環境試料からの担鉄細胞高スループット スクリーニング: 植物細胞、一括土壌および根圏土壌

サマリー

担鉄細胞の潜在的な地上システムで微量栄養素のバイオアベイラビリティと売り上げ高に貢献環境試料の急速なスクリーニングのためのプロトコルを提案します。

要約

シデロフォア (低分子量キレート化合物)、鉄 (Fe) を病原体競争、植物成長促進とクロス王国シグナリングの土壌物質循環に至る様々 な生態学的な現象に重要です。さらに、シデロフォアはバクテリアリーチングや金属軸受け鉱物および鉱石の風化における商業的興味あります。複雑なサンプルにシデロフォアを定量的に評価する急速なコスト効果の高い、堅牢な手段など微生物の生産する新規担鉄細胞, 担鉄細胞活動の生態学的な影響の重要な側面を識別するキー。ここで紹介した方法は、土壌や植物の組織などの環境試料中のタクトにマイクロバイ コミュニティの担鉄細胞活性を評価するために開発されました。サンプルが均質化され (Fe) なし改変 M9 培地で希釈し、集積培養 3 日間培養します。シデロフォアは、24、48、および 72 時間 (h) 新規 96 ウェル マイクロ プレート CAS (クロム クロムブルー アルキルベンゼンスルホネート) を用いたサンプルの評価された-Fe 寒天アッセイ, 担鉄細胞を評価する従来手間と時間の比色定量法の適応個々 培われた分離された細菌に対して実行されたアクティビティ。内陸部の太平洋岸北西部で栽培 PI561727 と PI561725、マドセン、Lewjain を含む 4 異なる遺伝子型/コムギ (Triticum aestivum l.) のラインに私たちの手法を適用.シデロフォアだった観察植物組織の特定の種類の小麦の遺伝子型の影響を明確に。正常に急速にシデロフォア、地球および水生生態系で重要な機能に及ぼす植物遺伝子型の画面に本手法を使いました。土壌および植物組織内で非常に信頼性の統計的な差異をもたらす多くの技術的な複製を制作しました。重要なは、結果は急速にコミュニティ イチイと機能的な遺伝子を識別するより遅い仕事のために保持することができる方法で、信頼性の高い、複雑なサンプルのシデロフォアを調べる手法を使用できます。

概要

シデロフォアは重要な生体鉄キレートのバイオアベイラビリティが幅広い微生物クォーラム センシング、微生物工場-ホストへのシグナリングに至る地球および水生生態系における追加の目的に主に関与します。植物の成長促進、協力、複雑な微生物群集^1,2内での競争。シデロフォア大別できます、アクティブ サイトと構造的特徴によると 4 つの基本的な種類を作成する: カルボン酸、hydroxamate、catecholate、タイプ^3,4を混合し、。多くの微生物が排泄の担鉄細胞⁵および複雑な社会、生物ピロールポリアミドの大半で 1 つ以上の型膜受容体も幅広いシデロフォア^{1の通風管を許可することができます。 6}。近作は、コミュニティ レベルでは、間王国通信と物質転送^{7,8,9,10 でさえ、シデロフォアが特に重要であることを示します ,11}。

クロム クロムブルー アルキルベンゼンスルホネート (CAS) は、(すなわち、シデロフォア) 配位子の添加させる媒体で容易に識別できる色の変化を作成する CA Fe 錯体の解離の可能性があるような方法で鉄 (Fe) をバインドするキレート剤として 30 年以上使用されています¹². とき、CA が Fe でバインドされている、染料がロイヤル ブルー色として表示され、CA Fe 錯体の解離、培地鉄¹³を清掃するために使用する配位子の種類によって色が変わります。Schwyn および Neilands によって 1987 年に設立初期、液状の培地は微生物のターゲット¹⁴成長の習慣の制限¹⁵と鉄以外の金属の様々 な変化に対応するための多くの方法で変更されているを含むアルミニウム、マンガン、コバルト、カドミウム ニッケル、リチウム、亜鉛¹⁶、銅¹⁷、でもヒ素¹⁸

