担鉄細胞の潜在的な地上システムで微量栄養素のバイオアベイラビリティと売り上げ高に貢献環境試料の急速なスクリーニングのためのプロトコルを提案します。
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方法論記事
環境試料からの担鉄細胞高スループット スクリーニング: 植物細胞、一括土壌および根圏土壌
* These authors contributed equally
この記事について
サマリー
要約
シデロフォア (低分子量キレート化合物)、鉄 (Fe) を病原体競争、植物成長促進とクロス王国シグナリングの土壌物質循環に至る様々 な生態学的な現象に重要です。さらに、シデロフォアはバクテリアリーチングや金属軸受け鉱物および鉱石の風化における商業的興味あります。複雑なサンプルにシデロフォアを定量的に評価する急速なコスト効果の高い、堅牢な手段など微生物の生産する新規担鉄細胞, 担鉄細胞活動の生態学的な影響の重要な側面を識別するキー。ここで紹介した方法は、土壌や植物の組織などの環境試料中のタクトにマイクロバイ コミュニティの担鉄細胞活性を評価するために開発されました。サンプルが均質化され (Fe) なし改変 M9 培地で希釈し、集積培養 3 日間培養します。シデロフォアは、24、48、および 72 時間 (h) 新規 96 ウェル マイクロ プレート CAS (クロム クロムブルー アルキルベンゼンスルホネート) を用いたサンプルの評価された-Fe 寒天アッセイ, 担鉄細胞を評価する従来手間と時間の比色定量法の適応個々 培われた分離された細菌に対して実行されたアクティビティ。内陸部の太平洋岸北西部で栽培 PI561727 と PI561725、マドセン、Lewjain を含む 4 異なる遺伝子型/コムギ (Triticum aestivum l.) のラインに私たちの手法を適用.シデロフォアだった観察植物組織の特定の種類の小麦の遺伝子型の影響を明確に。正常に急速にシデロフォア、地球および水生生態系で重要な機能に及ぼす植物遺伝子型の画面に本手法を使いました。土壌および植物組織内で非常に信頼性の統計的な差異をもたらす多くの技術的な複製を制作しました。重要なは、結果は急速にコミュニティ イチイと機能的な遺伝子を識別するより遅い仕事のために保持することができる方法で、信頼性の高い、複雑なサンプルのシデロフォアを調べる手法を使用できます。
概要
シデロフォアは重要な生体鉄キレートのバイオアベイラビリティが幅広い微生物クォーラム センシング、微生物工場-ホストへのシグナリングに至る地球および水生生態系における追加の目的に主に関与します。植物の成長促進、協力、複雑な微生物群集1,2内での競争。シデロフォア大別できます、アクティブ サイトと構造的特徴によると 4 つの基本的な種類を作成する: カルボン酸、hydroxamate、catecholate、タイプ3,4を混合し、。多くの微生物が排泄の担鉄細胞5および複雑な社会、生物ピロールポリアミドの大半で 1 つ以上の型膜受容体も幅広いシデロフォア1の通風管を許可することができます。 6。近作は、コミュニティ レベルでは、間王国通信と物質転送7,8,9,10 でさえ、シデロフォアが特に重要である....
