (CPC) の文化の最も適用特定細胞培養条件を提供これらの細胞によって EV の生産のための適切な環境。

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プロトコル

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1. 収集と条件付けのメディアの処理

  1. PBS で 0.02% 豚皮ゼラチンで 55 cm2ペトリ皿をコートします。
  2. 7 ml Iscove の変更ダルベッコ媒体 (IMDM) 20 補足の CPC (8,000/cm2) プレコート料理をプレート %fbs (ウシ胎児血清)、1% ペニシリン/ストレプトマイシン (P/S)。
    注:他の場所で14に記載されている「CPC」がされている人間の植派生セルを指します。CM は、特定のカルチャ条件で培養した異なったセルタイプから収集できます。手袋を着用し、生物のフードの下で動作します。
  3. 80% 合流、培養培地を削除 2 回とダルベッコ PBS (PBS) Ca と Mg フリー セルを洗い流し、エキソ生産の無血清培地 (ダルベッコ変更イーグルの中 [DMEM] 高グルコース、4.5 g/mL) 10 mL を置き換えますセルに達すればについて。
    注:無血清条件 (SF) に細胞を徐々 に適応するため、培地の血清濃度の進歩的な減少を続行します。無血清培地に敏感な細胞の FBS を含むが、EV の枯渇メディアを準備します。すべての栄養素をプラス 10%-20% (v/v) FBS 培を準備します。遠心分離機の 100,000 × g、4 ° C で一晩中この手順では、EV の FBS 由来の 100% 除去が保証されないことに注意します。
  4. 7 日後、ポリプロピレン製遠心管の CM を収集します。
    注:中程度の調節のための時間は、セルの種類に依存します。無血清培地に敏感な細胞、媒体の最初のボリュームを増加し、24-48 h CM コレクションの時間を短縮します。
  5. 3,000 x gで 4 ~ 10 ° c. で 20 分間遠心して細胞の残骸から CM を消去します。100 kDa 遠心フィルター チューブに上清を収集します。
  6. 集中は 4-10 ° C で 20 分間 2,000 x gでチューブを回すことによって CM をクリア
    注:この手順は、高速遠心分離機について少量の管の使用を許可する CM の最初のボリュームを減らすし、小さなタンパク質凝集体を除去するために貢献します。
  7. 微量遠心チューブの濃縮物を収集します。4-10 ° C で 15 分間 10,000 × gで遠心します。
  8. 上清を収集し、セクション 2 (EV 濃縮) に進みます。超遠心機が利用できない場合は、セクション 3 (ナノ粒子追跡分析 (NTA) 数量) に進みます。
    注:EV の端数の前濃縮 (代表的な結果を見ると図 4) 蛍光強度で最終的な読み出しが向上します。(ポイント 1.8) からクリア CM 4 ° C で保存できる不要になったし、1-2 日あるいは数ヶ月の −80 ° C。5 CM はエキソソーム サイズ破片が凍結融解過程に形成されていないことを確認するために-80 ° C で保管する前に細胞の残骸を削除する削除する必要があります。

2. 細胞小胞からなる超遠心機 (オプション) による濃縮

  1. ポリカーボネート厚肉遠心管にステップ 1.8 から上澄みを配置します。最大容量 (3.2 mL) に達するまでリン酸バッファー生理食塩水 (PBS) x 1 管を埋めます。
  2. チタン固定角ロータ (8 × 3.2 mL、k 係数 13) のサンプルをロードします。卓上超遠心機のローターをロードします。4-10 ° C で 3 時間 100,000 × gで遠心
  3. 上澄みを廃棄し、100 μ L の 1x PBS でペレットを再懸濁します。

3. ナノ粒子追跡分析 (国税庁) の定量化

  1. 1 × PBS の 999 μ L (どちらかステップ 2.3 1.8 から) 試料の 1 μ L を希釈します。バブル形成を回避、1 mL の注射器にサンプルをロードします。試験室の入口ポートに注射器をロードします。
  2. レーザーをオンにします。キャプチャボタンでカメラを開きます。フォーカスを調整します。
  3. 60 の少なくとも 3 の異なるフレームを記録各 s。
  4. ソフトウェアのバッチ処理オプションを使用 3 別の買収を分析します。
    注:国税庁技術が利用できない場合は、ブラッドフォードの試金によってプロテインの定量を実行 (1 x 108粒子対応遠心後の総たんぱくの 1-2 μ g、50-60 μ g 総蛋白として CM を直接定量化を行い場合EV とは異なる蛋白質の汚染物質が含まれています表 1参照)5。