多くの人間の病原体だけでなく植物成長促進菌 (PGPM) として識別されている担鉄細胞生産生物^3,19、20と重要な根とよくテスト エンドファイトの PGPMシデロフォア⁴正。伝統的な液体 Fe ベースのメソッドは、マイクロタイター担鉄細胞生産²¹栽培菌株のテストに適応されています。ただし、これらのテクニックは、土壌および植物システム²²シデロフォアの潜在的な規制と微生物群集 (マイクロバイ) 全体として、協力の重要性を認識に失敗します。そのため、従来の CAS アッセイ、レプリケーション、マイクロ プレートの再現性、信頼性、測定の容易さと、与えられた環境からシデロフォアの高スループット コミュニティ レベル評価を開発しました。試金。

本研究でシデロフォアを検出するためのコスト効果の高い、高スループット CA Fe アッセイは、複雑なサンプル (すなわち、土壌および植物組織ホモジネート) からシデロフォアの充実を評価するために提示されます。(どのように土壌は、ルートにバインドされた) の面で一括、弱く結び付いたと緊密にバインドされた根圏土壌粒、撮影、および 4 つの異なるコムギ (Triticum aestivum l.) の遺伝子型から根組織と共に得られた: Lewjain、マドセン、PI561725 とPI561727。小麦品種における根本的な違いが募集とコミュニティを作り出す担鉄細胞の選択の違いをされる可能性があること仮説。特別な関心のアルミニウム耐性であるALMT1 (リンゴ酸輸送体 1 の活性化アルミニウム) を持っているので、PI561725 の同質遺伝子系統に関連付けられている微生物の違いはアルミと比較します。敏感 PI561727 同質遺伝子系統、遺伝子、 almt1^23,24,25,26の非アルミ応答フォームを所有しています。研究の主な目的は、複雑なサンプルの型の今後の作業のための文化を保持しながら担鉄細胞集積培養のシデロフォアを定量的に評価する簡単で、急速な方法を開発することでした。

プロトコル

メモ: 現場の場所: ワシントン州立大学、植物病理学ファーム (46 ° 46'38.0"N 117 ° 04'57.4"W)。蒔かれた種は、2017 年 10 月 19 日に機械式のプランターを使用します。それぞれの小麦の遺伝子型が headrows、およそ 1 メートル離れてルート システムの重複を防ぐために植えられました。植物や土壌採取した 2018 年 8 月 9 日、植物が収穫の準備ができていたときに.サンプルは、4 つの小麦品種の 3 つの複製から集められた: PI561727、PI561725、マドセン、Lewjain。

1. 変更された M9 媒体の作製

1. 使用 Na₂PO₄∙7H₂O (12.8 g/200 mL)、KH₂PO₄ 0.3 g (200 mL)、塩化ナトリウム (0.5 g/200 mL)、NH₄Cl (1 g/20 mL) 試薬 M9 塩溶液を準備します。
2. 0.75 M MgSO₄∙7H₂o. を準備するのに (ddH₂O) の二重脱イオン水 100 ml MgSO₄∙7H₂O の 18 g を使用します。
3. 14.7 g CaCl₂∙2H₂O の ddH₂o. の 100 ml を追加して CaCl₂∙2H₂O の 1 M を作る
4. DdH₂O 攪拌しながら 156 mL にパイプの 6.048 g 溶解緩衝液を準備します。6.8 5 M NaOH で pH を調整します。
5. DdH₂o. の 100 mL に 20 g のブドウ糖を溶解することにより 20% グルコース (ブドウ糖一水和物) を準備します。
6. すべてのオートクレーブが、個別にソリューションとブドウ糖を準備します。フィルターは、オートクレーブ (0.22 μ m) 後 M9 媒体への付加のためのグルコース溶液を滅菌します。
7. パイプ緩衝液、M9 塩溶液 40 mL、CaCl₂·2H₂O 溶液 20 μ L の 156 mL、MgSO₄·7H₂O, 266 μ L と、バイオで一緒に 20% ブドウ糖溶液 4 mL を混合することによって変更された M9 メディアを準備します。キャビネットを使用して無菌。
8. 変更された M9 の保全のためのコンテナーのシール、4 ° C で配置や紫外線から保護するアルミ箔でカバー