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プロトコル
メモ: 現場の場所: ワシントン州立大学、植物病理学ファーム (46 ° 46'38.0"N 117 ° 04'57.4"W)。蒔かれた種は、2017 年 10 月 19 日に機械式のプランターを使用します。それぞれの小麦の遺伝子型が headrows、およそ 1 メートル離れてルート システムの重複を防ぐために植えられました。植物や土壌採取した 2018 年 8 月 9 日、植物が収穫の準備ができていたときに.サンプルは、4 つの小麦品種の 3 つの複製から集められた: PI561727、PI561725、マドセン、Lewjain。
1. 変更された M9 媒体の作製
- 使用 Na2PO4∙7H2O (12.8 g/200 mL)、KH2PO4 0.3 g (200 mL)、塩化ナトリウム (0.5 g/200 mL)、NH4Cl (1 g/20 mL) 試薬 M9 塩溶液を準備します。
- 0.75 M MgSO4∙7H2o. を準備するのに (ddH2O) の二重脱イオン水 100 ml MgSO4∙7H2O の 18 g を使用します。
- 14.7 g CaCl2
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結果
緑膿菌の fluorescensによる pyoverdine 混合物生合成が解釈し、吸光度を定量化する標準として使用された (で 420 nm) μ M の pyoverdine 同等のサンプルの図 1に示します (420 の吸光度との関係nm) と pyoverdine (μ m ログ10モル) 濃度を開始します。EDTA は、サンプル展示の大きな吸光測定 pyoverdine と R2達成可能だったよりは低い (図 2) ために十分な標準を提供していません。630 担鉄細胞検出測定吸光度法として CA Fe アッセイを用いた動作初期ながら非常に同様の方法を使用して関連の研究では、nm (CA Fe 寒天は 1:1 と混合マイクロ プレートの 200 μ L 列を生成する変更された M9)、ことが観測されました。ピーク吸光度は 665 nm、420 nm でした (
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ディスカッション
この作業の主な結果は、環境試料中の担鉄細胞生産/活動を定量的に測定しながら微生物を作り出す担鉄細胞の急速に豊かに使用できる新しい方法論の生産です。方法論は、簡単、迅速かつコスト効果の高いと結果は、複雑で新しいサンプルの型から担鉄細胞活動を検出するための使用方法を示す (例えば.、土壌および植物組織)。プロトコルも集積培養のグリセロールの生産の結果を簡単に時間によって DNA または RNA を介して Fe 欠乏中の微生物群集構造と機能の変化の研究に合わせて得られるベースの技術.生態学的研究における担鉄細胞活性の動態を調べることに興味がある方も可能性このメソッドから恩恵を受けます。また, (pyoverdines、環境28と医学29面で重要なシデロフォア) pyoverdine 同等がシデロフォアを定量的に評価するための良い方法を提供します。重要な発見はその吸光度測定 665 nm、420 で観察されたものと比較して担鉄細胞の活動を決定するための十分な nm (図 1.......
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開示事項
著者はある利益相反を開示します。
謝辞
著者は、検査手順、リー ・ オプダール小麦品種を収穫するため、ワシントン州コンコード種ブドウ研究評議会は、農業の維持のためワシントン州立大学センターの支援のため Kalyani Muhunthan を感謝したいとこの作業をサポートするを BIOAg のために天然資源を付与します。追加資金は米国農務省/NIFA ハッチ プロジェクト 1014527 によって提供されました。
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材料
| 名前 | 会社 | カタログ番号 | コメント |
|---|---|---|---|
| アガロース | アペックス | LF451320014 | |
| アルミニウム ベーキングパン | |||
| アルミホイル | |||
| 塩化アンモニウム、粒状 | Fiesher Scientific | 152315A | |
| オートクレーブおよび滅菌器 | Thermo Scientific | ||
| 塩化カルシウム二水和物 | Fiesher Scientific | 171428 | |
| CAS (Chrome Azurol S) | Chem-Impex Int'l Inc) | 000331-27168 | |
| デキストロース一水和物(グルコース)、結晶性粉末 | Fiesher Scientific | 1521754 | |
| EDTA、二ナトリウム塩、二水和物、Crystal | J.T.Baker | JI2476 | |
| グリセロール、無水 | ベーカー分析 | C22634 | |
| HDTMA (セチルトリメチルアンモモニウム)臭化物 | 試薬 ワールド | FZ0941 | |
| 塩酸塩酸 | アクロス 有機 | B0756767 | |
| インフィニット M200 PRO プレートリーダー | TECAN | ||
| 塩化鉄(III)六水和物、99% | アクロス 有機 | A0342179 | |
| ラボラトリー ヒュームフード | サーモサイエンティフィック | ||
| ラボラトリーインキュベーター | VWR Scientific | ||
| 硫酸マグネシウム | Fiesher Scientific | 27855ニ | |
| リン酸、(69-70)% | JTベー | カー72287 | |
| パイプ緩衝液、98.5% | ACROS有機 | A0338723 | |
| リン酸カリウム、ジベイスク、粉末 | JTベー | カーJ48594 | |
| オバージン | SIGMA-ALDRICH | 078M4094V | |
| 砂 | |||
| SI-600R シェーカー | ラボ コンパニオン | ||
| 塩化ナトリウム、粒状 | Fiesher Scientific | 136539 | |
| 水酸化ナトリウム、ペレット | J.T.Baker | G48K53 | |
| リン酸ナトリウム、二塩基性七水和物、99% | ACROS 有機 | A0371705 |
参考文献
- Butaite, E., Baumgartner, M., Wyder, S., Kummerli, R. Siderophore cheating and cheating resistance shape competition for iron in soil and freshwater Pseudomonas communities. Nature Communications. 8, (2017).
- Ghirardi, S., et al.
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再版と許可