4. サンプル準備

  1. キャプチャ ビーズの 3 種類のプールの準備 (CD81 や CD63 ビーズ CD9 ビーズ ビーズの 1:1:1 の比率;材料表を参照ください) と渦。
    注:プールは、1 ヶ月間安定してテストされています。1 種類のビーズをキャプチャ可能性があります使用する、ビーズのプールでない識別 EV のサブ集団の検出になります。ビーズをキャプチャ単一の抗原を用いたことは現代には CD9、CD81、CD63 などの tetraspanin タンパク質の存在を示すし、興味の抗原は蛍光抗体による検出します。代替アルデヒド硫酸ラテックス ビーズ、市販も。これらのビーズは、MV と EV の吸着の疎水性表面を提示します。
  2. 丸底チューブで 1 × 108粒子プラス 1 μ L (各テスト) の合計で 10 の5玉 × 1.2 に対応するビーズ プールの対応するボリュームの容量を追加します。
  3. 「ビーズ」と呼ばれるここのネガティブ コントロールとして使用される EV なしビーズの 1 μ l を含むチューブを準備します。
  4. 1x PBS 100 μ L にボリュームを調整します。サーモ ミキサーでチューブを置き、4-10 ° c. で一晩 400 rpm で振る
  5. 次の日は、丸底の 96 ウェル プレート (または FC 管) にサンプルを移動します。
  6. 抗体 (CD9_FITC の 10 μ G/ml、CD63_PE の 10 μ G/ml と CD81_PE の 5 μ G/ml) を追加します。
  7. 4-10 ° C で 1 時間インキュベートします。
  8. 各ウェルに 100 μ L の 1 x PBS を追加します。
  9. 取得に進んでください。

5. 取得

  1. 取得ソフトウェアを開き、楽器を起動 (の Cytometer > システム起動するプログラム)。新しい実験を開きます。
  2. 実験的テンプレートを作成し、プレートと、プレートの追加を選択します。プレートのサンプルの位置を選択し、設定としてサンプルも押します。
  3. 名前付け規則にサンプル名 (すなわち CPC #1_CD9FITC) を入力します。[チャネル] タブを開き、FITC と PE のチャンネルに切り替えます。
  4. 計測器でプレートをロードします。
  5. ドット プロットを押し、新しいドット プロット (P1) を作成します。前方の散布面積 (FSC-A セット) サイド散布周辺対 SSC A)。
  6. 初期化をレーザーと、流体を開始するを選択します。取り込みを開始する取得を押してください。
  7. P1 の途中で人口を表示するスケールを調整します。P1 で描画 (破片を除く) 全体人口のまわり「ビーズ」ゲート (図 2 a)。停止を押します。
  8. ドット プロットを押し、新しいドット プロット (P2) を作成します。FSC A. 対前方散布高さ (FSC H) を設定します。「ビーズ」の新しいドット プロットをゲートします。P2 の大きい人口のまわりの新しいゲートを描画し、名前を「シングレット」(図 2 a)。
    注:この戦略は、できるだけ多く集録および解析の手順でビーズ集計の可能な限りの包含を避けるために設計されます。
  9. ドット プロットを押し、2 つの異なるドット プロットの作成SSC の対 1 つの FITC と SSC A. 対 1 PE「シングレット」に新しいドット プロットをゲート
  10. 記録するイベント(例えば、20,000) の数を選択します。レコードを選択し、実験を開始します。

6. データの分析

  1. 解析ソフトウェアに取得ファイルを読み込みます。
    注:次の手順は、ビーズのみ、すべての未知のサンプルを含むすべてのサンプルに適用するあります。
  2. 新しいプロトコルを開き、次の手順 5 で説明した同じ戦略ドット プロットを作成します。
  3. 散布図の軸すべて線形スケールと対数スケールにすべての蛍光軸を設定します。
  4. FITC と PE のチャンネルの蛍光幾何平均 (X-Gmean-MFI) を表示します。
  5. X G サンプルの平均比率を計算/X G ビーズの意味に染まったエキソソームなし抗体。
  6. フォールドの変更を異なる EV 準備の MFI を比較します。

7. 細胞小胞数滴定

注:セクション 7 に 10、特異性抗体濃度、粒子の数を設定する実行することができますが、場合にスキップすることができますセルの種類、そこから EV が派生し、抗体は同じまま。

  1. ステップ 2.3, 1 × PBS に至る 5 x 105 2.5 × 10 の8粒子懸濁液のシリーズを取得するから得られた粒子を希釈します。
  2. 各サスペンション キャプチャ ビーズ プールの 1 μ L 丸底チューブで追加します。
  3. 4.3 のステップからプロトコルに従ってください。

8. 抗体価

注:抗体価は、各チューブの単一の抗体を追加することによって通常実行されます。

  1. (総粒子やタンパク質含量) EV の数を保つすべてのサンプルで。
    注:適切な数は、経験的、7 のセクションで上記のように決まります。
  2. 4.1 〜 4.5 の手順からプロトコルに従ってください。
  3. 製造元によって推奨量以下上記抗体濃度の範囲をテストします。たとえば、抗体テストあたり 10 μ G/ml の推奨濃度が、1、2、5、10、20、50 μ g/mL をテストします。抗体の最高濃度を追加「ビーズのみ」のサンプルがあります。
  4. 4-10 ° C で 1 時間インキュベートします。
  5. 各サンプルの 1x PBS 100 μ L を追加します。
  6. サンプルを取得します。