2. CA Fe 寒天培地の調製

1. 酸洗 100 mM HCl/100 mM HNO₃ CAS アッセイに利用する前に 2 時間の最小値のためにすべてのガラス製品です。
2. 研究室グレード砂で満たされたアルミニウム焼成パンを準備し、アルミ箔でカバーします。30 分、脇の 121 ° c のオートクレーブ。
3. 0.0365 g を 20 mL ddH₂O に追加することによって HDTMA (臭化ヘキサデシルトリメチル アンモニウム) を準備し、可溶化を促進するために 37 ° C でソリューションを配置します。
4. 10 mM 塩酸を準備し、1 mM した FeCl₃·6H₂溶媒として 10 mM HCl を使用して O を生成します。優しく滅菌電磁攪拌棒で攪拌しながら ddH₂O の 25 mL に CAS の 0.0302 g を追加します。(暗い赤味がかった黒い色にソリューション ターン) を優しく攪拌を続けながら 1 mm した FeCl₃·6H₂O (10 mM HCl) CAS ソリューションの 25 mL から 5 mL を加えます。
5. ゆっくりと優しく攪拌、(これは暗い青色の溶液を生成) Fe CAS ソリューションにしながら HDTMA 溶液 20 mL を追加します。
6. DdH₂O、穏やかな攪拌を 375 mL にパイプの 15.12 g 溶解緩衝液を準備します。6.8 5 M NaOH で pH を調整します。水 450 mL にボリュームを追加します。寒天 5 g をソリューションに追加します。オートクレーブ パイプ バッファー CA Fe 解と解の 121 ° C、30 分で。
7. それらのそれぞれはオートクレーブ後慎重にバイオ セーフティ キャビネットにおけるパイプ バッファー全体に CA Fe ソリューションの全体を追加します。
8. 50 ° C の水浴中で混合した溶液を配置します。
   注: はたて培で CA Fe 複雑で、冷却の結果の沈殿物で 50 ° C の結果を長期的なストレージとして各試験前に CA Fe 寒天培地でのすべての試薬を準備します。
9. バイオ セーフティ キャビネットの無菌砂と 50 ° c の熱で滅菌試薬ボートを配置します。ボート、クリア、平底、滅菌の 96 ウェル マイクロ プレートの各ウェルに 100 μ L すぐに割り切れる CA Fe 寒天培地に転送します。

3. Pyoverdine/EDTA 標準準備

1. Pyoverdine 準備
   1. 800 μ M pyoverdine 標準を準備 (コハク酸、2-ヒドロキシ glutaramide と pyoverdine-の succinaminde フォームの混合物は、材料表を参照)、事前に準備された変更された M9 中。
   2. 400、200、100、50、25、12.5 にこのソリューションは、6.25 μ M ソリューションを希釈します。
2. EDTA 標準準備
   1. 追加 0.594 g ナトリウム エチレンジアミン四酢酸 (EDTA: C₁₀H₁₄N₂ナ₂O₈.2H₂O)、3200 μ M EDTA 標準を準備する事前に準備された改変 M9 培地 500 mL に。
   2. 1600 年に、このソリューションを希釈 800、400、200、100、50、25、12.5、6.25 μ M ソリューション。
3. 標準的な曲線の生成
   1. Pyoverdine と別の CA Fe 寒天培地の 100 μ L を含む 96 ウェル マイクロ プレートのウェルに EDTA の各濃度 100 μ L を追加します。各濃度の重複する技術的なレプリケーションを確認します。また、M9 のみで空白の井戸を追加 (EDTA または pyoverdine)。
   2. マイクロ プレート リーダーを使用して、測定吸光度 (で 420 nm と 665 nm) 22 ° C および標準的な曲線を生成する使用吸光度測定で 1、6、および 24 時間培養後。
      注: 420 nm の測定のため、pyoverdine や EDTA 含有井戸の吸光度からブランクの吸光度を減算します。665 の nm、pyoverdine またはブランクの吸光度から井戸を含む EDTA の吸光度を差し引きます。その後、ログ₁₀(μ M pyoverdine または EDTA) 吸光測定に対して後退の。サンプルの結果の解釈の容易さ、吸光度を x 軸として使用して、y 軸として₁₀(μ M pyoverdine または EDTA) をログオンします。