9. インキュベーション時間

  1. (例えば、1 h、2 h、5 h) 異なる時点で買収を行うインキュベーション時間を確認します。
  2. セクション 4 から始まるプロトコルに従ってください。
  3. 4 ~ 10 ° C で 1 時間のサンプルをインキュベートします。
  4. サンプルを取得します。
  5. 4 ~ 10 ° C で 3 時間のサンプルをインキュベートします。
  6. サンプルを取得します。

10. プロトコル検証

  1. EV バインディング
    1. 丸底チューブで 1 × 108粒子または総蛋白質の量に対応するボリュームの容量を追加します。
    2. 1x PBS 100 μ L にボリュームを調整します。
    3. EV 膜を混乱させる超音波は製造元の指示に従って (または熱衝撃手順を適用できます)。頻度と強度を設定します。超音波処理期間は設定時間経過実験経験的確立ことができます (すなわち、0 秒、30 秒、1 分、5 分、等.)。
    4. ビーズ プールの 1 μ L を追加します。
    5. 4.4、ステップからプロトコルに従ってください。
  2. 抗体の特異性
    1. 各蛍光色素標識された IgG の 1 つの管を準備し、4.6 の手順で説明するようビーズ EV の複合体を追加します。
      注:螢光色素共役アイソタイプは、使用される抗体の IgG と一致しなければなりません。

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結果

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単一の汚損のためのパーティクルの総数

以来、1 つのビードは、1 つ以上の粒子をバインドできます、MFI 曲線の初期指数段階に到達する総 EV (チューブあたり単一抗体) の最小量を設定するのにはさまざまな条件をテストしました。固定抗体濃度が 5 × 105 〜 2.5 x 10 の粒子の総数中使用された8。図 3 a抗体が許容される MFI 内で実行することを確認することができます粒子数に示すようは、1 × 108粒子/染色は EV の過剰使用を避けます。

抗体価

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ディスカッション

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従来の FC 技術のまま EV の表面に発現するタンパク質を特徴付ける最も簡単な分析法です。この点では、最も適切なプロトコルを選択する測定器の感度に起因する制限を回避することによって興味の個々 の粒子分画に関する有用な情報を取得することが重要です。Exo と下流の FC アプリケーションに適している小型 EV の表面抗原を認識する抗体が結合した磁性粒子を用いた方法について述べる。2 つの異なる細胞型を使用してメソッドを検証しました: 心臓の病気のための治療上のアプローチの Exo ベースの主要な細胞ソースとして浮上している主の人間クリック単価信頼性の高い細胞増殖と可塑性のための細胞生物学の研究で広く不死化細胞株, HEK293 細胞。

メソッドは、遠心濃縮 EV に適用することができ、高速分析のためも体外に直接細胞由来 CM なしの前濃縮遠心によって。出発原料は、サンプルを比較するときに重要です。図 4 aに示すように、蛍光強度を減少させる手順が同時に高速化、CM に直接ビーズをキャプチャを追加します。また、「キャプチャ」...

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謝辞

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法学は、ヘルムート ・ ホルテン財団、チューリッヒ (スイス) ベルックス財団の研究助成金によって支えられました。ビデオカードはぷ 【 毛皮ヘルツ und Kreislaufkrankheiten (スイス)、ルガーノ、セシリア オーガスタ財団スイスの全米科学財団の研究助成金によって支えられました。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
IMDMGibco12440061
Amicon Ultra-15, PLHK Ultracel-PL Membran, 100 kDa ミリポアUFC910024
CytoFlex, フローサイトメーター プラットフォームベックマン・コールターCytoFlex
DMEM, 高グルコース, HEPES, フェノールレッドギブコ21063045
ダルベッコのPBS(PBS) Ca-and Mg-freeロンザBE17-512F
ExoCap CD63 キャプチャキットJSR Life SciencesEx-C63-SP
ExoCap CD81 キャプチャキットJSR Life SciencesEx-C81-SP
ExoCap CD9 Capture KitJSR Life SciencesEx-C9-SP
エクソソーム枯渇 FBSサーモフィッシャーA2720801
エクソソーム枯渇 FBS 培地サプリメントSBIEXO-FBS-250A-1
FBS-Fetal Bovine SerumGibco10270106
FITC anti-human CD9 抗体バイオレジェンド312104          RRID: AB_2075894
Flow Cytometer 解析ソフトウェアベックマン・コールターKaluza
NanoSight LM10MalvernNanoSight LM10
NanoSight ソフトウェアMalvernNTA 2.3
Optima Max-XPベックマン・コールター393315
PE 抗ヒト CD63 抗体Biolegend353004          RRID:AB_10897809
PE抗ヒトCD81(TAPA-1)抗体バイオレジェンド349505          RRID:AB_10642024
ペニシリン-ストレプトマイシンGibco15140122
サーモミキサー Cエッペンドルフ5382 000 015
TLA-110ベックマン・コールターTLA-110 ローター

参考文献

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