4. 環境のサンプルのコレクション: 土壌および植物組織

1. 0.22 μ m のフィルター ddH₂70% エタノール、続いて O サンプリング装置 (シャベル、はさみ) を洗浄し、クロスコンタミネーションをサンプリングする前に、生殖不能の技術を維持し、削減するためのサンプルの間にペーパー タオルで拭きます。
2. フィールドでの植物から植物組織 (穀物およびシュート) を切除し、必要な根と土壌サンプルを根こそぎに容易に十分な撮影無精ひげを残してラベル付きのプラスチック製の収納袋に配置します。
3. ルート用の小さなボール約 15 cm と 23 cm を発掘し、ラボ環境でサンプルの準備のため別のラベルが付いたビニール袋に。この手順は、マクファーソンら²⁷の方法に似ています。
4. 直接氷の上すべてのサンプル (穀物、シュート、バルク土壌と袋を別々 にルート ボール) を配置し、生産の担鉄細胞試金のためのサンプルが処理されるまで 4 ° C で維持します。
5. 別のルートでは、バルク、弱く結び付いた根圏土壌と緊密にバインドされた根圏土壌に土壌サンプルを関連付けられています。
   1. 袋のルート ボールを取り出してください。そっと鉢から土を振り払います。土壌、振り落とさ土と一緒に袋に左に「バルク」土壌が装備されています。
   2. ゴム製木槌を使用して、さらにルート ボールから土壌を削除します。これは、弱く結び付いた根圏土壌です。
   3. 緊密にバインドされたサンプルが付いている根をとり、遠心管に入れて、緊密にバインドされた根圏土壌を生成します。DdH₂O および渦の 30 mL を加えて 2-3 分のためのそれ。緊密にバインドされた根圏土壌スラリー希釈を取得するルートを削除します。

5. 担鉄細胞濃縮文化や CA Fe 担鉄細胞生産分析の準備

注: すべてのガラス製品は酸性法を開始する前に洗浄をする必要があります。

1. (3 つの土壌サンプルの型のそれぞれ) のための土壌サンプル準備
   1. サンプル袋内各土壌試料を混合し、袋を開かずに、できるだけ土を回すことによって均質化します。
      注: これは自然土壌の空間変動を減らすことができます、通常の土壌サンプリング手順と揃えられています。他の方法は、環境試料、実験的なデザインに応じて、適宜、均質化に利用されるかもしれない。
   2. 各サンプルは徹底的に混合、分注、改変 M9 培地 20 ml 各土壌の 2.0 グラムを中断後は、通気できるように滅菌泡プラグ付け滅菌 50 mL 遠心管中 20 mL の容量に 10^-3を希釈します。
   3. 緊密にバインドされた根サンプル改変の M9 培地 20 mL に根圏土壌スラリーの 2 mL を追加し、希釈 10^-3通気できるように滅菌泡プラグ付け滅菌 50 mL 遠心管中 20 mL の容量に。
2. ティッシュ サンプル (ルート、撮影および穀物) の準備
   1. 表面は、70% エタノールでサンプルを殺菌します。高を 30 秒間ミキサーを使用して変更された M9 培地 20 mL の新鮮な組織の 2.0 g を漬け込みます。滅菌 50 mL 遠心チューブにサンプルを転送し、希釈 10^-3通気できるように滅菌泡プラグ付け滅菌 50 mL 遠心管中 20 mL の容量にします。
3. 鉄制限によるシデロフォアの濃縮
   1. 50 mL 遠沈管室温で孵化させなさい、160 回転で振る。

6. CA Fe 寒天シデロフォア環境試料中の検出法

1. 24、48、および 72 時間培養を開始した後、セルをキーワードに無菌と遠心分離機を 2 mL の遠心管に 1 分の 10,000 x g で使用して濃縮チューブから 1 mL のサブサンプルを削除します。
2. 分離された上澄みを収集します。生殖不能の技術を使用して、重複した、またはマイクロ プレートの 3 通で CA Fe 寒天 100 μ L 溶液に上澄みの 100 μ L を追加します。(空白) として生殖不能の M9 媒体の 100 μ L を追加もできます。28 ° C のプレートをインキュベーションして
3. 独自の滅菌 2 mL の遠心管に残りの上清と (マイクロタイター プレートに追加されません) 各サンプル用ペレットを中断します。各サンプル清管に滅菌グリセリン 400 μ L を追加し、グリセロールを作成するペレットを再懸濁します。-80 ° C、後の分析で株を凍結します。
   注: この手順は、任意の最寄りの社内プロトコルに従ってグリセロールを生成する変更できます。
4. 6、24、48、および 72 h、420 nm の波長で吸光度を測定します。
5. Pyoverdine 同等の面でサンプルの吸光度測定解釈するのに pyoverdine または EDTA から生成される標準の曲線を使用します。
   注: Pyoverdine は、ある EDTA と比較して優れた標準と決定された (赤外線を見よ)、現在の研究で結果を解釈に EDTA を使用しなかったので。

結果

緑膿菌の fluorescensによる pyoverdine 混合物生合成が解釈し、吸光度を定量化する標準として使用された (で 420 nm) μ M の pyoverdine 同等のサンプルの図 1に示します (420 の吸光度との関係nm) と pyoverdine (μ m ログ₁₀モル) 濃度を開始します。EDTA は、サンプル展示の大きな吸光測定 pyoverdine と R²達成可能だったよりは低い (図 2) ために十分な標準を提供していません。630 担鉄細胞検出測定吸光度法として CA Fe アッセイを用いた動作初期ながら非常に同様の方法を使用して関連の研究では、nm (CA Fe 寒天は 1:1 と混合マイクロ プレートの 200 μ L 列を生成する変更された M9)、ことが観測されました。ピーク吸光度は 665 nm、420 nm でした (

ディスカッション

この作業の主な結果は、環境試料中の担鉄細胞生産/活動を定量的に測定しながら微生物を作り出す担鉄細胞の急速に豊かに使用できる新しい方法論の生産です。方法論は、簡単、迅速かつコスト効果の高いと結果は、複雑で新しいサンプルの型から担鉄細胞活動を検出するための使用方法を示す (例えば.、土壌および植物組織)。プロトコルも集積培養のグリセロールの生産の結果を簡単に時間によって DNA または RNA を介して Fe 欠乏中の微生物群集構造と機能の変化の研究に合わせて得られるベースの技術.生態学的研究における担鉄細胞活性の動態を調べることに興味がある方も可能性このメソッドから恩恵を受けます。また, (pyoverdines、環境²⁸と医学²⁹面で重要なシデロフォア) pyoverdine 同等がシデロフォアを定量的に評価するための良い方法を提供します。重要な発見はその吸光度測定 665 nm、420 で観察されたものと比較して担鉄細胞の活動を決定するための十分な nm (図 1...

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
アガロース	アペックス	LF451320014
アルミニウム ベーキングパン
アルミホイル
塩化アンモニウム、粒状	Fiesher Scientific	152315A
オートクレーブおよび滅菌器	Thermo Scientific
塩化カルシウム二水和物	Fiesher Scientific	171428
CAS (Chrome Azurol S)	Chem-Impex Int'l Inc)	000331-27168
デキストロース一水和物(グルコース)、結晶性粉末	Fiesher Scientific	1521754
EDTA、二ナトリウム塩、二水和物、Crystal	J.T.Baker	JI2476
グリセロール、無水	ベーカー分析	C22634
HDTMA (セチルトリメチルアンモモニウム)臭化物	試薬 ワールド	FZ0941
塩酸塩酸	アクロス 有機	B0756767
インフィニット M200 PRO プレートリーダー	TECAN
塩化鉄(III)六水和物、99%	アクロス 有機	A0342179
ラボラトリー ヒュームフード	サーモサイエンティフィック
ラボラトリーインキュベーター	VWR Scientific
硫酸マグネシウム	Fiesher Scientific	27855ニ
リン酸、(69-70)%	JTベー	カー72287
パイプ緩衝液、98.5%	ACROS有機	A0338723
リン酸カリウム、ジベイスク、粉末	JTベー	カーJ48594
オバージン	SIGMA-ALDRICH	078M4094V
砂
SI-600R シェーカー	ラボ コンパニオン
塩化ナトリウム、粒状	Fiesher Scientific	136539
水酸化ナトリウム、ペレット	J.T.Baker	G48K53
リン酸ナトリウム、二塩基性七水和物、99%	ACROS 有機	A0371705